中药制剂的含量测定.ppt

第四章中药制剂的含量测定本章重点：1、掌握中药制剂含量测定的样品前处理方法及测定方法的效能指标。2、掌握可见-紫外分光光度法、薄层扫描法、高效液相色谱法和气相色谱法在中药制剂分析中的应用。3、了解荧光分析法和原子吸收分光光度法在中药制剂分析中的应用。,含量测定：是中药制剂质量控制的重要指标。含量测定目的：通过研究制剂中某种成分的含量高低来判定药物的优劣，保证临床用药的安全、有效。含量测定对象：有效成分、指标成分、毒性成分、贵重药材成分。,中药制剂与化学药品含量测定的区别：1、对象不同：化学药品成分明确组成单一；中药制剂组成及成分复杂。2、供试品溶液制备不同：化学药品方法简单；中药制剂方法繁琐，大多需要净化分离。3、待测成分确定不同：化学药品待测成分明确，多为主要成分；中药制剂需先根据中医药理论选定药味，再综合考虑各方面因素选定待测成分。含量测定的步骤：药味的选定、测定成分的选定、测定方法及条件的选定、方法学考察。,第一节含量测定样品的处理样品处理的作用：充分释放被测成分除杂纯化富集浓缩或衍生化，以测定低含量被测成分所用溶剂符合测定要求一、样品的粉碎:样品粉碎的目的：保证所取样品均匀且有代表性较快且完全地提取被测成分粉碎设备：粉碎机、研钵、食品处理机等生物组织样品用高速匀浆机或玻璃匀浆器。,粉碎的注意事项：粉碎度按实际情况进行，不可太粗或太细。太粗影响提取效果，太细一方面造成粘性成分附着，妨碍进一步提取，另一方面造成过滤困难。避免由于设备的磨损或不干净等原因而污染样品。防止粉尘飞散或挥发性成分损失。不能丢弃不宜粉碎的大颗粒物质，要反复粉碎后使其全部过筛网。,二、样品的提取：常见提取方法：冷浸法、回流提取法、连续回流提取法、超声波提取法、超临界流体萃取法。冷浸法：浸泡后溶液的两种测定方法。部分测定法（等量法）：浸泡后的溶液过滤，精密量取与一定重量的样品相当的滤液进行测定。（此法不适合挥发性较大的提取溶剂）全部测定法（总量测定法）：浸泡后的溶液过滤，滤渣充分用溶剂洗涤至提取完全，合并滤液及洗液，浓缩或蒸干，残留物用另一溶剂溶解，定量转入量瓶中，稀释至刻度，摇匀，进行测定。（此法克服了部分测定法的缺陷，且提取溶剂不必精密加入）,三、样品的分离净化：常见净化方法：沉淀法、蒸馏法、液-液萃取法、色谱法、固相微萃取法、消化法。沉淀法：利用某些试剂与被测成分或杂质生成沉淀，分离沉淀或保留溶液的精制方法。注意事项：过量试剂若干扰被测组分的测定，应设法除去。大量杂质以沉淀形式除去时，被测成分应不能产生共沉淀而损失。被测成分生成沉淀时，其沉淀经分离后可重新溶解或直接用重量法测定。,蒸馏法：利用某些被测成分具有挥发性，采用蒸馏法，收集馏出液进行含量测定；或某些成分经蒸馏分解成挥发性成分，利用分解产物（要求结构明确）进行测定。注意事项：最常用水蒸气蒸馏法。适用于挥发油，小分子生物碱的分离。优化：蒸馏液中加入一定量无机盐（盐析作用），使挥发性成分更完全地蒸馏出来。,液一液萃取法：1、直接萃取法：利用被测成分与干扰成分在有机溶剂（萃取剂）中的溶解度不同，通过多次萃取达到分离净化的目的。萃取次数：实验考察（符合样品回收率的要求）溶剂的选择：根据被测组分疏水性的相对强弱选择极性适当的溶剂。水相pH的控制：对弱酸性成分pHpKa-2对弱碱性成分pHpKa+2(此处为其共轭酸的pKa)盐析作用：水相用NaCl饱和，提高提取率。,2、离子对萃取法：在适当pH介质中，某些有机酸、有机碱形成的离子与带相反电荷的离子定量的结合成为弱极性的离子对，而易溶于有机溶剂，使之萃取分离。适用于高度离解的有机酸、有机碱的萃取（不能用直接萃取法）。中药制剂分析主要用于生物碱（B）的分离。离子对试剂：常为酸性染料（In-）如：溴百里酚蓝（BTB）和溴甲酚绿（BCG）注意：水相pH值的控制离子对试剂的选择,色谱法：分类：1、按分离原理分类：吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱2、按操作方式分类：柱色谱、薄层色谱、纸色谱3、按装柱方法分类：湿法装柱、干法装柱方法：分离时常用柱色谱法。