（中药学专业论文）苗药透骨香提取物及其微乳的研究.pdf

贵阳中医学院硕士学位论文相关声明 原创性声明 本文声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表论文中撰写过的研究成果，也不包含为获得贵阳中医学院或其他 单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均 已在论文中作了明确说明。 作者冱云薛 ； 同期： o l o 年t 月矽同 关于学位论文使用授权说明 本文了解贵阳中医学院有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内 容，可以采用复印、缩印或其他手段保存学位论文；学校可根掘国家或贵州省有 关部门规定送交学位论文。 作者签名互么碎导师虢 魄即蛑如7 日 1 1 仪器6 1 2 试剂药品6 1 3 药材”6 1 4 动物6 第一章透骨香药材中水杨酸甲酯含量测定方法6 1 提取方法的考察6 1 1 透骨香药材吸水率的考察6 1 2 提取方法的考察7 2 水杨酸甲酯的含量测定方法考察“9 2 1 色谱条件：9 2 2 ：对照品溶液制备9 2 3 样品溶液的制备9 2 4 水杨酸甲酯的含量检测方法学考察9 ，3 本章小结1 2 第二章透骨香药材提取工艺的研究1 2 1 提取工艺设计1 2 2 正交试验设计1 2 3 f 交实验数据及分析13 3 1 直观分析1 3 3 2 方差分析1 3 3 3 最佳工艺验证1 4 4 不同产地透骨香中水杨酸甲酯的含量测定：1 4 5 本章小结1 5 1 2 4 6 6 录 一 一 第三章透骨香微乳成型工艺的研究1 5 1 透骨香挥发油的提取1 5 2 表面活性剂的选择1 5 3 助表面活性剂的选择1 6 4 伪三元相图的制备法1 6 4 1 利用伪三元相图法优选微乳制备工艺1 6 4 2 透骨香挥发油与混合乳化剂的体积比的确定1 8 5 透骨香微乳的制备1 8 6 透骨香微乳透明度检查1 8 7 透骨香微乳粘稠度”j “1 8 8 透骨香微乳类型的判定1 8 9 本章小结18 第四章透骨香微乳的药效学研究1 9 l 方法19 1 1 小鼠热板法19 1 2 小鼠醋酸扭体法2 0 1 3 小鼠耳廓二甲苯致炎法。2 0 2 小结2 1 总结与讨论一2 2 1 总结- 2 2 1 1 透骨香药材中水杨酸甲酯的含量测定2 2 1 2 透骨香微乳的制备2 2 1 3 存在的问题思考2 2 2 创新点2 3 参考文献2 4 综j 签2 5 一苗药透骨香的现代研究。2 5 1 概述2 5 2 化学成分研究2 5 3 透骨香的药理毒理研究2 6 4 透骨香的现代应用研究2 6 二微乳的现代研究2 7 1 概述2 7 2 微乳的形成机理2 8 3 微乳作用机制_ “2 8 4 微乳靶向药物的分布”2 9 5 微乳的制备方法3 0 6 影响微乳促透的因素3 1 7 微乳的现代应用研究3 2 8 微乳透皮给药制剂研究现状及展望“3 3 三，透骨香中挥发油的微乳研究3 3 参考文献3 4 附表一透骨香药材提取方法的考察图谱3 6 附表二水杨酸甲酯含量测定方法学考察图谱4 3 附表三透骨香药材中挥发油提取工艺正交试验图谱4 9 附表四透骨香药材中挥发油提取工艺验证试验图谱5 l 附表五不同产地透骨香药材中挥发油提取试验图谱5 2 致谢5 4 贵阳中医学院硕士论文 摘要 苗药透骨香为杜鹃花科植物云南滇白株的全株或根，透骨香挥发油是其主要 有效成分之一，挥发性很强，易氧化变质，遇光易分解。将其制备成微乳，使其 能够在遇光和遇氧的情况下，不易分解，变质，且使透骨香的药效保留时间增长， 提高它的治疗效果。将透骨香微乳经皮给药，可以提高它的生物利用度，缩短时 滞时间。并利用微乳的靶向药物分布特点，使透骨香药材的治疗作用提高。 挥发油含量测定方法的建立：挥发性成分一般用气相色谱法。本课题以水杨 酸甲酯为指标性成分；利用高效液相色谱法对透骨香药材中挥发油进行含量测 定。 提取工艺方法考察：以水杨酸甲酯为指标性成分，通过f 交试验设计确定最 佳提取工艺，对不同产地透骨香中挥发油含量进行测定。 透骨香微乳的制备：微乳作为一种新剂型，它的优点是可自发形成不需要任 何外力，并且是热力学和动力学稳定的体系。利用伪三元相图法制备透骨香微乳， 依据相图最大微乳区，确定表面活性剂和助表面活性剂的配比值，即k m 值。在 此基础上，制备透骨香微乳。 抗炎镇痛实验：采用经典热板法，醋酸溶液致痛法和二甲苯致小鼠耳肿胀法 研究透骨香微乳镇痛抗炎方面的效果，实验表明，透骨香微乳能抑制二甲苯所致 小鼠耳肿胀度，能抑制醋酸溶液所致小鼠疼痛，对热板小鼠疼痛也有明显的镇痛 作用。 