新霉素检测方法.doc

乐山市瑞和祥动物保健药业有限公司 技术部电话传真硫酸新霉素在饲料中检测方法探讨硫酸新霉素作为饲料中用于肠道疾病防治的药物是现在可添加药物中有效及安全的产品，对于是否可在饲料中检测出来的问题，我们从硫酸新霉素定性及定量的分析方法上进行分析及试验，具体说明如下：一、硫酸新霉素的定性检测：1、硫酸新霉素原料和预混剂的定性检测方法采用了是化学反应显色法、薄层色谱法、红外色谱法及硫酸盐反应法（见附1）。这些方法只能初步定性是否有硫酸新霉素的结构，只有单一成分时采用，作为鉴别的方法。而饲料中的成分很多，将干扰鉴别反应，我公司曾经使用加有新霉素的饲料进行过以下方法的鉴别，无法达到确定的效果。2、饲料中硫酸新霉素的定性分析：尚未有可行的办法2007年饲料添加剂使用要览添加剂的定性和定量检测二、硫酸新霉素的定量检测1、微生物法：参见中华人民共和国兽药典2010年版一部新霉素及新霉素可溶性粉的检测方法。1）该方法只针对硫酸新霉素原料、预混剂或可溶性粉，并且要已知浓度，在规范内估计含量才能准确测定。2）对于添加于饲料中的新霉素，由于药物含量低，不能达到该方法规定的检测浓度下限，检测灵敏度低。3）由于新霉素微生物检测方法中采用的标准菌株为金黄色葡萄球菌，而饲料中常用的药物添加剂多数对金黄色葡萄球菌有抗菌作用，直接使用该方法对饲料进行检测，其他药物对检测结果有干扰，因此不能以此判定饲料中是否含有硫酸新霉素。2、 高压液相法：目前国内还没有“饲料中硫酸新霉素的检测方法”；且据国内饲料公司部分技术经理反应：中国药检所及多家省药监所都没有该检测方法（见中国畜牧人论坛/thread-231385-1-1.html），也没有配备相关的检测仪器。如参考肉及肉制品中新霉素的检测方法（见附2），可知：1）硫酸新霉素基本上没有紫外的吸收，国内多数药监所高压液相配备的是紫外检测器，直接用于检测饲料中的新霉素，不会显示结果。2）新霉素可用的检测器是电化学检测器或荧光检测器，但该检测器的价格昂贵，能配备该检测器的一般只有原料生产厂。3）该方法的处理程序复杂，所需配备处理设备也很多且专属性很强，操作复杂困难。三、小结：1、国内的法规和检测方法还有欠缺，在兽药典及饲料添加剂检测方法上还没有制定“饲料中硫酸新霉素的检测方法”，目前的检测方法只能针对肉及肉制品进行检测。2、 由于饲料中的组分复杂，对新霉素进行定性和定量检测都无可行办法，只能对新霉素原料或制剂进行定性和定量检查。3、 据目前所知，国内药检所的试验方法和设备还不能判定对饲料中是否含有酸新霉素，主要是因为缺少相关方法和检测设备。 基于以上几点，饲料中添加新霉素产品后一般不易检测，饲料公司可放心使用。附1：硫酸新霉素原料的定性检测方法中华人民共和国兽药典2010年版一部1）取本品约10mg，加水1ml溶解后，加盐酸溶液（9100）2ml，在水浴中加热10分钟，加8%氢氧化钠溶液2ml与2%乙酰丙酮水溶液1ml，置水浴中加热5分钟，冷却后，加对二甲氨基苯甲醛试液1ml，即显樱桃红色。