将样品溶液加到装有合适固定相的色谱柱中.或者将被测成分保留于柱上，洗去杂质后，再洗脱被测成分进行测定;或者使杂质强烈保留于柱上，直接洗脱被测成分进行测定。适用于：最适合总类成分的含量测定。,1、氧化铝：用于生物碱、苷类等碱性、中性成分的测定，吸附酸性成分.硅胶：适合于分离中性或酸性化合物，强烈保留碱性化合物。2、键合相硅胶：十八烷基键合相硅胶（C18，ODS）、C8（反向色谱）分离脂溶性成分苯基、氰基键合相硅胶（正向色谱）分离水溶性成分,3、大孔树脂：分为极性和非极性型，D101最常用。4、聚酰胺：与溶质形成氢键而产生吸附作用，常用于含酚、酸、醌类、黄酮类药物样品液的净化分离。5、硅藻土、纤维素：亲水型填料，原理为分配作用流动相：与水不混溶的有机溶剂洗脱：亲脂性的成分6、离子交换树脂：用于除去样品中的离子或萃取可离解化合物(弱酸、弱碱药物)。,第二节含量测定方法的验证方法验证：又称效能指标，是方法学论证的重要指标，也是药品质量标准中方法学考察的主要内容。含量测定方法学考察的目的：是证明采用的分析方法是否适合于相应的检测要求。在建立中药质量标准时，方法验证的过程和结果均应记载在药品质量标准起草说明中。验证的内容：准确度、精密度（包括重复性、中间精密度和重现性）、专属性、线性、范围和耐用性。,一、准确度：系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般以回收率（%）表示。中药制剂分析常用加样回收率来考查。准确度应在规定范围内测试。（一）含量测定的准确度：用已知纯度的对照品做加样回收测定，即已知被测成分含量的供试品中再精密加入一定量的已知纯度的被测成分对照品进行测定，得总量（C）。加样回收率(%)=（CA）B100%，n5A为供试品加样前被测成分含量，C加样后实测总量，B为加入对照品量,n为实验次数。,（二）数据要求：加样回收率试验中，加入对照品后，亦应在规定的标准曲线线性范围内。加样回收率试验至少做五次。常用测定方法有两个：取同一浓度的供试品6份，分别加入等量的对照品，做六次平行试验，用6个测定结果进行评价，对照品加入量与所取的供试品被测成分含量控制在1：1左右。取同一浓度的供试品9份，每三份加入等量的对照品一定量，制成有3个不同浓度，每个浓度有3份的供试品溶液进行测定，用9个测定结果进行评价。一般中间浓度溶液的对照品加入量与所取的供试品被测成分含量控制在1：1左右为宜。中药制剂含量测定所得的单份供试品回收率及所有供试品平均回收率均在95%105%之间，特殊操作繁复的可略低（但不可小于90%或大于110%）。回收率的RSD不大于3%（RSD=S/X平均100%）。,加样回收率试验举例：取已知含量的样品6份，每份约0.05g，每份含有效成分黄芩苷4.79%，精密称定，置25mL量瓶中，分别精密加入黄芩苷标准品贮备溶液5.0mL（0.3884mg/ml），按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，用高效液相色谱仪检测，进样10L，测定并计算回收率，结果表明该方法准确度好。,黄芩苷加样回收试验结果,二、精密度：系指在规定的测定条件下，同一个均匀样品，经过多次取样测定所得的结果之间的接近程度。(一)精密度表示方法：1、偏差（d）:单项测定值与平均值的差值2、标准偏差：S=3、相对标准偏差：RSD（%）=S/X平均100%（最常用）(二)重复性、中间精密度及重现性,(二)重复性、中间精密度及重现性：1.重复性：在相同的条件下，由一个分析人员测定所得结果的精密度称为重复性。测定方法为在规定的范围内，取同一浓度的供试品，用6个测定结果进行评价（六点测定）；或设计3个不同浓度，每个浓度各分别制备3份供试品溶液进行测定，用9个测定结果进行评价（九点测定）。毕业论文水平的实验只做到重复性即可。2中间精密度：同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果的精密度，称为中间精密度。