（临床兽医学专业论文）伊维菌素单克隆抗体的研制与应用.pdf

中文摘要 阿维菌素类抗生素是一类应用广泛的广谱抗寄生虫药，主要包括阿维菌素 ( a v m ) 、伊维菌素( m ) i 多拉菌素( d v m ) 等。对体内线虫、体表寄生虫有 很好的疗效，常用作兽医临床治疗及饲料药物添加剂。然而不规范用药会引起畜 禽产品中药物残留，对人类的健康构成潜在威胁 国内外已经建立了多种检测伊维素残留的理化检测方法，虽然有些方法比较 灵敏、精确。但由于方法复杂、耗时长、花费大，技术要求高等原因丽不适合大 批量样品的筛选。作为一种灵敏、快速、特异性强的方法，酶联免疫吸附测定法 正逐渐应用于药物的残留检测。 为探索一种能够快速有效的检测伊维菌素残留的方法，本研究采用单克隆抗 体技术和酶联免疫吸附测定等技术，合成人工抗原，制备出抗伊维菌素单克隆抗 体，建立了检测m 残留的e l i s a 测定法。 通过琥珀酸酐法、e d c 法合成了i v m 的2 种人工抗原，用其中的w m - b s a 作为免疫抗原，通过杂交瘤技术获得l 株能稳定分泌抗m 特异性单克隆抗体的 杂交瘤细胞株3 d 8 。制备韵腹水效价为l ：3 2 0 0 0 ，蛋白浓度为1 8 7 m 咖l ，与其他 抗菌药物的交叉反应率均低于0 1 。 利用3 d 8 杂交瘤细胞株的小鼠腹水单抗建立了检测m 残留的间接竞争 e l i s a 方法。采用包被抗原稀释度l ：1 0 0 0 0 ，腹水抗体的工作浓度3 2 0 0 0 ，得到 标准曲线线性方程为y = 3 7 2 0 3 x 3 3 6 9 8 ( 1 0 2 0 0 0 n g m 1 ) ，半数抑制浓度为 2 0 0 n g m l ，检测限约为1 2 n g m l 。标准曲线的批内变异系数为8 8 7 ，平均批间变 异系数为8 7 2 。 初步应用于猪肝脏组织和肌肉组织的添加回收试验，样品经前处理后用于测 定。建立e u s a 标准曲线的线性方程为y 3 2 6 1 2 x - 2 3 4 4 5 ( 1 0 1 0 0 0 n g m 1 ) , 样 品回收率约为9 2 。 关键词；伊维菌素单克隆抗体 e l i s a回收试验 英文摘要 a b s t r a c t a v e r m e c t l n sa n t i b i o t i c sa r ef r e q u e n t l yu s e df o rk i l l i n gt h eb r o a ds p e c t r u ma f p a r a s i t e t m o s t l y i n c l u d i n ga v e r m e c t i n ( a r m ) ，i v e r m e c t i n ( i v m ) a n dd o r a m e c t i n ( d v m ) e t c t h e ya l eo f t e n u s e f u lf o rt r e a t i n ga n i m a ld i s e a s e si nv e t e r i n a r yc l i n i c a la n da d d i t i v e so fa n i m a lf e e d sa n dd r u g s h o w e v e r i l l e g a la d m i n i s t r a t i o nw i l ll e a dt or e s i d u e si ne d i b l et i s s u e s ，a n df i n a l l yd ol a t e n th a r mt o h u m a nh 明i t h m a n yc o u n t r i e sa n di n t e r n a t i o n a lo r g a n i z a t i o n sh a v ee s t a b l i s h e dm a n ym e t h o d st od e t e c t r e s i d u eo fi v m s o m em e t h o d sa r ep r e c i s e ra n dm o r es e n s i t i v e - b u tn o tt of i ts c r e e n i n gb a t c h s a m p l e sb e c a u s eo f c o m p l i c a t e dm e t h o d ，w a s t i n gt i m e th y p s i - c o s ta n dh o m o - t e c h n i q u e e l i s a t e c h n i q u ei sg r a d u a l l yb e e na p p l i c a t i n gt od e t e c tr e s i d u e so fm e d i c i n ea sam e t h o dw h i c hi s s e n s i t i v etf a s ta n dp o w e r f u ls p o c i f i c i t y f o re x p l o r a t i n gam e t h o dt h a te a n q u i c k l yd e t e c t i n gr e s i d u eo fi v e r m e c t i n ，t h i st e x t c o m p o s i t a dm a n - m a d ea n t i g e n ，p r e p a r e da n t i i v e r m e c t i n m o n o c l o n a la n t i b o d y ，f i n a l l y ， e s t a b l i s h e de l i s am e t h o df o rd e t e c t i n gr e s i d u e so fi v e r m e c t i n ，u s i n gm o n o c l o n a la n t i b o d y t e c h n i q u ea n de l i s at e c h n i q u e t w om a n m a d ea n t i g e n sf o ri v e r m e c t i nw e r es y n t h e s i z e df r o ms u c c i n i ca n h y d r i d e sm e t h o d a n de d c sm e t h o d u s e do n eo f m a n m a d ea n t i g e n sn a m e dl v m b s aa saa n t i g e nf o ri m m u n e ，a l i n e ( 3 d 8 ) w h t c he x c r e t e da n t i i v e r m e c t i nm o n o c l o n a ia n t i b o d yw a sg a i n e db yh y b r i d o m a s t e c h n i q u e t h ea b d o m i n a ld r o p s yw 鹊g o t a n dt h ep o t e n c yw a sl ：3 2 0 0 0 ；t h es a t u r a t i o no f p r o t e i n i na b d o m i n a ld r o p s yw a s1 8 7 m g m l ；t h er a t eo fc r o