骨代谢异常的生物化学诊断.ppt

骨代谢异常的生物化学诊断,河北医科大学第三医院实验中心,李亚,细胞：,35%有机成分：,65%无机物钙磷镁,少量糖蛋白，骨磷蛋白和-羟化蛋白,主要为型胶原,骨基质,骨质,成骨细胞破骨细胞骨细胞骨原细胞,骨的功能,机械支撑保护脏器参与代谢,骨代谢异常的生物化学诊断,第一节钙和磷的代谢及调节,钙、磷、镁在体内的分布(%),钙磷镁骨和牙齿：998555软组织：11545细胞外液0.20.11总量g(mol)1000(25)600(19.4)25(1.0),血浆中钙的存在形式,血钙通常指血浆钙，正常值为2.252.75mmol/L血钙血浆蛋白结合钙40%（不可扩散）,与弱酸根结合的钙15,离子钙45,可扩散,血浆中磷的存在形式蛋白结合磷，游离磷（离子化），复合物磷正常成人血浆无机磷含量为0.71.1mmol/L,血浆磷不如血钙稳定，儿童时期血磷增高，此后随年龄增长而下降，在15岁时达成人水平。此变化与碱性磷酸酶的活性有关。,血钙与血磷之间有一定浓度关系,以mg/dl计算每100ml血液中钙磷的质量之积是一常数,CaP,=3640,成骨作用溶骨作用,CaP,40,成骨作用溶骨作用,CaP,35,成骨作用溶骨作用,（正常成人）,（少年儿童）,（佝偻症）,一、钙和磷的生理功能,（一）钙的生理功能1.细胞内钙含量：10-610-7mol/L与磷脂、二羧酸、钙结合蛋白结合线粒体、肌浆、内质网,细胞内钙的功能,1.触发神经-肌肉收缩偶联骨骼肌细胞内储存Ca2+受神经冲动而释放，Ca2+浓度增大到10-7-10-5mol/L时，Ca2+可迅速地与钙蛋白的钙结合亚基结合，引起一系列构象改变后导致肌肉收缩。2.作用于质膜，降低细胞膜的通透性3.为细胞内第二信使，参与细胞内信号传递4.酶的辅助因子5.抑制维生素D3-1-羟化酶的活性，参与钙磷代谢6.钙结合蛋白-钙调蛋白为酶的调节物质,细胞外钙的功能,1.是细胞内钙的来源2.稳定神经细胞膜影响其应激性。降低神经、肌肉的兴奋性。抽搐3.钙离子可以作为凝血因子，参与凝血过程,Ca+,（二）磷的生理功能,1.构成多种重要的核苷酸（如ATP、GTP、UTP、CTP等）2.构成核苷酸辅酶类（如NAD+、NADP+、CoA等）和含磷酸根的辅酶（如TPP、磷酸吡哆醛等）3.细胞膜磷脂在构成生物膜结构、维持膜的功能以及代谢调控上均发挥重要作用。如酶蛋白及多种功能性蛋白质的磷酸与脱磷酸化4.细胞内的磷酸盐参与许多酶促反应如磷酸基转移反应、加磷酸反应等。,细胞外磷的功能,1.血中磷酸盐（HPO42-/H2PO4-）是血液缓冲体系的重要组成成分。2.细胞外磷酸盐为细胞内以及骨矿化所需磷酸盐的来源,食物钙,肠吸收,血钙（2.25-2.75mmol/L）蛋白结合有机酸结合,钙的正常代谢,二、钙和磷的代谢,Ca+/P2/1,钙的代谢1.吸收每日摄入0.61.0g部位：小肠上段，主指十二指肠方式：在活性VitD3下的主动吸收过程影响因素：肠道pH：酸促进吸收，乳酸，胃酸,草酸植酸Ca(H2PO4)2Ca3(PO4)2食物中钙磷比例：Ca:P=2:1时吸收最佳肠道中活性VitD3的影响年龄的影响。2.排泄部位：肾（20）和肠道（80）由消化道排泄的钙量占总量的80(未吸收钙及分泌钙600mg）。由肾排出的钙占总排钙的20（150mg)。