植物叶片中DNA的提取.ppt

植物叶片DNA的提取DNAextraction,实验一,实验原理,利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中,可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部,从而达到提取的目的。在提取过程中,染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓,以保证得到较长的DNA。一般来说,构建基因组文库,初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析,DNA长度可短至50kb，在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下)，并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同;不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法，以获得可用的DNA大分子，尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用，因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时，应考虑除去多糖和酚类物质。,实验材料和试剂,实验材料：植物幼嫩叶子。实验所需试剂：,提取缓冲液：100mmol/LTrisCl(pH8.0),20mmol/LEDTA,500mmol/LNaCl,1.5%SDS2.80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇3.RnaseA母液其它试剂：液氮、异丙醇、TE缓冲液，无水乙醇、70%乙醇、3mol/LNaAc。,实验仪器,离心机,各种型号的微量移液枪,研钵,不同型号的eppendorf管,实验步骤：水稻幼苗或叶片0.1-0.2g,剪碎,置研钵中，加入1mL提取缓冲液，研磨成浆；2.吸入1.5mLEP管中，剧烈摇动混匀；3.60水浴保温30-60min，不时颠倒混匀；4.室温下10000rpm离心5min；5.小心吸上清于新的离心管中，加入等体积氯仿，剧烈震动；6.室温下10000rpm离心5min；7.小心将上清吸入新的离心管中；8.加入1倍体积异丙醇，室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。8000rpm离心5min，弃掉上清；75酒精洗一次，晾干沉淀；10.加入5LRNaseA（10g/L）,3710min,除去RNA。11.加50-100l水融解，-20贮存。,1.植物叶子0.1-0.2g,剪碎置预冷研钵中,加入1mL提取缓冲液，研磨成浆,2.吸入1.5mLeppendorf管中，摇动混匀,3.60水浴保温30-60min,4.10000rpm离心5min,5.吸上清于新的离心管中，加入等体积氯仿，颠倒混匀,6.再次10000rpm离心5min；将上清小心吸入新的离心管中；,7.加入1倍体积异丙醇，-20放置10min，出现絮状DNA沉淀；随后8000rpm离心5min，弃掉上清；75酒精洗沉淀一次晾干沉淀；加5LRNaseA(10g/L),3710min,除去RNA；加50-100L的TEBuffer，取1-5L电泳检测；其余-20贮存备用。,DNA样品在0.7%Agarose胶上电泳（例图）,实验注意事项,微量移液枪的使用一定要规范，吸取氯仿等有机试剂要注意不要将试剂吸入枪中；提取过程中的机械力可能使大分子DNA断裂成小片段，