（临床兽医学专业论文）三株不同亚型siv+ha基因与na基因克隆与序列分析.pdf

英文缩写词表 目录 中文摘要1 英文摘要3 1 引言6 1 1 s i v 的病原学特征7 1 2 s i v 亚型的分类。7 1 3s i v 的特性8 1 4 s i v 的分子生物学特性。9 1 5s i v 的种间传播机制1 3 1 6s i v 的流行病学。1 5 1 7s i v 的抗原变异1 6 1 8s i v 的临床症状及病理变化1 8 1 9s i v 诊断技术1 9 1 1 0 防制2 1 1 1 l 公共卫生学意义2 3 2 材料与方法2 4 2 1 病毒2 4 2 2 试剂和仪器2 4 2 3 试验2 4 3 结果与分析3 1 3 1r t p c r 扩增结果3 1 3 2 重组子的酶切鉴定结果3 3 3 3 序列分析结果3 6 4 寸论4 5 4 1h 3 n 2 亚型h a 基因、n a 基因序列分析结果讨论4 5 4 2h 9 n 2 亚型h a 基因、n a 基因序列分析结果讨论4 6 4 2h 9 n 2 亚型h a 基因、n a 基因序列分析结果讨论4 6 5 结论：4 8 参考文献：4 9 附录5 8 附录1 ：s w s d j t 0 7 ( h 3 n 2 ) h a 基因测序结果5 8 附录2 ：s w s d j t 0 7 ( h 3 n 2 ) n a 基因测序结果5 9 附录3 ：s w s d j t 0 7 ( h 9 n 2 ) h a 基因测序结果6 0 附录4 ：s w s d j t 0 7 ( h 9 n 2 ) n a 基因测序结果6 1 附录5 ：s w s d j t 0 7 ( h 1 n 1 ) h a 基因测序结果6 2 附录6 ：s w s d j t 0 7 ( h l n l ) n a 基因测序结果6 3 致谢6 6 攻读硕士期间论文发表情况6 7 i l “ ， 山东农业火学硕士学位论文 中文捅要 本研究对h 3 n 2 、h 9 n 2 、h 1 n 1 三个不同亚型的猪流感病毒( s w i n e i n f l u e n z av i r u s ，s i v ) 的h a 基因、n a 基因进行了克隆序列分析。根据 g e n b a n k 中h 3 n 2 、h 9 n 2 、h l n l 亚型猪流感病毒( s i v ) h a 基因、 n a 基因序列，分别设计扩增三个不同亚型s i vh a 基因、n a 基因的 特异性引物，采用r t - p c r 方法进行扩增，然后将所扩增的基因克隆入 p m d l 8 t 载体，进行测序分析。 s w s d j t 0 7 ( h 3 n 2 ) h a 基因长度约为1 7 0 1 b p ，编码5 6 6 个氨基 酸，与参考毒株的同源性在6 5 2 8 1 8 之间；h a 0 切割位点序列为 p e n q t r l , g ，属非高致病性毒株；s w s d j t 0 7 ( h 3 n 2 ) h a 蛋白有7 个 糖基化位点，由于碱基突变缺少了一个糖基化位点，生物学特性发生变 化。s w s d j t 0 7 ( h 3 n 2 ) 与所有参考毒株h a 蛋白上的受体结合位点的 氨基酸很保守，即9 8 、1 3 4 、1 3 6 、1 3 8 、2 2 6 位分别为t v r 、g l y 、s e r 、 a l a 、a s n 。s w s d j t 0 7 ( h 3 n 2 ) n a 基因长为1 4 1 3 b p ，编码4 7 0 个氨基 酸，与参考毒株的同源性在6 5 1 9 1 8 之间，n a 基因系统发生分析 表明s w s d j t 0 7 ( h 3 n 2 ) 与禽流感病毒h 3 n 2 亚型亲缘关系最近。 s w s d j t 0 7 n a ( h 3 n 2 ) n a 蛋白与参考毒株的颈区6 3 、6 4 、6 5 位置均 无氨基酸缺失现象，可推测其对病毒的复制能力不会有很大影响。 s w s d j t 0 7 ( h 9 n 2 ) h a 基因长度为1 7 0 1 b p ，编码5 6 6 个氨基酸， h a 0 切割位点序列为r - s s r - g ，属非高致病性毒株： s w s d j t 0 7 ( h 9 n 2 ) h a 蛋白有8 个糖基化位点，与参考毒株糖基化位 点数一致：s w s d j t 0 7 ( h 9 n 2 ) h a 蛋白有5 个受体结合位点，其中在 1 9 0 位氨基酸与其余参考毒株存在差异。