关键词：透骨香；微乳；表面活性剂；助表面活性剂；伪三元相图法 贵阳中医学院硕士论文 a b s t r a c t m i a on a t i o n a l i t yh e r b a ly u n n a nw i n t e r g r e e ns t e ma n dl e a fi sh e r a c l e u m s c a b r i d u mf r a n c h st o t a ls t o c ko rr o o ti ny u n n a np r o v i n c e e s s e n t i a lo i li nh e m c l e u r n s c a b r i d u mf r a n c hi so n eo fi t sa r c h i a c t i v e i n g r e d i e n t ，h a sf a i r l y e v a p o r a b i l i t y ， o x i d a t i o na n dd e g e n e r a t i o n ，a n dl i g h td e g r a d a t i o n t a k ei ti n t om i c r oe m u l s i o n ，m a k e i t c o m p o u n da n du n d e g e n e r a t e di nl i g h ta n do x y g e n ，a n db u i l d u pi t sd r u ga c t i o n l e t y u n n a nw i n t e r g r e e ns t e ma n dl e a fm i c r oe m u l s i o np e r c u t a n e o u sa d m i n i s t e r , c a n e l e v a t eb i o l o g i c a la v a i l a b i l i t y ，d e c u r t a t ec h r o n s l u g g i s h ，a n du s ei t sd r u gd i s p o s i t i o n f e a t u r e so ft a r g e t e dd r u g ，s u b l i m a t ey u n n a nw i n t e r g r e e ns t e ma n dl e a f st h e r a p e u t i c a c t i o n e s t a b l i s h i n go fa s s a ym e t h o do fe s s e n t i a lo i l ：d e t e c t i n go fe v a n e s c e n tc o m p o s i t i o n u s e sv a p o rp h a s ec h r o m a t o g r a p h y ，e t i o t o p i cu s e sb e t u l ao i lw i t hi t si n d e x ，a n dt o u t i l i z eh i g he f f i c i e n c yl i q u i dc h r o m a t o g r a p h yt oe s t a b l i s ha s s a ym e t h o do fe s s e n t i a l o i l - m e t h o do fa b s t r a c t i o n ：a sb e t u l ao i lo fi t s i n d e x ，t h r o u g ho r t h o g o n a le x p e r i m e n t t h i st o p i cd e t e r m i n st h eb e s te x t r a c t i o n a r t w o r k ，a n de s s e n t i a lo i l i ny u n n a n w i n t e r g r e e ns t e ma n dl e a f p r e p a r a t i o no fy u n n a nw i n t e r g r e e ns t e ma n dl e a fsm i c r oe m u l s i o n ：a san e w d o s a g ef o r m ，m i c r oe m u l s i o nh a v eg r a c e so fi d i o f o r m i n gw i t h o u te x t r a - f o r c e ，a n di t i ss t a b l es y s t e mi nt h e r m o d na n dk i n e s i c s ，t e r n a r yp h a s ed i a g r a m u s i n gt h ep h a s e d i a g r a mf o rf a l s eg a u l t h e r i ai n c e n s em i c r o e m u l s i o n a c c o r d i n gt ot h em a x i m u m m i c r oe m u l s i o np h a s ed i a g r a m ，d e t e r m i n et h es u r f a c t a n ta n dc o s u r f a c t a n tr a t i oo ft h e p r o p o r t i o n o nt h i sb a s i s ，s w e e tm i c r o e m u l s i o ng a u l t h e r i ai sp r e p a r a t e d e x p e r i m e n to fa n t i i n f l a m m a t o r ya n da n a l g e s i a ：u s i n go fc l a s s i c a lh o tp l a t e ，a c e t i c a c i ds o l u t i o na l g o g e nw i t ha c e t i ca c i ds o l u t i o na n dj i m p ym i c e s 、sw e l l i n go fe a rw i t h d i m e t h y lb e n z e n e ，t h i st o p i c i n v e s t e f f e c t i v e n e s so fm i c r oe m u l s i o n i n a n t i - i n f l a m m a t o r ya n da n a l g e s i a e x p e r i m e n t ss h o wt h a ts w e l l i n gd e g r e eo fe a r s w h i c hi sm i c e si sr e s t r a i n e d ，a n dr e s t r a i np a i no fm i c ew h i c hi sc a u s e e de t h y l i ca c i d ， a n dr e s t r a i np a i no fm i c ew h i c hi sc a u s e e dh e a t i n g p l a t e n 2 贵阳中医学院硕士论文 k e yw o r d s ：y u n n a nw i n t e r g r e e ns t e ma n dl e a f , m i c r o e m u l s i o n ，s u r f a c ea c t i n g a g e n t ，p s e u d - t e m a r yp h a s ed i a g r a m 贵阳中医学院硕士论文 引言 苗药透骨香为杜鹃花科植物云南滇白株( g a u l t h e r i a y u n n a n e n s # ( f r a n c h ) r e h d ) 的全株或根。主产于云南，贵州，广西等地【。具有祛风除湿、活血通络等功效， 主治风湿关节痛、水臌、跌打损伤、牙痛、湿疹等症。始载于明初兰茂所著的滇 南本草【引。 透骨香在国内外都有分布，资源丰富；民间应用非常广泛，在贵州省作为苗 药应用也有很久的历史，并且透骨香的毒性比较小，用药安全。透骨香是极具药 用价值和丌发价值的植物，现代研究表明苗药透骨香亦可作为天然产的工业原料 冬绿油开发，有止痛、抗炎、抗菌的作用，具有很好的经济价值。 透骨香叶中主要含有水杨酸甲酯【3 】；根部含东莨菪碱、棕榈酸、胡萝卜苷1 4 1 、 木质素5 1 、p 一乙酰谷箔醇 6 1 等等成分。 吴琴等人通过实验从透骨香中分离出5 4 个化学成分，鉴定了其中的3 3 个化学 成分，已鉴定化学成分占挥发油总量的8 9 5 2 ，可反映挥发油组分的大致情况。 主要成分为：芳香族衍生物( 3 个) 占7 5 4 2 ，烷烃( 1 7 个) 占1 0 0 6 ，萜类化合物( 1 1 个) 占4 0 4 t7 1 。透骨香的精油的主要成分是水杨酸甲酯【引。 