,磷的正常代谢,食物,磷,肠吸收,血磷（0.81.6mmol/L）,磷的代谢,1.吸收每日摄入1.01.5g部位：小肠上段主指空肠（70）方式：食物中的磷主指有机磷酸酯在磷酸酶的作用下生成H2PO4-，才能被吸收；影响因素：食物中金属离子的影响:长期口服氢氧化铝凝胶以及食物中钙、镁、铁离子过多，均可由于形成不溶性磷酸盐而影响磷的吸收。2.排泄：肾是磷排泄的主要器官，肾排磷占总排磷的70，其余30由粪便排泄,三、钙和磷及骨代谢的激素调节,甲状旁腺素维生素D降钙素甲状旁腺激素相关蛋白,（一）甲状旁腺素parathyroidhormone，PTH,合成部位：甲状旁腺的主细胞前甲状旁腺素原(115个Aa)粗面内质网25Aa甲状旁腺素原(90个Aa)高尔基复合体-6Aa甲状旁腺素(84个Aa单链多肽)分子量9500,PTH对血钙和血磷的调节作用,PTH是维持血钙正常水平的最重要的调节因素，它有升高血钙、降低血磷和酸化血液、促进溶骨等作用，其主要靶器官是骨、肾小管，其次是小肠粘膜等。,作用机制：作用于靶细胞膜，活化腺苷酸环化酶系统，激活ATP生成cAMP及PPi，cAMP能促使线粒体的钙转入细胞浆，PPi则作用于细胞膜外侧，使膜外侧的钙进入细胞的，致细胞的内Ca2+升高，并激活胞膜上的钙泵将Ca2+主动转至胞外。引起血钙升高。具体如图,1.对骨的作用：PTH浓度升高时，骨细胞则有溶骨效应。间质网状细胞破骨细胞成骨细胞骨细胞PTH的作用机理可表现在二个方面使前破骨细胞和间质细胞向破骨细胞的转化，抑制破骨细胞向成骨细胞的转化，导致溶骨和骨钙的大量释放。使破骨细胞的活动性增强，骨盐溶解，血钙升高溶酶体释放各种水解酶；抑制异柠檬酸脱氢酶的活性，使细胞内柠檬酸，异柠檬酸，乳酸，碳酸及透明质酸浓度增加；胶原酶活性增加,2.对肾作用促进远曲小管和髓袢上段对钙的重吸收，抑制近曲小管及远曲小管对磷的重吸收，结果使血钙升高，血磷降低，尿钙减少，尿磷增加3.促进活性VitD3的形成。4.对小肠的作用为一种间接反应，促进肠道对钙磷的重吸收,(二)维生素D(VitaminD,VitD),合成肝和肾是VitD3活化的主要器官麦角固醇紫外线麦角钙化醇(D2)D2脱氢7-脱氢胆固醇紫外线胆钙化醇(D3),高Ca2+,外源性食物,内源性(皮肤),维生素D3,肝脏25-羟化酶,1,25-(OH)2D3,25-(OH)D3,低P3-,高P3-,肾1-a羟化酶,降钙素,甲状旁腺素,无生物活性,微弱生物活性,生物活性明显增加,低Ca2+,(),(),(),(),(),(),对小肠的作用促进小肠对钙磷的吸收,改变膜磷脂结构，增加对钙的通透性。,上调与钙转运相关的蛋白质的表达,提高腺苷环化酶的活性，作为第二信使发挥作用。,2.对骨骼的作用：直接作用是促进溶骨：加速破骨细胞的形成，增强破骨细胞的活性间接作用是促进骨的钙化：促进肠道对钙磷的吸收，增加血钙结果表现为促进骨组织的更新3.对肾的作用：促进肾小管上皮细胞对钙磷的重吸收（同PTH比较）其机制是增加细胞内钙结合蛋白的生物合成，从而促进钙磷的吸收。,（三）降钙素（calcitonin,CT）,合成：由甲状腺滤泡旁细胞合成和分泌的一种单链多肽。32Aa,分子量3418血钙增高时，CT分泌增多；血钙降低时，CT分泌减少作用：1.