s w s d j t 0 7 ( h 9 n 2 ) n a 基因 长为1 4 1 3 b p ，编码4 7 0 个氨基酸，s w s d j t 0 7 ( h 9 n 2 ) n a 蛋白基质 结合部与参考毒株一致，高度保守；s w s d j t 0 7 ( h 9 n 2 ) n a 蛋白有五 个抗原位点，s w s d j t 0 7 ( h 9 n 2 ) 在3 2 5 位为d 其余参考毒株均为n ， s w s d j t 0 7 与d c h b w i 0 4 、c k g s 2 9 9 位置在3 9 8 位为e ，其余 参考毒株为d 或n ：s w s d j t 0 7 ( h 9 n 2 ) n a 蛋白与c k s h f 9 8 、 d c h b wi 0 4 、c k g s 2 9 9 、s w g d w x l 0 4 、s w s d w 4 0 3 、 s w y n s i m a 0 2 0 7 一样在茎区6 3 ，6 4 ，6 5 位发生氨基酸缺失。 三株不同亚型s i vh a 基因与n a 基因克隆与序列分析 s w s d j t 0 7 ( h 9 n 2 ) h a 基因与参考毒株的同源性在8 2 5 一9 8 6 之 间，n a 基因与参考毒株的同源性在8 2 2 一9 9 1 之间。 s w s d j t 0 7 ( h 9 n 2 ) h a 基因与n a 基因系统发生分析表明 s w s d j 1 加7 与a h 9 n 2 亚型亲缘关系密切。 s w s d j t 0 7 ( h 1 n 1 ) h a 基因长为1 7 0 1 b p ，编码5 6 6 个氨基酸： h a 蛋白切割位点为i p s i q s rig 属于非高致病性毒株；h a 蛋白有8 个糖基化位点，其中有6 个在h a l 蛋白上，有2 个在h a 2 蛋白上，与 个别参考毒株糖基化位点个数不同；h a 蛋白上的受体结合位点除个别 参考毒株在1 9 0 位不有所不同。s w s d j t 0 7 ( h 1 n 1 ) n a 基因长为 1 4 1 0 p ，编码4 6 9 个氨基酸；n a 基因颈部未发现氨基酸缺失现象；n a 蛋白的头部有五个可能的抗原位点i 、i i 、i 、和v 五个区段组成， 在3 4 0 位、3 4 6 位、3 6 6 位分别为p 、i 、n ，其余参考毒株在相应位置的 氨基酸分别为s 、v 、s ；n a 蛋白共有8 个糖基化位点，与个别参考 毒株的糖基化个数不同。根据h a 基因、n a 基因系统发生树分析，说 明s w s d j t 0 7 ( h 1 n 1 ) 与2 0 0 9 年全球范围内爆发的h 1 n 1 甲型流感病 毒的几个参考毒株亲缘关系较远，不属于同一分支；根据n a 基因系 统发生分析表明s w s d j t 0 7 ( h 1 n 1 ) 与h 1 n 1 亚型禽流感病毒亲缘关系 最近。 本实验通过对三株不同亚型s i vh a 基因与n a 基因序列分析， 为进一步防控s i v 的流行提供了分子流行病学资料。 关键词：猪流感病毒：h a 基因；n a 基因；克隆；序列分析 2 山东农业大学硕士学位论文 a b s t r a c t t w op a i r so fp r i m e r sw e r ed e s i g n e db a s e do nh ag e n e sa n dn a g e n e so f t h es t r a i n so f t h eh 3 n 2 、h 9 n 2 、h 1 n 1s u b t y p eo f i n f l u e n z a v i r u sa c c o r d i n gt og e n b a n k s w i n ei n f l u e n z av i r u sh 9 n 2j i n a ni s o l a t e ( s w s d j t 0 7 ) a st e m p l a t e ，t h eh ag e n ea n dn ag e n ew e r ea m p l i f i e d w i t hr t - p c r ，w h i c hw e r ec l o n e di n t op m d18 tv e c t o r , s e q u e n c e da n d a n a l y z e d t h er e s u l ti sr e p o r t e da sf o l l o w s ： a sar e s u l t ，t h eo r ：o ft h eh a g e n eo fs w s d j t 0 7 ( h 3 n 2 ) w a s 17 01 b pa n de n c o d e d5 6 6a m i n oa c i d s t h ea m i n oa c i ds e q u e n c ea t h a 0c l e a v a g es i t ei ns w s d j t 0 7w a sp e n q t r 、【gw h i c hi s n o n - h i g h l yp a t h o g e n i c t h e r ew e r et h es e v e ng