有人对小鼠进行透骨香的止痛作用的研究，应用小鼠醋酸扭体法、小鼠电刺 激法和小鼠热板法，研究结果表明，小鼠口服透骨香浸膏液对化学性刺激疼痛有 明显的镇痛作用；透骨香浸膏液对小鼠电刺激所致疼痛有明显的抑制作用：透骨 香浸膏液对小鼠热刺激疼痛亦有止痛作用【9 l 。 孙学蕙【9 】等人通过小鼠试验研究结果显示透骨香具有明显的抗炎作用，对小 鼠不同部位的炎症都有抗炎的作用。 有人用小鼠进行试验研究，结果显示，透骨香浸膏无明显的急性毒性【1 2 】。在 f 常的剂量下喂小鼠，对小鼠没有急性毒性的表现。 有人通过大鼠对透骨香药酒长期毒性的研究，实验结果显示，给大鼠服药三 个月，并不影响主要脏器的功能和形态，也不影响生长。结果表明，透骨香要就 具有较大的安全性【10 1 。 但目前国内外关于透骨香的研究报道很少，并且不深入。因此，本课题以透 骨香的主要药用成分水杨酸甲酯作为检测指标，采用正交实验法对苗药透骨香中 挥发油的提取条件进行了优化，将为进一步更好丌发利用透骨香提供依据，并为 贵阳中医学院硕士论文 丌发苗药透骨香的广泛应用奠定一定的基础。 微乳( m i c r o e m u l s i o n ) 是由水相、油相、表面活性剂和助表面活性剂按适当 的比例自发形成的一种透明或半透明的、低黏度、各向同性且热力学稳定的溶液 体系。 微乳作为一种新剂型，它的优点是可自发形成不需要任何外力，并且是热力 学和动力学稳定的体系。它能够增加药物溶解度提高通透浓度梯度，增加角质层 脂质双分子层流动性，破坏角质层中的水性通道，并且能够以完整结构经由毛囊 通透皮肤；药物还可以从微乳中析出后经皮吸收。微乳对水溶性及脂溶性药物均 具有良好的溶解性，可增大难溶性药物的溶解度、提高易溶性药物的稳定性，增 加药物的利用度。 透骨香挥发油在水中的水溶性很差，几乎不溶f 水，并且在常温下可自然挥 发，暴露在窀气中，遇氧气极易变质，性质很不稳定。将透骨香挥发油制成微乳， 能够克服透骨香挥发油自身的缺点，并且用于透皮给药，可以提高透骨香药物的 生物利用度，缩短药物的时滞时间。 贵阳中医学院硕士论文 实验部分 1 仪器与试药。 1 1 仪器 高效液相色谱仪( 岛滓l c 一2 0 a t ) ，电热套( 河南巩义电气设备有限公司) 2 0 0 0 m l ，3 0 0 0 m l ，5 0 0 0 m l ；挥发油提取器，h t 一2 0 杜温箱，g l l 型磁力 搅拌器( 巩义市予华仪器有限责任公司) ，h h 一4 水浴锅( 天津市泰斯特仪器 有限公司) ，i z 0 9a - - 4x 型植物粉碎机，x z c 一2b 型自控温度热板仪，c s 5 0 1 恒温器，p b 6 0 2 一n 型电子天平，6 m m 打孔器。 1 2 试剂药品 甲醇( 天津科密欧化学试剂有限公司，色谱纯) ，水杨酸甲酯对照品( 由中 国药品生物制品鉴定所提供，批号：l 1 0 7 0 7 2 0 0 7 1 0 ) ，水杨酸甲酯软膏( 联邦 制药公司) ，水杨酸甲酯( 上海山浦化工有限公司) ，无水乙醇( 成都科龙化工 试剂厂生产) ：二甲苯( 重庆川江化学试剂厂) ，无水硫酸钠( 重庆川江化学试 剂厂) ，t w e e n 8 0 ( 重庆川东化工有限公司) ，异丙醇( 天津市富宇精细化工有 限公司) ，冰醋酸，水( 娃哈哈纯净水) ，其余试剂均为分析纯。 1 3 药材 实验所用药材购于贵阳市万东药材市场，经贵阳中医学院魏升华教授鉴定为 杜鹃花科植物云南滇白株( g a u l t h e r i a 船船口心p ”s 西( f r a n c h ) r e h d ) 的全株。 1 4 动物 昆明种小鼠，体重1 8 2 2g ，雌雄各半，购自贵阳医学院试验动物中心，合 格证号为s c x k ( 黔) 2 0 0 2 2 0 0 1 。 第一章透骨香药材中水杨酸甲酯含量测定方法 挥发性成分测定通常采取气相色谱法。本实验采用高效液相色谱仪对透骨香 中挥发性成分水杨酸甲酯进行含量测定。实验结果显示，高效液相色谱法对水杨 酸甲酯的含量测定方法稳定，操作简便，易于操作。 1 提取方法的考察 1 1 透骨香药材吸水率的考察 称取3 份干燥透骨香药材，分别编号为1 、2 、3 号。每份样品8 0 o o g ，分别 贵阳中医学院硕士论文 置于3 0 0 0 m l 的圆底烧瓶中，加水2 0 0 0 m l ，放置过夜；其中l 号样品为未粉碎 药材，2 号样品为剪碎直径约3 c m 药材，3 号样品为剪碎直径约l c m 药材。各号 均重复测定三次吸水率，结果见表2 1 。 表2 - 1 透骨香药材吸水率测定 由表2 1 可知，药材未粉碎的吸水率平均为1 9 5 8 ，药材剪碎直径约3 c m 的吸水率平均为2 0 8 3 ，药材剪碎直径约为l c m 的吸水率平均为2 3 3 3 。 