对骨的作用抑制骨基质分解和骨盐溶解：抑制破骨细胞的活性；促进骨盐沉积：促使破骨细胞向成骨细胞的转化，导致骨盐沉积。2.对肾脏的作用CT可直接作用于肾脏的近曲小管，抑制钙磷的重吸收，使尿钙的排出增加。3.对小肠的作用：主要是间接作用，通过抑制活性D3的形成，而抑制小肠的钙磷的重吸收。,甲状旁腺素、维生素D、降钙素对钙磷代谢的影响,（四）甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP),1987年研究某些癌症引起恶性肿瘤体液性高钙血症(humoralhypercalcemiaofmalignancy，HHM)时发现。约有7580%恶性肿瘤并发高钙血症，如乳癌,肾癌,多发性骨髓瘤,淋巴瘤和白血病等。它与PTH的氨基酸结构相近，可与PTH受体结合，并发挥甲状旁腺素的功能，引起血钙升高。,第二节钙、磷、镁代谢紊乱,一、钙代谢异常（一）低钙血症,hypocalcemia(血清钙2.75mmol/L),二、磷代谢异常,（一）低磷血症,hypophosphatemia(血清磷1.45mmol/L),补钙是预防低钙高磷摄入对骨质不良影响的最佳方案，当然作什么事情都有度，过分补钙也有不良影响，如钙奶综合征等。有人提出“大量饮用可乐会增加妇女骨质疏松的危险”。,镁的代谢及其异常,总量与分布：2128g，居构成机体元素的第11位，,调节细胞代谢，调控细胞生长,镁的生理功能：1.细胞内镁的功能：Mg2+是近300种酶的辅助因子，广泛参与各种生命活动。参与酶的底物形成。是许多酶的变构激活因子。氧化磷酸化、糖酵解、细胞复制、核苷酸代谢、蛋白质。,2.细胞外镁的功能,血清镁：正常值：0.751.00mmol/L血清镁的存在形式：蛋白结合镁30，离子镁55，镁盐15,1.细胞内镁的来源2.降低神经、肌肉的兴奋性3.在突触前的神经末梢竞争性的抑制Ca+的进入,功能,镁的代谢,食物250mg,镁,肌肉镁：在有核细胞中存在的镁约有80存在于肌肉中。肌肉是维持镁平衡的重要组织。镁缺乏：急性血清镁与肌肉镁无交换慢性血清镁与肌肉镁有交换镁增加：无论是急性与慢性均无血清镁与肌肉镁的交换,（一）低镁血症血镁1.00mmol/L临床较少见原因：过多镁盐摄入静脉输入,三、镁的代谢异常,第三节骨代谢异常的临床生化,一、骨的组成：,骨的功能：,1.机械支撑2.保护脏器3.参与钙磷等的储备和代谢,二、骨的代谢：,1.成骨作用（两个过程）（P298）骨的有机质形成骨盐沉积2.溶骨作用,三、骨细胞的凋亡：,概念：骨细胞的程序性死亡,（一）破骨细胞的凋亡,1.表现（丫啶橙荧光染色）正常细胞：体积大，多核，发绿色荧光凋亡细胞：体积缩小，核固缩发橙红色荧光坏死细胞：细胞肿胀，可见均匀淡红色荧光,三、骨细胞的凋亡：,（一）破骨细胞的凋亡,2.调节多种细胞因子、激素和维生素维持破骨细胞生存：M-CSF、IL-1、促进破骨细胞凋亡：TGF-破骨细胞凋亡调节：雌激素和VitK,（二）软骨内成骨细胞的凋亡（P300）1.骺板软骨细胞的凋亡现象2.细胞凋亡与软骨发育不良3.关节生长发育和功能改建中细胞凋亡,（一）骨质疏松症（osteoporosis)概念：是因多种原因引起的骨组织显微结构受损，骨矿成分和骨基质等成分比例减少，骨质变薄，骨小梁数量减少，骨脆性增加，使骨折危险度增高的一种全身骨代谢障碍性疾病。