l y c o s y l a t i o ns i t e si nt h e h a p r o t e i n so fs w s d j t 0 7 ( h 3 n 2 ) s w | 鼬| n | q 7 ( h 3 n 2 ) h ah a v e t h eg a m ee c e p t o rb i n d i n gs i t e s ，t h e9 8 t hi st y r , t h e13 4 t hi sg l y , t h e 13 6 t hi ss e r , t h e13 8 t hi sa l a , t h e2 2 6 t hi sa s n t h eo r fo ft h en a g e n e o fs w s d j t 0 7 ( h 3 n 2 ) w a s1413b pa n de n c o d e d4 7 0a m i n oa c i d s 1 1 l e6 3 t h ，6 4 t ha n d6 5 t ha m i n oa c i dr e s i d u e sw e r en o tf o u n dd e l e t e di n t h en ap r o t e i n ，n en u c l e o t i d eh o m o ! o g i e so ft h eh ag e n e sb e t w e e n s w s d j 1 0 7a n dt h er e f e r e n c es t r a i n sw e r ef r o m 6 5 2 一81 8 ，t h e i d e n t i t yo ft h en ag e n e sf r o m6 5 1 - 9 1 8 ，o nt h eb a s i so fh ag e n e a n dn ag e n ep h y l o g e n e t i ea n a l y s i s ，i t i m p l i e d t h a ts w s d j t 0 7 ( h 3 n 2 ) a n dt h ea v a i ni n f l u e n z av i r u sh 3 n 2s u b t y p eh a dt h en e a r e r i n h e r i td i s t a n c e a sa r e s u l t ，t h eo r fo ft h eh ag e n eo fs w s d j t 0 7 ( h 9 n 2 ) w a s 17 01 b pa n de n c o d e d5 6 6a m i n oa c i d s 1 1 1 ea m i n oa c i ds e q u e n c ea t h a 0c l e a v a g es i t ei ns w s d j t 0 7 ( h 9 n 2 ) w a sr s s r - gw h i c hi s n o n h i g h l yp a t h o g e n i c t h e r ew e r et h es a m ee i g h tg l y c o s y l a t i o ns i t e si n t h eh ap r o t e i n so fs 榭| s d | n | m ( h g n 2 ) a n dt h er e f e r e n c es t r a i n s s w | s d | n | 蚋( h 9 n 2 ) h ah a v ef i v er e c e p t o rb i n d i n gs i t e s 。b u tt h e 19 0 t ha m i n oa c i dr e s i d u ed i f f e r e n c e db e t w e e ns w s d j t 0 7 ( h 9 n 2 ) a n dt h er e f e r e n c es t r a i n s t h eo r fo ft h en a g e n e o f 3 三株不同亚型s i vh a 基因与n a 基因克隆与序列分析 s w s d j t 0 7 ( h 9 n 2 ) w a s14 13b pa n de n c o d e d4 7 0a m i n oa c i d s t h e a m i n oa c i ds e q u e n c ei nt h en ap r o t e i nm a t r i xw a sv e r yc o n s e r v a t i v e a m o n gs w s d | 3 t 0 7 ( h 9 n 2 ) a n dt h er e f e r e n c es t r a i n s t h e r ew e r ef i v e a n t i g e n i cs i t e si nt