1 2 提取方法的考察 以资料和参考文献得知，透骨香中挥发油的比重大于水，依照中国药典 ( 2 0 0 5 版) 挥发油提取法中乙法，以水蒸汽蒸馏法从透骨香药材中提取挥发油。 并以挥发油中水杨酸甲酯含量为指标，考察提取时间、粉碎度、料液比等因素对 提取效果的的影响。 1 2 1 提取时| 日j 的考察： 分别称取干燥透骨香药材3 份，每份8 0 o o g ，剪碎为直径约l c m ，分别置于 2 0 0 0 m l 圆底烧瓶中，加水2 0 倍量，用水蒸汽蒸馏法分不同时间进行提取，收 集挥发油，测定挥发油中水杨酸甲酯的含量，以其为指标考察提取时间对提取效 果的的影响，实验结果见表2 2 。 表2 - 2 提取时间的考察 贵阳中医学院硕士论文 由表2 2 结果显示，透骨香药材提取1 2 h 提取物中水杨酸甲酯的含量最高。 1 2 2 粉碎度的考察 分别称取干燥透骨香药材3 份，每份8 0 o o g ，第一份剪碎为直径3c m ，第 二份剪碎直径为l c m ，第三份未剪碎，分别置于2 0 0 0 m l 圆底烧瓶中，加水2 0 倍量，用水蒸汽蒸馏法提取1 2 h ，收集挥发油，测定挥发油中水杨酸甲酯的含量， 以其为指标考察粉碎度对提取效果的的影响，实验结果见表2 3 。 表2 - 3 粉碎度的考察 由表2 3 结果显示，将药材粉碎为直径l c m 时提取物中水杨酸甲酯的含量最 高。 1 2 3 料液比的考察 分别称取干燥透骨香药材3 份，每份8 0 o o g ，剪碎为直径l c m ，分别置于 2 0 0 0 m l 圆底烧瓶中，加水为1 0 倍，1 5 倍。2 0 倍量，用水蒸汽蒸馏法提取1 2 h ， 收集挥发油，测定挥发油中水杨酸甲酯的含量，以其为指标考察料液比对提取效 果的的影响，实验结果见表2 - 4 。 表2 - 4 料液比的考察 贵阳中医学院硕士论文 由表2 4 结果显示，料液比为1 5 倍量时提取物中水杨酸甲酯的平均含量最高。 从以上单因素考察实验结果可知，提取时间为1 2 h 、粉碎度为药材粉碎直径 l c m 、料液比等1 5 倍量时提取物中水杨酸甲酯的平均含量最高，可确定为最佳提 取条件。 2 水杨酸甲酯的含量测定方法考察 2 1 色谱条件 色谱柱：( k r o m a s i l1 0 0 ac 1 851 tm2 5 0 4 6 r a m ) ； 流动相：甲醇：水= ( 6 5 ：3 5 ) ；检测波长：2 7 5 n m ； 柱温：3 0 ；流速：1 0m l r a i n ；进样量：1 0 “l 。 2 2 ：对照品溶液制备 精密量取水杨酸甲酯标准品1 0 0 m l ，置于5 0 m l 容量瓶中，用无水乙醇定容 至刻度线，得o 0 2 m l m l 。标准品溶液。 2 3 样品溶液的制备 精密称取干燥透骨香8 0 0 0 9 ，置于2 0 0 0 m l 圆底烧瓶中，3 口x 1 5 倍量水，用水 蒸气蒸馏法提取，在挥发油提取器中加2 o o m l _ - 甲苯，提取1 2 h ，收集二甲苯和 挥发油混合液，用无水硫酸钠脱水，置于2 5 m l 容量瓶中，用无水乙醇定容至刻 度。再从中精密量取1 2 5 0 1 t l ，置于2 5 m l 的容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度， 得供试品溶液。 2 4 水杨酸甲酯的含量检测方法学考察 2 4 1 线性关系考察 精密量耿水杨酸甲酯标准品1 0 0 m l ，置于5 0m l 容量瓶中，用无水乙醇定容 至刻度线，再分别从中耿出o 1 0m l 、0 2 0 m l 、o 3 0m l 、0 4 0 m l 、o 5 0 m l 、o 6 0 m l 置于2 5m l 容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度。精密吸取上述对照品溶液1 0 p l 注入液相色谱仪，得峰面积( 图见附录) ，以进样量浓度x ( m l m l 。) 对峰面积 y 进行回归处理，得线性回归方程y - 4 e + 0 9 x + 4 3 9 0 1 ，相关系数r = 0 9 9 9 9 ( n = 6 ) 。 贵阳中医学院硕士论文 4 0 0 0 0 0 0 一：，i 一j 00 0 0 0 10 0 0 0 2 0 0 0 0 30 0 0 0 40 0 0 0 50 0 0 0 6 ， ” 图1标准曲线 根扼线性考察，结果显示，x 在o 0 8p l m l , - - 一0 4 8g l m l 范围内与y 呈良 好的线性关系。 2 4 2 精密度试验 精密吸取浓度为o 0 2 m l m l 一对照品溶液，连续进样6 次，测得峰面积，对 结果进行分析。 