测定方法同前重复性实验，为考察随机变动因素对精密度的影响，申报新药做到中间精密度。3重现性：在不同实验室由不同分析人员测定结果的精密度，称为重现性。测定方法同前重复性实验，当分析方法将被法定标准采用时（如建立药典分析方法），应进行重现性实验。(三)数据要求：常用RSD表示，应不大于3%。,重复性试验举例：精取六份五味子浸膏，每份168mg，按供试品溶液的制备方法制备六份液相供试品溶液,按高效液相色谱条件进样测定,每份进10l,记录峰面积，计算五味子醇甲含量(mg/g)，结果见下表，表明该方法重复性良好。,重复性测定数据表,三、专属性：又叫选择性，系指在其他成分（如杂质、辅料等）可能存在下，采用的方法能正确测定出被测成分的特性。考察的是分析方法对被测成分是否有准确而专属的测定能力。考察方法常用阴性对照法，即以被测成分与除去该成分或除去该药材的成药进行对照，考察被测成分的测定是否受到干扰组分的影响。如用色谱法、光谱法等应附代表性谱图，例子见书P72.,四、线性：系指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度或质量直接呈正比关系的程度。（一）测定方法：为在规定的范围内制备至少6个浓度的样品，以测得的响应信号作为被测物浓度或质量的函数作图，观察是否呈线性。必要时，响应信号可经数学转换，再进行线性回归计算。（二）数据要求：应列出回归方程，相关系数（r）和线性图。相关系数一般要求r0.999，在TLCS定量中要求r0.995。,线性关系举例：标准曲线的制备：精密量取五味子乙素对照品溶液（0.208mg/ml）0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4ml，分别置具塞试管中，蒸干，各精密加10变色酸溶液1ml，加硫酸溶液(水1份，浓硫酸2份)9ml，摇匀，置水浴上加热30分钟，放冷，用分光光度仪在570nm波长处测定吸收度，绘制标准曲线，结果如下表（结果表明，在绘制标准曲线的浓度范围内4.1629.12g/ml线性关系良好）。,五味子乙素标准曲线数据表,五、范围：范围是指能到达一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。如上例，线性范围为：4.1629.12g/ml六、耐用性：系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为使方法用于常规检验提供依据。典型的变动因素有：被测溶液的稳定性，样品提取次数、时间等。耐用性试验举例（变动的为时间）：精取五味子浸膏175.3g，按供试品溶液的制备方法制备一份液相供试品溶液,室温放置24小时,分别在0、2、4、8、12、24小时按HPLC色谱条件进样测定,每次10l,记录峰面积，计算五味子醇甲含量(mg/g)，结果见下表。,耐用性测定数据表,从上表可见，六个样相对标准偏差1.99%，小于3%。说明用此测定方法测定样品中被测成分含量,在24小时内稳定，因此本测定方法对时间有一定耐用性。,1、评价中药制剂含量测定方法的回收试验结果时，一般要求（）A.回收率在85115、RSD5（n5）B.回收率在95105、RSD3（n5）C.回收率在80100、RSD10（n9）D.回收率80、RSD5（n5）E.回收率在99101、RSD0.2（n3）2、下列关于分析方法效能指标的概念描述正确的有()(多选)A.在大多数情况下我们研究分析方法的精密度是指重现性.B.被法定标准采用的分析方法是进行过重现性试验的.C.选择性是指在样品中有其他组分共存时，该分析方法对被测物准确而专属的测定能力.D.耐用性是指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受能力.E.准确度实验常用9点测定法.,第三节常用定量分析方法常用测定方法：化学分析法光谱法（UV-Vis等）色谱法（HPLC、GC、TLCS等）,一、化学分析法：1、包括重量分析法和滴定分析法.2、适用范围：主要用于测定制剂中含量较高的一些有机成分及含矿物药制剂中的无机成分。