h en ap r o t e i n t h e3 2 5 t ha m i n oa c i dr e s i d u ew a sd i n s w s d j t 0 7 ( h 9 n 2 ) a n dw a sni nt h er e f e r e n c es t r a i n s ，t h e3 9 8 t h a m i n oa c i dr e s i d u ew a sei ns w s d 汀0 7 d c h b w i 0 4a n d c k g s 2 9 9a n dw a sdo rni nt h eo t h e rs t r a i n s t h e6 3 t h 6 4 t ha n d 6 5 t ha m i n oa c i d r e s i d u e sw e r ed e l e t e di nt h en ap r o t e i no f s w s d j 1 0 7 ，c 列s h f 9 8 ，d c h b w i 0 4 ，c l c s 2 9 9 ， s w g d w x l 0 4 s w s d ，w 4 0 3a n ds w 厂、1 、i s i m a 0 2 0 7 t i l e n u c l e o t i d eh o m o l o g i e so ft h eh a g e n e sb e t w e e ns w s d j t 0 7a n dt h e r e f e r e n c es t r a i n sw e r ef r o m8 2 5 t o9 8 6 ，t h ei d e n t i t yo ft h en a g e n e sf r o m8 2 2 t o9 9 1 o nt h eb a s i so fh ag e n ea n dn ag e n e p h y l o g e n e t i ca n a l y s i s ，i ti m p l i e dt h a t s w s d j t 0 7a n dt h ea v a i n i n f l u e n z av i r u sh 9 n 2s u b t y p eh a dt h en e a r e ri n h e r i td i s t a n c e a sar e s u l t , t h eo r fo ft h eh ag e n eo fs w s d j t 0 7 ( h 1 n 1 ) w a s17 01b pa n de n c o d e d5 6 6a m i n oa c i d s t h ea m i n oa c i ds e q u e n c ea t h a o c l e a v a g es i t ei ns w s d j t 0 7 ( h 1 n 1 ) w a si p s i q s r lgw h i c hi s n o n - h i g h l yp a t h o g e n i c t h e r ew e r ee i g h tg l y c o s y l a t i o ns i t e si nt h eh a p r o t e i n sw h i c hw e r ed i f f r e n c ef r o mt h er e f e r e n c es t r a i n s , t h e r ew e r es i x s i t si nt h eh a lp r o t e i n sa n dt w os i t si nt h eh a 2p r o t e i n s ，s w s d ，j t 0 7 ( h1n1 ) h ah a v et h es a m er e c e p t o rb i n d i n gs i t e s ，b u tt h e19 0 t ha m i n o a c i dr e s i d u ed i f f e r e n c e db e t w e e ns w s d j t 0 7 ( h 1 n 1 ) a n dt h e r e f e r e n c es t r a i n s t h e0 r fo ft h en ag e n eo fs w s d j t 0 7w a s1 4 1 0 b pa n de n c o d e d4 6 9a m i n oa c i d s t h ea m i n oa c i ds e q u e n c ei nt h en a p r o t e i nm a t r i xw a sv e r yc o n s e r v a t i v ea m o n gs s d n m 僻1 n 1 ) a n d t h er e f e r e n c es t r a i n s t h e r ew e