表3 1 精密度试验结果 由3 1 表可知，r s d 值为0 4 ，精密度良好。 2 4 3 重复性试验 在规定的线性范围内，取同一供试品6 份，与2 4 2 项下相同操作条件，测 得峰面积，计算得出水杨酸甲酯的含量。结果见表3 2 。 表3 - 2 重复性试验结果 序号水杨酸甲酯含姑 水杨酸甲酯平均含量r s d l o 。 贵阳中医学院硕士论文 10 4 5 7 20 4 6 2 4 6 0 4 4 8 0 4 5 4 0 4 6 0 0 4 5 6 0 4 5 61 1 由表3 2 结果可知，重复性良好。 2 4 4 回收率试验 以样品中含量为标准，取其8 0 ，1 0 0 ，1 2 0 的比例加入对照品，按表3 3 所示的量精密称取已知含量的透骨香药材9 份，分为3 组，每组3 份，精密加入 浓度为o 0 2 m l m l 。水杨酸甲酯标准品溶液，按2 3 项供试品溶液的制备方法 制备9 份各浓度样品溶液，分别精密吸取各溶液1 0ul 注入高效液相色谱仪中， 计算回收率。 回收率= 面万- 忑r 1 0 0 实验结果见表3 - 3 ： 表3 - 3 同收率试验结果 样号 取样量佗 样品中含加入对照测得颦平均回收 量m l品m l m l 同收率 r s d 率 4 0 4 3 60 1 8 4 40 1 4 40 3 3 3 91 0 3 8 2 24 0 3 9 50 1 8 4 20 1 4 40 3 3 2 21 0 2 8 4 4 0 5 2 80 18 4 80 14 4 0 3 3 2 61 0 2 9 4 44 0 4 3 20 1 8 4 40 1 8 4o 3 7 1 21 0 1 5 3 4 0 5 3 80 1 8 4 90 1 8 40 3 6 6 59 8 7 11 0 1 0 91 7 9 贵阳中医学院硕士论文 64 0 4 8 00 1 8 4 6 0 1 8 40 3 6 8 29 9 8 74 0 5 2 lo 1 8 4 80 2 1 6 0 4 0 31 0 1 0 5 8 4 0 4 6 90 1 8 4 50 2 1 60 4 0 09 9 9 3 94 0 4 3 70 18 4 30 2 1 60 3 9 8 69 9 2 1 表3 3 结果表明，平均回收率为1 0 1 0 9 ，r s d 值为1 7 9 ，方法回收率良好。 3 本章小结 通常挥发性成分多用气相色谱仪测定。本实验是用水蒸气蒸馏法提取透骨 香药材中挥发油，以水杨酸甲酯为指标性成分，利用高效液相色谱仪对挥发油中 水杨酸甲酯含量进行测定，实验结果表明，高效液相色谱法对于水杨酸甲酯含量。 测定方法稳定，可行。 第二章透骨香药材提取工艺的研究 1 提取工艺设计 称取干燥透骨香药材约8 0 0 0 9 ，置于2 0 0 0 m l 的圆底烧瓶中，按实验设计的 提取时间、粉碎度、料液比，依照中国药典( 2 0 0 5 版) 挥发油提取法中乙法， 用水蒸汽蒸馏提取相应时间，放置l h 后，精密量取挥发油。 2 正交试验设计 通过预实验确定挥发油提取主要影响因素为料液比、提取时间、粉碎度。从 而选料液比( a ) 、粉碎度( b ) 、提取时f b j ( c ) 作为考察因素，设计3 个水平，以水 杨酸甲酯的含量为指标，设计l 9 ( 3 4 ) j 下交实验，见表4 1 。 表4 - 1l 。( 3 4 ) 正交试验表头设计 1 0 倍量朱粉碎 4 贵阳中医学院硕士论文 21 5 倍颦 1 c m 32 0 倍鼙 3 c m 1 2 一- l _ _ _ _ _ 一 3 正交实验数据及分析 表4 2b ( 3 1 ) 止交试验表及结果 _ 一 实验号 料液比a粉碎度b 提取时间c d ( 空向)结果 一一 l1 0 倍餐未粉碎4 h 0 4 i 1 0 倍鹫 1 0 倍量 1 5 倍量 1 5 倍量 1 5 倍量 2 0 倍鼙 2 0 倍簧 2 0 倍量 0 6 0 7 0 6 5 0 4 9 3 o 1 6 4 直径1 c m 直径3 c m 未粉碎 直径1 c r n 直径3 c m 朱粉碎 直径1 c n l 直径3 c m 0 5 4 7 0 6 5 0 0 5 6 0 0 1 0 3 8 h 1 2 h 8 h 1 2 h 4 h 1 2 h 4 h 8 h 0 3 9 3 0 5 7 3 0 7 9 0 0 3 9 7 0 6 2 0 0 5 3 7 0 6 0 0 0 0 8 3 o 6 l o 8 0 0 6 2 0 9 6 o 3 9 o 6 l 0 3 8 0 4 9 3 1 直观分析 以表4 2 中的极值r 进行分析，各指标因素影响的主次顺序是c a b d ，根 据k 值进行比较可得，a 因素中k 2 值最大，b 因素中k 2 值最大，c n 素中k 3 值最大， 因此，最佳提取方案是a 2 8 2 c 3 。 