如：总生物碱类、总酸类、总皂苷及矿物药成分3、特点：所用仪器简单。但有一定的局限性，灵敏度低，操作繁琐、耗时长，专属性不高，不适宜微量成分测定。4、仪器：重量分析常用仪器：分析天平、称瓶、干燥器、滤器（滤纸、垂熔玻璃漏斗）；滴定分析常用仪器：滴定管、容量瓶、移液管。,（一）重量分析法：包括挥发法、萃取法、沉淀法。挥发法：测定具有挥发性或能定量转化为挥发性物质的组分含量。如：干燥失重、水分测定总灰分及炽灼残渣的测定萃取法：根据被测组分在互不相溶的两相中溶解度的不同，达到分离的目的。适用：总皂苷、总有机酸、总生物碱如：冰硼散中冰片的含量测定、地奥心血康胶囊中甾体总皂苷含量测定、昆明山海棠片中总生物碱的含量测定、甘草浸膏中甘草酸的含量测定。沉淀法：将被测组分定量转化为难溶化合物，测定其含量。适用于：制剂中纯度较高的成分。如：西瓜霜润喉片中西瓜霜的含量测定苦参片中苦参总碱的含量测定复方元胡注射液总碱的测定,（二）滴定分析法：是容量分析法。适用：常量组分的分析.特点：操作简便、快速，结果准确,一般相对误差TCD），死体积小，线性范围宽，但易破坏样品。载气多用N2。（3）氮-磷检测器（NPD):专属性检测器，可用于中药及其制剂中农药残留量的检测。（4）电子捕捉检测器（ECD）：专属性检测器，适用于痕量电负性有机物，如含卤素、硫、氧等化合物的分析。电负性越强,检测器灵敏度越高.,（七）定量分析方法：常用的定量方法有内标法、外标法、归一化法和标准溶液加入法，以峰高或峰面积定量(常用).首先讲两个概念:峰面积的测量：目前常用气相色谱仪均有色谱工作站，可直接给出A，h，W1/2。,校正因子的测定：前提是同一物质用同一检测器检测,物质的m或CA.(1)绝对校正因子的测定:,(2)相对校正因子的测定:,fmi为相对校正因子,其与待测物、基准物和检测器类型有关，与操作条件变化（如进样量）无关.基准物：热导检测器（TCD）苯；氢焰离子化检测器（FID）丁庚烷。,1、内标法：气相色谱最常用的定量方法.以一定量的纯物质（内标物），加入到准确称定的试样中，根据试样和内标物的重量及其峰面积比，求出某组分的含量。,对内标物要求：a内标物须为原样品中不含组分.b内标物能单独出峰且与待测物保留时间应接近，但与待测组分可完全分开,R1.5.c内标物为高纯度标准物质，或含量已知物质,加入的重量接近于组分的含量.,内标法优点：只需内标物及待测组分出峰。无需准确进样，适合微量组分的含量测定.缺点：找合适内标物困难(选择合适内标物是内标法的关键);需已知校正因子;样品的配制较复杂.,内标法加校正因子:精密称取待测物质的对照品R,加入适量内标物S进样,记录色谱图,测量对照品和内标物的峰面积,则其相对校正因子为:,再取加入内标物的供试液,进样,记录色谱图,测量供试液中待测组分和内标物的峰面积,计算含量:,内标对比法（内标一点法）把等量内标物分别加入等体积已知浓度对照品溶液和待测样品溶液中，样品溶液浓度最好与对照品溶液相当。前提:Ci/CsAi/As的截距为零.,内标对比法特点：不需要校正因子,内标工作曲线法：a、配制一系列不同浓度的等体积对照液，并加入相同量的内标物，进样，测标准品和内标物的峰面积Ai和As，以Ai/As对对照溶液中对照品浓度与内标物浓度之比Ci/Cs作图。计算回归方程式Ai/As=aCi/Cs+b及相关系数（a：斜率；b：截距），求出斜率、截距后确定标准曲线。b、与对照液等体积待测试样溶液中也加入与对照液相同量的内标物，测得Ai/As。c、把b中测得比值代入标准曲线计算试样的含量。,特点：不需要校正因子且比内标一点法精确。,2、外标法：以待测组分纯品为对照物，与试样中待测组分的响应信号（峰面积）相比较进行定量的方法。外标法关键：进样量准确，实验条件恒定。优点：操作简便，不用校正因子，不必加内标物，只需待测组分出峰。缺点：结果的准确度与进样量和操作条件的稳定性有关,易产生误差。,外标一点法：一种浓度对照物对比样品中待测组分含量，中国药典用气相测水分用此法。