r ef i v ea n t i g e n i cs i t e si nt h en ap r o t e i n ， t h e3 4 0 t ha m i n oa c i dr e s i d u ew a spi ns w s d j t 0 7 ( h 1 n 1 ) a n dw a ss i nt h er e f e r e n c es t r a i n s ，t h e3 4 6 t ha m i n oa c i dr e s i d u ew a si i 1 1 s w s d j t 0 7 ( h i n i ) a n dw a svi nt h er e f e r e n e es t r a i n s ，t h e 3 6 6 t h 4 、 一 山东农业大学硕士学位论文 a m i n oa c i dr e s i d u ew a sni ns w s d j t 0 7 ( h 1 n 1 ) a n dw a ssi nt h e r e f e r e n c es t r a i n s ；t h e r ew e r ee i g h tg l y c o s y l a t i o ns i t e si nt h en a p r o t e i n sw h i c hw e r ed i f f r e n c ef r o mt h er e f e r e n c es t r a i n s ；o nt h eb a s i s o fh ag e n e ，n ag e n ep h y l o g e n e t i ca n a l y s i s ，i ti m p l i e dt h a t s w s d j t 0 7 ( h 1 n 1 ) a n dt h ei n f l u e n z aa v i r u sn o tb e l o n gt ot h es a m e b r a n c h ；o nt h eb a s i so f n a g e n ep h y l o g e n e t i ca n a l y s i s ，i ti m p l i e dt h a t s w s d j t 0 7 ( h 1 n 1 ) a n dt h ea v a i ni n f l u e n z av i r u sh 1 n 1s u b t y p eh a d t h en e a r e ri n h e f i td i s t a n c e t h i se x p e r i m e n to nt h r e ed i f f e r e n ts u b t y p e so fs i vh aa n dn a g e n es e q u e n c ea n a l y s i s ，t h ep r e v a l e n c eo fs i vi no r d e rt of u r t h e r c o n t r o lt h em o l e c u l a re p i d e m i o l o g i c a ld a t ap r o v i d e k e y w o r d s ：s w i n ei n f l u e n z av i r u s ；h ag e n e ；n ag e n e ；c l o n i n g ； s e q u e n c ea n a l y s i s 5 三株不同亚型s i vh a 基因与n a 基因克隆与序列分析 引言 猪流感( s w i n ei n f l u e n z a , s i ) 即猪流行性感冒，是由猪流感病毒 ( s w i n ei n f l u e n z av i r u s ，s i v ) 感染猪引起的，由一系列抗原结构可变的a 型流感病毒引起的猪急性呼吸系统疾病，在流感病毒侵袭猪群的近9 0 年 里，猪流感给全世界的养猪业带来了灾难性的损失【l j 。 1 9 1 8 年，北美、匈牙利和中国都报道了猪流感h 1 n 1 ，它可能是引 起1 9 1 8 年人类流感爆发的病原【2 1 导致2 0 0 0 - 4 0 0 0 万人口死亡。1 9 3 1 年 s h o p e 分离鉴定了第一株s i v 3 j ；1 9 7 6 年，可能是由于从美国将猪运输到 意大利，使得h 1 n 1s i v 亚型在欧洲大陆开始广泛流行：1 9 7 9 年，完整 的禽流感病毒h 1 n 1 传到猪，与古典的猪流感病毒h 1 n 1 的病原性不同， 而且现在还一直在猪群中流行。1 9 8 4 年，人流感病毒h 3 n 2 和禽流感病 毒h 1 n 1 重组成新毒株h 3 n 2 ，其中禽的内部基因未发生变，h 3 n 2 第一 次成为人畜共患病；1 9 8 9 年，欧洲禽源猪流感病毒h 1 n 1 成为主要的流 感毒株，并引起广泛传播：1 9 9 2 1 9 9 3 年禽源猪流感病毒h 1 n 1 亚型在香 港广泛传播；1 9 9 4 年，在香港首次从猪上分离到h 1 n 2 ，人。