在美国由于骨质疏松，每年引起150万骨折。1/3的65岁以上女性有脊柱压迫性骨折。一生中患髋骨骨折的约15%。在我国根据流行病学调查，60岁以上的老年人患骨质疏松的男女比例分别为35.8%和73%；4559岁者为16.9%和51.5%。据估计我国患骨质疏松者约有60008000万之多。,二、代谢性骨病的临床生物化学,病因：1.生长发育期钙和维生素D摄入不足2.激素水平不稳定3.1，25（OH）2D3合成不足4某些药物罗格列酮、糖皮质激素类药物,临床表现：1.疼痛。原发性骨质疏松症最常见的症症，以腰背痛多见，占疼痛患者中的70%-80%。2.身长缩短、驼背。3.骨折。这是退行性骨质疏松症最常见和最严重的并发症。实验室检查X光片、骨密度扫描,骨质软化症（osteomalacia)佝偻病,是继发于骨质疏松的疾病骨矿物质吸收，显微镜下非矿化骨类骨质（非矿化有机质）增加，1.病因：维生素D缺乏，磷酸盐缺乏,胃肠切除术小肠疾病肝胆疾病胰腺功能不全，依赖维生素D型佝偻病（缺乏1,25-(OH)2D羟化酶），依赖维生素D型佝偻病（受体与1,25-(OH)2D结合的亲合力差）低磷血症骨质软化症：(维生素D抵抗佝偻病）肾小管磷酸盐转运缺陷，大量排泄磷酸盐药物,维生素D缺乏,肠Ca2+、P3-吸收,血Ca2+,甲状旁腺代偿机制增强,尿P3-排出,旧骨脱钙,血P3-,血钙正常或稍低,钙磷乘积,骨样组织钙化障碍,骨质软化,骨样组织堆积,成骨作用,肌无力，张力过低骨骼改变：脊柱侧弯，“O”、“X”形腿,其它：外伤易骨折,肋骨串珠方颅,2.临床表现,3.实验室检查：,血清碱性磷酸酶测定、钙、磷、,血清25(OH)D浓度测定,肾小管磷酸盐最大吸收率：,测定空腹血清磷酸盐肌酐和同时收集的2小时尿磷酸盐、肌酐，分别计算出磷酸盐和肌酐的清除率,肾磷酸盐转运缺陷,Pagets病变形性骨炎,骨的局部性病变，骨吸收后被混乱形式的骨质所替代。1.临床表现：受侵部位出现局部骨痛和发热，骨胳变形，关节炎，神经压迫。2.实验室检查：血清ALP,B-ALP增高，尿脱氧吡啶酚、羟脯氨酸增高，,肾性骨营养障碍（renalosteodystrophy),各种原因导致的肾衰引起的骨骼异常。纤维性骨炎，骨软化症，骨发育不全，骨骼淀粉样变发病机制临床表现：骨痛：小腿臀部脊柱儿童骨骼畸形骨组织外骨化：关节周区域，动脉中间层，肺，心肌,实验室检查：,血清尿素氮、肌酐升高，高磷、低钙、高镁血症PTH升高，1,25-(OH)2D减少,第四节骨代谢疾病的生化标志物与检测,一、骨代谢的标志物骨形成标志物骨钙素骨性碱性磷酸酶前胶原肽骨吸收标志物胶原交联耐酒石酸酸性磷酸酶尿半乳糖羟赖氨酸尿羟脯氨酸,骨钙素(osteocalcin),分子量为5669，含49个氨基酸，骨钙素是在骨中含量十分丰富的非胶原蛋白，其总量占骨组织中非胶原蛋白的1520。骨钙素由成骨细胞合成和分泌，与羟磷灰石有较强的亲和力，约50沉着于骨基质，其余50进入血循环。1，25(OH)2D可以促进其合成。生理功能是维持骨的正常矿化速率，抑制异常的羟基磷灰石结晶的形成，抑制软骨矿化速率。血清骨钙素可以反映成骨细胞的活性或者是骨的形成的指标,骨碱性磷酸酶(bonealkalinephosphatase):,在骨内碱性磷酸酶来源于成骨细胞。