3 2 方差分析 上述试验所用f 交表采用常规方法进行数据分析，将离差平方和中最小的项 近似作为误差的估计，用末计算各因子列的f 比值，进行数据统计，实验结果见 表4 3 。 1 3 ，1j 2 3 4 5 6 7 8 9 k k k r 贵阳中医学院硕士论文 表4 3 方筹分析表 变异米源离差平方利自由度方著 fp a0 0 4 223 8 l81 9 b0 0 1 9 2 1 7 2 7 1 9 c0 2 3 722 1 5 4 51 9 幸 do 0 l2 f o0 5 ( 2 ，2 ) = 1 9木表明有显著性差异 从表4 3 中可以看出c 因素的三个水平存在较大差异，对实验的结果影响较 大，a 因素和b 因素的三个水平对实验结果影响较小，结合直观分析可以得出最 佳提取工艺为a 2 8 2 c 3 ，即料液比为1 5 倍量水，粉碎度为直径约l c m ，提取时间为 1 2 h 。 3 3 最佳工艺验证 称取干燥透骨香药材8 0 0 0 9 ，按最佳工艺条件1 5 倍量水，粉碎为直径约l c m ， 提取时白j1 2 h ，提取三次，结果如下表4 - 4 。 表4 4 工艺验证( n = 3 ) 提取三次实验结果水杨酸甲酯平均含量是o 5 0 7 ，r s d 值为1 7 ，从表4 - 4 中可以看出实验结果较理想，该提取方法条件稳定可行。 4 不同产地透骨香中水杨酸甲酯的含量测定 通过以上的工艺条件和色谱条件对贵州不同产地透骨香中挥发油的含量进 行测定，结果见表4 - 5 。 表4 - 5 不同产地透骨香中水杨酸甲酯的含量( n = 3 ) 产地 含奄 贵阳中医学院硕士论文 由表4 5 可得，透骨香药材中水杨酸甲酯的含量不相等，在所测定样品中贵 州高坡所产的透骨香药材中水杨酸甲酯的含量最高。 5 本章小结 通过f 交试验设计确定透骨香药材中挥发油的提取工艺料液比是1 5 倍量水， 粉碎度为直径约l c m ，提取时间为1 2 h 。对不同产地透骨香药材中挥发油进行测 定，结果表明，贵州高坡所产透骨香挥发油含量最高。 第三章透骨香微乳成型工艺的研究 本实验以透骨香挥发油作为油相采用伪三元相图法制备透骨香微乳。在制备 过程中，首先以挥发油的性质和欲构成微- 孚l ( m e ) 的类型选择合适的表面活性剂； 其次选择合适的助表面活性剂。 在选定了适当的表面活性剂和助表面活性剂之后，采用伪三元相图法进行工 艺研究。首先选择表面活性剂和助表面活性剂的最佳体积比，即确定最佳k m 值， 然后确定混合乳化剂与透骨香挥发油的最佳体积比。在此基础上制备透骨香微 乳。 1 透骨香挥发油的提取 取干燥透骨香药材粉碎为直径约为l c m ， 3 1 1 1 5 倍量水，用水蒸汽蒸馏法提取 时问1 2 h ，收集挥发油，用无水硫酸钠脱水，得挥发油，备用。 2 表面活性剂的选择 表面活性剂分为离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂，离子型表面活性 剂又分为阴离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂和两性离子型表面活性剂。 由资料和文献得知，离子型表面活性剂通常毒性都比较大，并且受电解质和溶液 p h 值的影响比较大，对皮肷的刺激作用也大于非离子型表面活性剂。非离子型 表面活性剂一般在水中不解离并且不受电解质和溶液p h 值的影响，毒性和溶血 性都相对于离子型表面活性n d , ，并且能与大多数药物配伍，所以本次试验选择 非离子型表面活性剂作为实验所用表面活性剂。 贵阳中医学院硕士论文 在非离子型表面活性剂当中，由于聚山梨酯类( 即吐温类) 分子中增加了亲 水性的聚氧乙烯基，大大增加了亲水性，常被作为水溶性的表面活性剂，广泛用 作增溶剂或o w 型乳化剂。经过预实验以及溶血作用的顺序和毒性等比较，吐温 2 0 、吐温4 0 、吐温6 0 和吐温8 0 中，吐温8 0 最低，更适合作表面活性剂，且透骨 香挥发油在吐温8 0 中的溶解性也比较好。故选择吐温8 0 作为表面活性剂。 3 助表面活性剂的选择 分别用无水乙醇、丙三醇、异丙醇为助表面活性剂与表面活性剂吐温一8 0 按 l ：l 的比例与透骨香中挥发油在相同的情况下制备乳剂。实验结果是丙三醇无法 形成乳剂，无水乙醇制成的乳剂现象不明显，并且不稳定。而用异丙醇作为助表 面活性剂制备微乳时，现象明显，并且微乳区比较大，故选择异丙醇为助表面活 性剂。 4 伪三元相图的制备法 4 1 利用伪三元相图法优选微乳制备工艺 为确定微乳的各种成分浓度的范围，在室温下用水滴定法构建伪三元相图。 