禽重组病毒 【4 ，5 】；1 9 9 8 年，在亚洲人和猪上分离到h 9 n 2 亚型流感病掣6 1 ，很明显禽 源流感病毒在猪上已经适应；2 0 0 2 年，在欧洲，发现了禽源h 1 n 1 猪流 感病毒，类人的h 3 n 2 重组毒株和h 1 n 1 毒株的三重配体；2 0 0 9 年3 月以 来，包括墨西哥、美国、加拿大、中国等国在内的许多国家发生了甲型 h 1 n 1 流感病毒【7 - 9 】。引起此次流感疫情的a h 1 n 1 流感病毒是猪流感病 毒的一种新型变异株，具有来自猪、禽类和人类的基因片段，是人流感 病毒、北美洲禽流感病毒，以及北美洲、欧洲和亚洲猪流感病毒的混合 体【1 0 0 3 1 ，目前已发现h 1 n 1 、h 1 n 2 、h 1 n 7 、h 2 n 3 、h 3 n 1 、h 3 n 2 、h 3 n 3 、 h 3 n 6 、h 4 n 6 、h 5 n 1 、h 9 n 2 等十一种s i v 、s i e 型1 1 4 1 。s i v 在猪群中的流行 日趋严重，血清学和病毒学监测显示，h 1 和h 3 亚型s i v 在我国猪群中广 泛流行，并且h 9 n 2 亚型s i v 在猪群与人群中的流行也呈上升趋势1 1 5 ，1 6 】。 s i v 是规模化养猪场普遍存在且难以根除的猪的群发性疾病，不仅 可直接引起患猪死亡，而且使患猪生产性能下降，恢复缓慢，推迟上市， 直接影响猪群健康状态和猪肉的质量，对养猪业危害极大。据统计，我 国养殖业每年因动物疫病死亡造成的直接经济损失为2 6 0 3 0 0 亿人民 6 山东农业大学硕士学位论文 币，而由于生产性能下降，饲料、人工浪费及药物消耗等所造成的直接 经济损失高达8 0 0 多亿人民币。更值得重视的是，猪流感病毒是“猪呼 吸道病综合征”的原发性致病原之一，由于猪流感病毒对呼吸道上皮具 有高度特异亲嗜性而使呼吸道上皮管壁受损伤，导致胸膜肺炎放线杆 菌、嗜血杆菌、巴氏杆菌、猪2 型链球菌、猪呼吸道冠状病毒( p r c v ) 、 猪呼吸一繁殖障碍综合征病毒( p l m s v ) 等其他呼吸道细菌和呼吸道病 毒的继发或混合感染，使疫情更为复杂，病情加重，死亡率增高，由此 引起的经济损失更是无法估量。 大量的研究结果表明，猪的种间屏障较低，具有最大限度被人流感 病毒和禽流感病毒感染的能力，猪在“禽。猪人 的种间传播链中，扮 演着流感病毒中间宿主及多重宿主的角色，在人和动物流感的病原学、 生态学及流行病学中占有举足轻重的地位，具有重要的公共卫生意义， 因此对s i 的监测和研究，已成为动物流感和人类流感预警预报系统的重 要组成部分。通过对本实验室保存的三种不同亚型s i vh a 基因、n a 基 因进行序列分析，结果表明这三株s i v 属于非高致病性毒株，通过同源 性比较分析表明这三株s i v 均与禽源流感病毒的同源性较高。并且分别 对其裂解位点、糖基化位点、抗原位点等进行了分析，为s i v 的研究提 供了丰富的分子流行病学资料为进一步深入研究猪流感打下了坚实的 基础。 1 1s l y 的病原学特征 流感病毒属正粘病毒科，流感病毒属，分为a 、b 、c 三型。这三个 型的病毒无共同抗原，在致病性和基因组结构上也有较大差异，其中a 型流感病毒宿主范围最大，危害也最为严重，它可感染人、猪、马、海 洋哺乳动物、禽类等。猪流感病毒( s w i n ei n f l u e n z av i r u s ，s ) 属于正 粘病毒科a 型流感病毒，也有研究表明存在c 型s i v 成员，系线状单链负 股r n a 病毒。病毒的直径为8 0 1 2 0 n m ，平均为1 0 0 n m 左右。病毒粒子 有从宿主细胞膜获得的囊膜，可分为内膜蛋白、类脂和糖蛋白三层【l 7 1 。 1 2s i v 亚型的分类 h a 和n a 是流感病毒亚型划分的主要依据。根据表面糖蛋白血凝素 ( h a ) 和神经氨酸酶( n a ) 的抗原性不同，可将a 型流感病毒分为不 7 三株不同亚型s l yh a 基因与n a 基因克隆与序列分析 同的亚型：h 有h 1 h 1 6 ，n 有n 1 - n 1 0 ，目前已经分离到的流感病毒有1 5 个h a 亚型和9 个n ab - n 7 型【1 9 】，h a 与n a 的比例为4 ：1 至5 ：l 。由于它们在病 毒的抗原性的决定性作用。在描述一个病毒株时要加上它们的型别，“h 代表血凝素，“n ”代表神经氨酸酶，其后面的数字代表不同的亚型。 根据流感病毒感染的对象，可以将病毒分为人类流感病毒、猪流感病毒、 马流感病毒以及禽流感病毒等类群，根据核蛋白( n u c l e o p r o t e i n ，n p ) 的 抗原性不同可以分为三类：甲型( a 型) 流感病毒：甲型抗原变异性最强，感 染哺乳动物( 人类、猪、雪貂、马) 以及鸟类，引起中、重度疾病，侵袭 所有年龄组人群，甲型病毒最常见也易引起世界大流行及地区流行。 