成骨细胞活性和骨形成增加时，骨碱性磷酶活性增加。在血清中稳定，不受昼夜变化影响在反映骨细胞活性及骨形成上优于骨钙素,碱性磷酸酶：骨，肝，肾，小肠，胎盘,前胶原肽,I型胶原前肽是最常见的骨胶原，是骨基质的重要组成部分，几乎组成总蛋白部分的90。,反映成骨细胞活动和骨形成以及反映I型胶原合成速率的特异指标。,前胶原,胶原,前胶原氨基端肽（PINP）,前胶原羧基端肽（PICP）,（二）骨吸收标志物,1.胶原交联骨由无机质和有机质组成，胶原的成分占到有机质的90%，I型胶原I型胶原结构:由两条a1(I)和一条a2(I)链组成，其结构为a1(I)2a2(I),I型前胶原（N-、C-末端延伸链）1000Aa,140kD,脯氨酸赖氨酸羟基化糖基化三链间二硫键形成,三股螺旋结构,N-、C-端前肽,I型胶原分子,未成熟纤维,分子内部、分子间共价交联,分泌后,2羟赖氨酸侧链，1赖氨酸侧链,脱氧吡啶酚/赖氨酸吡啶酚,3个羟赖氨酸侧链,吡啶酚/羟赖氨酰吡啶酚,成环,稳定的成熟纤维,吡啶酚和脱氧吡啶酚,吡啶酚存在于硬连接组织：软骨*脱氧吡啶酚存在于骨、韧带、主动脉,脱氧吡啶酚：由胶原自然合成，非生物合成从尿中排出前不被代谢骨是脱氧吡啶酚的重要来源仅来源于天然基质的降解产物，不受饮食等干扰。,特异、灵敏地反映骨吸收,耐酒石酸酸性磷酸酶（Tartratercsistantacidphosphatase,TRAP）,血浆抗酒石酸酸性磷酸酶主要存在于破骨细胞，而成骨细胞和骨细胞中含量甚少。骨吸收时，TRAP由破骨细胞释放入血循环中，所以血浆中TRAP水平被认为是骨吸收的一项生化指标，主要反映破骨细胞活性和骨吸收状态。,3.尿半乳糖羟赖氨酸,胶原纤维,糖基化,半乳糖羟赖氨酸,糖化半乳糖羟赖氨酸,羟赖氨酸,骨胶原,皮肤胶原,4.尿羟脯氨酸,体内胶原代谢的终产物之一，其中一半来自骨胶原的破坏，还有一部分来自骨以外的各种胶原组织及饮食中胶原的破坏。反映骨吸收和骨转换程度，但不特异。,3.实验室检查,骨吸收标志物,尿钙，尿胶原交联（尿N端肽、脱氧吡啶酚、C端肽),血碱性磷酸酶，骨钙素,骨形成标志物,第五节骨代谢相关指标的实验室检查,一、钙、磷、镁的实验室检查（一）钙测定1.总钙测定(1)分光光度法,邻甲酚酞络合酮,PH12,Ca,紫红色獒合物570-580nm,偶氮砷,pH6,蓝紫色复合物650-660nm,(2)原子吸收分光光度法,镧-盐酸溶液（50）,血清Ca（1）,乙炔火焰,基态钙原子吸收422.7nm光波,8-羟基喹啉遮盖镁离子,Ca,检测吸光值,离子选择电极法,游离（离子)钙的测定,（二）血清磷的测定,无机磷,钼酸铵,磷钼酸络合物,340nm,(三)镁测定,1.血清总镁测定分光光度法：钙镁试剂(calmagite)，羟甲基偶氮苯萘酚磺酸盐,邻苯二胺,钼蓝,600-700nm,Mg,Mg-Calmagite530-550nm,EGTA-CaKCN-金属离子聚乙烯吡咯烷酮表面活性剂,蛋白质，脂血,甲基麝香草酚蓝,Mg,蓝色复合物,原子吸收分光光度法,镧-盐酸溶液（50）,血清Mg（1）,乙炔火焰,基态镁原子吸收285.2nm光波,检测吸光值,2.游离镁离子测定离子选择电极法,二、钙、镁及骨代谢调节激素的测定,（一）甲状旁腺激素测定放射免疫法，免疫化学发光法,（二）维生素D测定,放射竞争结合法（