以表面活性剂( 吐温一8 0 ) 与助表面活性剂( 异丙醇) 的体积比为k m = 1 ：1 、1 ：3 和3 ：1 ，固定表面活性剂和助表面活性剂的比，改变透骨香挥发油对表面活性剂 和助表面活性剂的体积比，分别为1 ：9 、2 ：8 、3 ：7 、4 ：6 、5 ：5 、6 ：4 、7 ：3 、8 ：2 、 9 ：1 等一系列的固定体积比下，用磁力搅拌器混匀油相、表面活性剂和助表面活 性剂混合物的情况下用水进行滴定。平衡后对混合物进行观察定性，澄清、淡黄 色、粘度低、透明、有淡蓝色乳光的为微乳，不透明、浑浊的白色乳状液为普通 乳剂，澄清、粘度高、在倾斜9 0 度后弯月面不发生变化的状态为凝胶剂。 在伪三元相图中，灰色阴影部分为微乳相区，以微乳相区面积大小为指标确 定最佳k m 值。比较图2 ( a ) 、( b ) 、( c ) 可知，在图2 ( a ) 中所示灰色阴影区域最大， 即当k m 为1 ：1 时形成的微乳区最大，故确定表面活性剂( 吐温8 0 ) 与助表面活性 剂( 异丙醇) 的最佳体积比k m 值为1 ：1 。 1 6 水相1 贵阳中医学院硕士论文 祝合乳化剂 。挥发油 ( a ) 混合乳化剂( 吐温一8 0 与异丙醇的体积比k 。= l ：1 ) 棍合乳化剂 水相1 o 挥发油 ( b ) 混合乳化剂( 吐温8 0 与异丙醇的体积比k 。= 1 ：3 ) 水相1 - 混合乳化剂 o 挥发油 ( c ) 混合乳化剂( 吐温8 0 与异丙醇的体积l c k 。= 3 ：1 ) 图2 不同k 。值的吐温一8 0 异丙醇混合物一透骨香挥发油一水伪二元体系相图 1 7 贵阳中医学院硕士论文 4 2 透骨香挥发油与混合乳化剂的体积比的确定 在确定表面活性剂( 吐温8 0 ) 与助表面活性剂( 异丙醇) 体积比为1 ：l 的最 佳k m 值条件下，按透骨香挥发油与混合乳化剂的体积比为1 ：9 、2 ：8 、3 ：7 、4 ：6 、 5 ：5 、6 ：4 、7 ：3 、8 ：2 、9 ：l 作透骨香挥发油与混合乳化剂最佳体积比优化实验， 结果如图2 ( a ) 中所示，其中透骨香挥发油与混合乳化剂的体积比为4 ：6 的实验点条 件容易观察，便于控制，故确定该比例为制备透骨香微乳的最佳制备工艺。 5 透骨香微乳的制备 以吐温8 0 为表面活性剂异丙醇为助表面活性剂( k m = 1 ：1 ) ，透骨香挥发油为 油相。以透骨香挥发油对表面活性剂和助表面活性剂的体积比4 ：6 ，用磁力搅拌 器混匀油相、表面活性剂和助表面活性剂混合物，当混合物混匀后，一边搅拌一 边向混合物中逐滴加入水相，平衡后对混合物通过肉眼进行观察定性，澄清、淡 黄色、粘度低、透明、有淡蓝色乳光，则混合物为微乳。 6 透骨香微乳透明度检查 取制备的透骨香微乳适量，在f 1 光下进行透明度测定实验。实验结果表示， 透骨香微乳是透明液体，这符合微乳透明度的要求。 7 透骨香微乳粘稠度 取制备的透骨香微乳适量，置于试管中，另取等量的水，置于另一试管中， 进行观察。实验结果表明，透骨香微乳液黏度与水相似，属于低黏度，符合微乳 黏度要求。 8 透骨香微乳类型的判定 取相同体积的透骨香微乳液两份，分别置于同一规格的试管中，再分别同时 加入苏月红i i i 染料和亚甲基蓝染料溶液2 滴，静置观察两种染料( 红色和蓝色) 在 微乳液中的扩散速度以及外观的变化。苏丹红i i i 染料为油溶性染料，易在油相中 扩散；亚甲基蓝染料为水溶性染料，易在水溶液中扩散。 由实验观察，蓝色的扩散速度远远大于红色，判断透骨香微乳为o w 型微乳 液。 贵阳中医学院硕士论文 9 本章小结 利用伪三元相图法制各透骨香微乳，实验结果表明，当表面活性剂( 吐温一8 0 ) 和助表面活性剂( 异丙醇) 的配比为1 ：l 时，微乳区最大，从而确定制备微乳的 二者比为1 ：l 时。透骨香挥发油制备微乳现象明显，易于制备。 第四章透骨香微乳的抗炎镇痛作用研究 1 方法 1 1 小鼠热板法 按热板法要求挑选出适合实验的雌性小鼠5 0 只，随机分成5 组( 空白对照 组、阳性对照水杨酸甲酯、透骨香挥发油微乳高剂量组、透骨香挥发油微乳中剂 量组、透骨香挥发油微乳低剂量组) ，于2 4 h 前用剪刀在背部剪去3 c m x3 c m 的皮肽，注意不要有破损。用热板测痛仪调节温度为5 5 + 0 5 ，以小鼠舔后足 为疼痛指标。给药前隔5 m i n 测定痛阈2 次，取均值，以局部给药方式给予透骨 香挥发油微乳制剂分3 次，每次l 自j 隔3 0 m i n ，给药后3 0 m i n ，6 0 m i n ，9 0 r a i n 分别 测定各组的痛阈，同样隔5 m i n 测2 次，耿均值。实验结果见表1