1 3s i v 的特性 1 3 1s i v 理化特性 s i v 对外界环境的抵抗力不强，对高温、紫外线、各种消毒药敏感， 容易被杀死。一般条件下s i v 热稳定性较差，其活性丧失的先后顺序为 感染性、n a 酶活性、h a 活性，比如在4 4 0 条件下，感染性极易丧 失：1 0 4 0 2h 以上，红细胞凝集活性极易丧失；病毒对干燥和低 温的抵抗力强大，7 0 可保存数年，冷冻干燥后4 可长期保存f 2 0 1 。由 于s i v 为有囊膜病毒，故对乙醚、丙酮等有机溶剂敏感。在自然条件下， 存在于鼻腔分泌物和粪便中的病毒，由于受到有机物保护，具有极大抵 抗力。 1 3 2 p h 值 病毒在p h 7 0 7 8 范围内比较稳定，p h 3 0 以下或p h l 0 0 以上感染力 很快被破坏；p h 5 0 左右能使s i v 血凝素蛋白结构发生改变其h 链h a 2 区溶血序列裸露，使红细胞发生溶解【2 l 】。 1 3 3 血凝特性 血凝特性是s i v 的一个重要的生物活性，其血凝谱相当的广泛。在 一定的条件下，s i v 能凝集鸡、豚鼠、大鼠、小鼠、兔、牛、人等红细 胞。但病毒的血凝活性并不一致，同一亚型不同毒株，同代次病毒的 血凝价相差很大。s i v 的血凝活性容易破坏，大多数情况下，血凝素均 为热不稳定性。 1 3 4 增值特性 8 产 山东农业大学硕士学位论文 多种动物细胞对s i v 具有较高的感受性，这些细胞包括犬。肾细胞， 犊牛肾细胞、胎猪肺细胞、猪肾细胞、鸡胚成纤维细胞、人二倍体细胞 和常氏结膜细胞等。通过研究表明鸡胚对s i v 的易感性明显高于细胞。 因此，分离病毒时，病料通常接种于9 1 1 日龄的鸡胚。病毒接种细胞， 也能产生细胞病变( c p e ) ，表现为圆缩和脱落。然而连续传代，病毒 对细胞的感染性会降低，故流感疫苗的生产，通常都采用鸡胚培养。 1 4s i v 的分子生物学特性 s i v 属于单股负链r n a 病毒，基因组由大小不等的8 个独立片段组 成，编码l o 种蛋白。所有的基因片段中，5 端的前1 3 个核苷酸都相似， 即：3 - g g a c a a a g a u g a p p p 一5 3 端的1 2 个核苷酸也高度保守，即： 3 - o h u c g u c u u u c g u c c 5 ，1 2 2 j 。近来已根据这个发现合成了流感病 毒的通用引物，大大方便了流感病毒的基因研究和分析。同时发现了3 和5 末端呈部分互补，这样就形成了锅柄状。这种锅柄状结构对病毒r n a 多聚酶结合是必须的。每个节段都由囊膜下的核蛋自( n p ) 包裹，在其 3 端与3 种r n a 依赖性的聚合酶蛋白p a 、p b l 、p b 2 分子组成的核糖核蛋 白复合体( r i b o n u c l e o p r o l e i n ，r n p ) 相连构成病毒的蛋白壳，核衣壳呈 螺旋对称。在囊膜表面有许多放射状密集排列的纤突。纤突长度约为 1 2 1 4 n m ，分为两类，分别由三聚体的血凝素( h a 分子和四聚体的神 经氨酸酶( n a ) 分子构成，二者在囊膜上的比例约为1 5 ：4 ，并且差别很 小，很难通过电镜观察加以区分。病毒粒子的中心还有一直径为4 0 6 0 n m 的高电子密度的锥状核心，即由病毒的核酸构成的芯髓。 1 4 1 血凝素( h e m a g g l u t i n i n ，h a ) 血凝素( h e m a g g l u t i n i nh a ) 是流感病毒主要的表面糖蛋白，也是 主要的免疫原性蛋白。属于典型的i 型糖蛋白。h a 含有4 个结构域：信号 肽、胞浆域、跨膜域和胞外域。n a t i o n a l 和h a 2 亚单位组成，h a l 由3 2 8 个氨基酸组成，具有与宿主细胞受体结合的特性；h a 2 f l j 2 2 1 个氨基酸组 成，是参与和细胞融合的重要亚单位【2 3 1 。h a 以三聚体的形式镶嵌在双 层类脂膜上，每个h a 单体可分成两部分，一部分由h a l 构成的球形头部， 含有受体位点和抗原决定簇；另一部分为柄，由h a l 和整个h a 2 组成， 插入囊膜。h a 受体是位于细胞膜上的唾液酸糖脂和唾液酸糖蛋白，而 9 三株不同亚型s i vh a 基因与n a 基因克隆与序列分析 s i v 的h a 头部最外面是半乳糖，半乳糖和细胞膜上的受体相结合，从而 使s i v 感染细胞。h a l 和h a 2 是感染细胞的先决条件 2 4 , 2 5 1 ，h a 裂解与否 不影响病毒的吸附，s i v 借其h a 球部的受体结合位点与宿主靶细胞表面 特异性受体唾液酸的相互作用吸附于细胞表面，吸附后发生吞饮作用， 形成吞噬体。