前提：截距为0，对照品浓度与待测组分浓度接近。C标=FA标，求出F，C样=FA样C为组分的浓度，A为测得该组分的峰面积，F为比例常数。外标两点法：用两种浓度对照物求算样品中待测组分含量。前提：选取两点对照品的浓度，需涵盖待测浓度。C=F1A+F2C、A同前，F1是比例常数，F2是纵坐标截距。较先进仪器可自动给出，否则也可自己求算。根据两种浓度对照品溶液C1、C2可测出其相应峰面积A1、A2代入上式解二元一次方程，求出F1与F2，确定直线方程后再测出供试品的峰面积，即可计算出供试品浓度。,工作曲线法：用对照品配成不同浓度的对照液，定量进样，用峰面积对对照品的量（或浓度）作线性回归，求出斜率、截距，确定标准曲线而后计算样品的含量。前提：进入检测器样品中被测成分含量与峰面积成正比且待测物峰面积在标准曲线范围内。3、归一化法：前提：试样中所有组分都产生信号并能检出色谱峰。依据：组分含量与峰面积成正比。适用范围：只能粗略考察供试品中被测物的含量，不适合微量组分的测定。,质量归一化法公式：,各组分为同系物或性质相近，校正因子相近时可直接采用面积归一化法计算：,优点：定量结果与进样量、重复性无关，色谱条件略有变化对结果几乎无影响。缺点：所有组分必须在一定时间内都出峰，必须已知所有组分的校正因子，不适合微量组分的测定。,4、标准溶液加入法：近年来出现新方法。为精密量取待测成分对照品适量配制成对照品溶液，取一定量精密加入供试品溶液中，根据外标法或内标法测定含量，再扣除加入对照品的量，即得供试品中待测成分的含量。目的：因气相色谱供试品中被测成分多含量较低，测量时误差较大。此方法就是要加大检测样品量，减小误差，其基本定量方法同前三个。,（八）注意事项：1、手工进样时，因进样体积不宜控制，最好用内标法定量。自动进样时，可采用外标法定量。2、当标准溶液加入法与其他定量方法结果不一致时，以标准溶液加入法为准。,五、高效液相色谱法（HPLC）：（一）定义：是在经典的液相柱色谱法的基础上引入了气相色谱的理论和技术，采用高压泵，高效固定相以及高灵敏度在线检测器发展而成的分离分析方法。适用于测定挥发性低、热稳定性差、分子量大的高分子化合物及离子型化合物，如蛋白质、生物碱、甾体等。HPLC与经典液相色谱比较：1、采用高压泵和高效固定相；2、采用高灵敏度检测器；3、分析速度快。HPLC与气相色谱比较：1、应用范围广；2、流动相选择范围宽；3、室温下分离。（二）特点：“三高”“一快”“一广”高柱效n104/米，柱效高（远高于一般LC）高灵敏度高选择性分析速度快应用范围广泛（可分析80%有机化合物）,（三）高效液相色谱仪与工作流程：,（四）基本原理：1、塔板理论：,2、速率理论：,因在HPLC中流动相为液体，扩散系数很小，纵向扩散项B/u可忽略不计.,流动相流速对HPLC板高的影响：,（五）HPLC法实验条件的选择：1、色谱柱的选择：反相色谱：应用最为广泛，适于分析非极性和中等极性的化合物。最常用的固定相是十八烷基键合固定相。正相色谱：主要用于分离极性化合物，常用氨基、氰基键合固定相。样品为酸、碱化合物，则采用离子交换色谱。样品为脂肪族或芳香族异构体则采用液-固（硅胶）吸附色谱。,2、流动相的选择：根据不同类型的色谱法选择流动相。反相分配色谱部分含水溶剂：流动相是以水为主，再加入能与水混溶的有机溶剂，通过改变有机溶剂的组成，改善分离效率，甲醇是最常用的有机溶剂，其次是乙腈和四氢呋喃。适用于分离中等极性、弱极性药物。非水溶剂：只用有机溶剂做流动相，主要分离疏水性物质。缓冲溶液：常用缓冲液有三乙胺磷酸盐、醋酸盐溶液等，适用于可溶于水并具可解离特性的化合物，如蛋白质、肽及弱酸、弱碱类化合物的分离。,正相分配色谱：流动相是以烃类（如己烷、庚烷等）为主，加入少量极性溶剂（如氯仿、甲醇等）来改变流动相的极性和组成，用于分离异构体、极性化合物等。3、洗脱方式：等度洗脱：溶剂组成在一分析周期里保持恒定，适用于组分较少、性质差别不大的样品。梯度洗脱：即在一个分析周期中，程序控制流动相的组成，使每个组分都在适宜的条件下获得分离。