2）取本品与新霉素标准品适量，分别加水溶解并稀释制成每1ml中约含20mg的溶液，作为供试品溶液和标准品溶液；取新霉胺对照品适量，用供试品溶液溶解并稀释制成每1ml中含0.4g的溶液，作为混合溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各1l，分别点于同一硅胶H薄层板（硅胶H1.5g，用0.25%羧甲基纤维素钠溶液6ml调浆制板）上，以甲醇-乙酸乙酯-丙酮-8.8%醋酸铵溶液（25:15:10:40）为展开剂，展开，晾干，在110干燥20分钟，趁热喷以10%次氯酸钠溶液，将薄层板置于通风处冷却片刻，再喷碘化钾淀粉溶液（0.5%淀粉溶液100ml中含碘化钾0.5g），立即检视。混合溶液应显三个清晰分析的斑点，供试品溶液所显主斑点的位置和颜色应与标准品溶液的主斑点的位置和颜色相同。3）本品的红外光吸收图谱应与对照的图谱一致。4）本品的水溶液显硫酸盐的鉴别反应。附2：肉及肉制品中新霉素残留检验的高效液相色谱测定方法 (1)试剂和材料 除特殊规定外，所用试剂均为分析纯 乙腈 甲醇：紫外光谱纯 三乙胺 磷酸(85) 氯化钠 磷酸盐缓冲液 混合提取液：磷酸盐缓冲液乙腈(1+)。 硼酸钾缓冲液：将25z硼酸溶于80mi水中，用50g100ml氢氧化钾溶液调pH至lO.5，用水定容至100ml。 邻苯二甲醛试剂：将100mg邻苯二甲醛溶于1ml甲醇中，加入200ul 2巯基乙醇和10ml硼酸钾缓冲液，用棕色瓶(有盖)贮存于冰箱中，1周内有效。 碱性缓冲液：将76e四硼酸钾溶于400mi水中，用50g100ml氢氧化钾溶液调pH至11.0，用水定容至500mi。 洗脱剂：碱性缓冲液甲醇(1+4)。 阳离子交换树脂；D152。 硫酸新霉素标准品：生化试剂 硫酸新霉素标准溶液：称取适量的硫酸新霉素标准品(精确至0.lmg)，用水配成浓度为0.100rugml的标准贮备溶液，根据需要再用水配成适当浓度的标准工作溶液。 新霉素衍生物标准溶液：将适量的标准工作溶液注入到阳离子交换柱中，进行衍生化反应，制成新霉素衍生物标准溶液， (2)仪器和设备 液相色谱仪：配有荧光检测器 高速组织捣碎机 振荡器 离心机 过滤漏斗；滤孔为80-120um、4080um 阳离子交换柱：120mmX 5mm(内径)玻璃柱。用碱性缓冲液将阳离子交换树脂制成悬浮液，平衡2h，装入玻璃柱中，高度约为6cra，用5ml洗脱剂淋洗，流速为08mlmin，然后用水洗至流出液呈中性，备用。 (3)测定步骤 提取 称取试样约l0g(准确至01g)于一lOOml锥形瓶中，加人60ral混合提取液和2g氯化钠，振荡30min，经滤孔为80120m的过滤漏斗抽滤，残渣用3x10ml混合提取液洗涤。合并滤液和洗液于一250rnl烧杯中。在沸水中加热30min，取下，于3000rmin离心20min，置4冰箱中冷却20min，然后经滤孔为4080bm的过滤漏斗抽滤，收集滤液。 衍生化 将滤液注入阳离子交换柱中，用lOml水洗柱，弃去流出液。将lml邻苯二甲醛试剂注入柱中，反应5rain。然后加2ml洗脱剂洗脱柱上衍生物。弃去前面iml洗脱液，收集后面lml洗脱液，立即放置在一180冰箱中，15min后进行液相色谱测定。 测定 a.色谱条件 色谱柱：ODSHypersi 柱温：35C： 流动相：775甲醇水溶液中含009molL 三乙胺和o45moIL磷酸 流速：10mlIllin 激发波长：345nm 发射波长：445nm 进样量：10ul b测定 根据样液中新霉素含量情况，选定峰面积相近的新霉素衍生物标准溶液。标准液和样液中新霉素衍生物响应值均应在仪器检测线性