s i v 感染细胞后，s i v 的h a 2 的n 端融合序列 ( n g l y l e u p h e g l y a l a - i l e a l a - g l y p i l e i l e g l u - ) 裸露出来并与细胞质 膜发生融合，病毒基因组释放到细胞浆内，开始病毒复带l j 2 6 , 2 7 ， h a 蛋白是流感病毒最主要的表面抗原，变异最快，能诱导机体产 生相应的中和抗体，流感病毒的流行与h a 的变异关系极为密切i ，2 引。流 感病毒的致病性取决于宿主与病毒之间的关系。病毒的不同基因节段在 决定病毒致病性方面有着不同的作用，其中起重要作用的是h a 蛋白。 首先，h a 可裂解性的大小决定了流感病毒毒力的强弱。其次，以对蛋 白酶切割的敏感性也直接影n 1 - j n 病毒的毒力，易于切割者毒力强，反之 则弱。而其切割性又主要受h a 切割位点结构的影响，如切割位点插入 特殊的碱性氨基酸序列( 细胞的某些r n a 片段插入队造成的) 或插入细 胞的多肤序列均可增强其对切割酶的敏感性。即使突变氨基酸不在切割 位点附近，也可通过影响其立体构型而改变其对切割酶的敏感性。所以 说，h a 切割位点的结构可以通过影响h a 对蛋白酶切割的敏感性而间 接影响病毒的毒力。另外，切割位点附近的糖链也可影响其对蛋白酶切 割的敏感性。糖链的存在，一方面可能提高流感病毒对细胞受体上的唾 液酸残基的亲和性，使得病毒以更快的方式侵入宿主细胞以及从细胞中 释放出来，便于其在不同的组织中扩散和复制，增强病毒的毒力；另一 方面，糖链可改变流感病毒的抗原特性，抑制部分宿主体内抗体的中和 作用。缺失h a 切割位点附近的糖链，可以导致h a 切割酶的敏感性提 高，从而增强致病力；切割位点附近碱性氨基酸增加，能减弱糖链的空 间屏障作用，因此也可以增强其对切割酶的敏感性，进而增强病毒的致 病力。h a 的裂解性受裂解位点处的氨基酸序列和位点附近糖基化的影 响。低致病力毒株在裂解位点处只有一个碱性氨基酸精氨酸( r ) ，而 高致病力毒株有多个碱性氨基酸。另外，野外分离的流感病毒经过培养 会适应新的宿主，同时其致病性也会改变。发生这种改变的原因之一同 l o 山东农业大学硕士学位论文 样是野毒株在适应过程中其h a 对蛋白酶切割的敏感性出现了改变可 见，h a 对蛋白酶切割的敏感性在影响病毒毒力方面起到的作用是不可 忽视的。 1 4 2 神经氨酸酶( n e u r a m i n i d a s e ，n a ) 神经氨酸酶( n a ) 也是构成病毒囊膜纤突之一，与h a 相反，它属 于i i 类糖蛋白，是病毒粒子表面的另一种重要的抗原【2 9 】。n a 包括4 个结 构域：6 个氨基酸的氨基端胞尾、大约2 9 个氨基酸的非极性跨膜区、大 约2 8 个氨基酸的茎部以及3 9 0 个氨基酸的头部序列。n a 的氨基酸端胞浆 尾在检测的不同亚型中，都是一致的，n a 只有一个疏水区，其中6 个氨 基酸比较保守，其余的氨基酸变异较大。非极性跨膜区靠近n 末端，其 功能是将n a 固定在双层类脂膜上。n a 各亚型的茎部氨基酸的长度和序 列都有差别，有些毒株可缺失2 0 个氨基酸以上。s i v 的头部相对地保守， 不同亚型有很高的同源性，并且所有的病毒q a l y s 所在的位点一样。n a 头部的1 1 个保守氨基酸在三维结构中构成了n a 的酶活性中心。n a 能水 解红细胞表面受体特异性糖蛋白末端的n 乙酞神经氨基酸，使凝集到红 细胞的病毒解脱下来，或从感染的细胞中释放出来。另外，n a 可以阻止 病毒粒子的吸附，并增强病毒颗粒的释放网。最近的研究表明，n a 吸附 的牢固程度，以及n a 活性的发挥，关系到病毒是否以最佳的方式进行复 制【3 0 】。n a 的改变对病毒致病性也有一定的作用。n a 的酶活性能消化细 胞表面的唾液酸，避免病毒粒子聚集，有利于病毒释放【3 ，对病毒的扩 散能力有很大的影响；n a 的活性可被抗体和特异抑制物阻断，从而限制 病毒的复制【3 2 】，另外，病毒囊膜上的n a 还对其周围h a 的被切割力有影 响，进而影响病毒的致病力。n a 基因可以通过点突变、序列的插入或缺 失改变酶活性，影响病毒复制，使病毒适应新的宿主1 3 3 , 3 4 】，n a 不直接参 与病毒的装配及出芽。n a 还与病毒的宿主特异性及毒力有关，在决定宿 主范围方面起着一定作用。 1 4 3 核蛋白( n u c l e o p r o t e i n ，n p ) 核蛋白( n p ) 由病毒片段5 编码，大约为5 0 0 个氨基酸。它是病毒核 衣壳的主要蛋白成分【3 5 】，另外，n p 在病毒的表达和复制过程中对确定病 毒的宿主特异性方面起一定作用 3 6 , 3 7 j 。n p 蛋白比较保守，特异较强，是 三株不同亚型s i vh a 基因与n a 基因克隆与序列分析 划分流感病毒型的主要依据之一，可作为诊断抗原用于流行病学调查。 n p 是螺旋形核衣壳的主轴