梯度洗脱可缩短总分析时间，提高分离度并改善峰形，提高峰的对称性，特别适用于极性范围很宽的混合物分离。,4、检测器的选择：针对样品的性质不同选择适合的检测器。紫外检测器（UV或UVD）：应用最广，对大部分有机化合物有响应。灵敏度高，线形范围高，可用于梯度洗脱。主要用于检测有可见紫外吸收的化合物。如芳烃与稠环芳烃、芳香基取代物、核酸、羧基与羰基化合物等。荧光检测器（FD）：高灵敏度、高选择性。但只能分析自身发荧光或其衍生物发荧光的物质。主要用于检测多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、氨基酸、甾类化合物等。蒸发光散射检测器（ELSD）：用于挥发性低于流动相，紫外无吸收或呈末端吸收的样品组分，但对于有紫外吸收的组分的检测灵敏度较低。主要用于糖类、高分子化合物、高级脂肪酸及甾体类等几十类化合物。,电化学发光检测器（ECD）：对于电活性物质来说是一类较好的选择性检测器。主要用于有机胺类化合物。示差折光检测器（RID）：利用折光率的差别进行检测，灵敏度低，温度要求严格。化学发光检测器（CLD):是高选择性，高灵敏度的新型检测器，适合分析微量的脂类、核酸和生物胺等。,5、HPLC前处理：（1）流动相的处理：溶剂的纯化：溶剂应为优质纯或光谱纯级。流动相脱气：流动相在使用前必须进行脱气处理，目的是除去其中溶解的气体。最常用的脱气方法为超声波振动脱气。超声波振动脱气：将欲脱气的流动相装入三角瓶置放于超声波提取器中，用超声波振荡10-15min，此法的脱气简单，最常用。过滤：流动相及供试液进液相前须经过0.45um或0.22um滤膜过滤，滤膜分有机溶剂和水溶液两种。（2）样品的处理：样品经除杂、纯化、浓缩或衍生化，制成便于HPLC测定的稳定形式。,（六）HPLC法分类及方法：1、键合相色谱法：以化学键合相为固定相的色谱法，由液液分配色谱发展而来。分离机制：分配+吸附，以分配作用为主。特点：a、被测成分不易流失b、热稳定性好c、化学性能好d、载样量大e、适于梯度洗脱分类：反相键合相色谱、正相键合相色谱、离子对色谱和离子抑制色谱。,（1）反相键合相色谱法：应用最广，2005年版中国药典收载中成药HPLC法均是以ODS为固定相的反相键合相色谱法。适合于分离弱极性和中等极性的化合物。极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。常用的固定相为十八烷基硅胶键合相C18(ODS)，其次是辛基硅烷键合硅胶。流动相采用甲醇水或乙腈水。有时也可加入适当的酸或碱来控制流动相的pH值，以防止出现不对称色谱峰。反相色谱常采用梯度洗脱，使每个组分都在适宜条件下获得分离。,（2）正相键合相色谱法：常用于分离强极性化合物。常用极性键合相为氨基键合相（强极性）、氰基键合相（中强极性）。流动相常选用低极性溶剂如烃类，加入适量极性溶剂如醇类等调节洗脱液。梯度洗脱时，通常逐渐增大洗脱剂中极性溶剂的比例，样品中极性小的组分先流出，极性大的组分后流出。氨基键合相是分析糖类最常用的固定相，常用乙腈-水为流动相。,（3）离子对色谱法：在流动相中加入溶质电荷相反的离子对试剂，来分离离子型或可离子化的化合物的方法。离子对色谱法分为正相离子对色谱和反相离子对色谱法，最常用的是反相离子对色谱。反相离子对色谱使用反相色谱中常用的固定相（ODS）。,（4）离子抑制色谱法：在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相pH值，抑制组分解离，以达到改善分离目的的方法。适用于弱酸碱性的物质，如pKa=37的弱酸；pKa=78的弱碱；两性化合物等。离子抑制剂：分离弱酸性物质加入HAc分离弱碱性物质加入NH3H2OpKa3的酸或pKa8的碱用离子对色谱法。,2、胶束色谱法：是以胶束分散体系为流动相的色谱法，适用于化学结构类似、性质差别细微的样品的分离分析。,（七）HPLC法系统适用性试验：考察最小理论塔板数、分离度、重复性和拖尾因子四项（