s s i n gr e a c t i o nw i t ho t h e ra n t i b a c t e r i a la g e n t s w a si o w t h a n0 1 n ec i e l i s a sm e t h o dw a sm e d eb yt h em o n o c l o n a ia n t i b o d yi f lt h ea b d o m i n a ld r o p s yw h i c h w a sg o tb yi n j a c t i n gh y b r i d o m a sc e l l sn a m e d3 d 8i n t ob a l b ，cm o u s e t h ec o n c r e = t em e t h o d ：t h e c o a t i n ga n t i g e nw a sa n e n u 删b y1 ：1 0 0 0 0a n dt h em o n o c l o n a la n t i b o d yi nt h ea b d o m i n a ld r o p s y w a sa r e n u a t e db v1 3 2 0 0 0 1 1 他t y p i c a lp l o te q u a t i o n sw a sy = 3 7 2 0 3 x - 3 3 6 9 8 ( 1 0 2 0 0 0 n g m 1 ) n e c o r r e l a t ep a r a m e t e r so ft h i se q u a t i o u sa sf o u o w ：l d 5 0w a sa b o u t2 0 0 n g m l ；t h el i m i tt od e t e c t i o n w a sa b e u t1 2 n g m l ；t h ec u e f f i c i e n to f d i f i e r e n t i a t i o ni ot h es a m eb a t c hw a s8 8 7 a n dt h ea v e r a g e c o e 伍c i e n to f d i f i e r e n t i a t i o na m o n go t h e rb a t c h e sw a s8 7 2 t h el i v e rt i s s u ea n dm u s c l et i s s u eo fs w i n ew e r ei n i t i a l l yu s e df o ra d d i t i o na n dr e c l a m a t i o n t e s t ，a n dt h es a m p l ew a sd e t e r m i n e da f t e rp r e p r o c e s s i n g f i n a l l y ，t h ei i n e 打e q u a t i o nw a s y - 3 2 6 1 2 x - 2 3 4 4 5 ( 1 0 1 0 0 0 n g ) , g o tb y c i e l i s a t h er e c o v e r yr a t e o f s a m p l e w a sa b o u t 9 2 k e y w o r d s ：l v e r m e c t i n ：m o n o c l o n a la n t i b o d y ；e l i s a ；r e c l a m a t i o nt e s t 符号说明 缩写 斟m s b s a c i e l i s a d m s o e d c e l l s a g c h p l c i e i l s a i g g - h r p i v m m s o v a p b s p b s t t l c t m b u h p n g m g u l m o l 几( m ) i l g m l h o d 4 5 0 c v 符号说明 中文名称 阿维菌素类 牛血清白蛋白 间接竞争e l i s a 二甲基亚砜 乙基二甲氨基碳二亚胺 酶联免疫吸附测定 气相色谱 高效液相色谱 间接e l i s a 辣根过氧化物酶标记免 疫球蛋白g 伊维菌素 质谱 卵清蛋白 磷酸盐缓冲液 磷酸盐一吐温缓冲液 薄层层析 四甲基联苯胺 尿素过氧化氢 纳克 毫克 微升 摩尔每升 微克每毫升 小时 4 5 0 n m 的光吸收值 变异系数 ， 英文名称 a v e r m e o t i n s b o v i n es e r u ma i b u r a i n i n d i r e c tc o m p e t i t i o ne l i s a d e m e 删s u l f o x i d e 1 - e t h y l 3 ( 3 - d i m e t h y l a m i n o p r o p y l ) c a r b o d i l m i d e e n z y m e 1 i n k e dl m m u n o s o r b e n ta s s a y g a sc h r o m a t o g r a p h y h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g t a p h y i n d i r e e te l l s a i m m u n o g l o b u l i n h o r s e r a d i s h p e m x i d a s e c o n j u g a t e i v e r m e c t i n m a s ss p e c t r o g r a p h o v a l b u m i n p h o s p h a t eb u f f e rs o d i u m p h o s p h a t eb u f f e rs o d i u m - t w e e n t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y t e t r a m e t h y l b e n z i d i n e u r e ah y d r o g e np e r o x i d ea d d u e t 嵋微克 g 克 m l 。毫升 g l 【g克每千克 l a g i 【g微克每千克 m i n分钟 s d标准差 r m i n转每分钟 陆江：伊维菌素单克隆抗体的研制与应用 ! 第一章前言 1 兽药残留的现状、危害及监控 兽药残留( v e t e r i n a r yd r u gr e s i d u e ) 是“兽药在动物性食品中的残留“的简 称，它是指动物在使用药物预防或治疗疾病后，药物的原形或其代谢产物可能蓄 积、储存在动物的细胞、组织、器官或可食性产品( 如蛋、奶) 中1 1 1 有的药物以 游离的形式残留于器官、组织，也有部分药物以结合形式存留于组织，这种与组 织蛋白结合的残留可能时间更长。 广义上的兽药残留除了由于防治疾病用药外，也可由于使用促生长饲料添加 剂、接触或吃入环境中的污染物，如重金属、霉菌毒素、农药等引起。 目前非法使用违禁药物、滥用抗菌药物和药物添加剂【2 l ，不遵守休药期的规 定以及工业鼍三废”、农药和有害生活垃圾的污染，有关部门对兽药残留的监督 管理不严、检测标准不健全等多方面原因，使得动物性产品中的兽药残留现象日 益严重眦。这不仅给人类的健康带来极大的危害，而且严重影响了我国动物性食 品的对外出口，造成巨大的经济损失 i i 我国兽药残留的现状 上个世纪9 0 年代初，我国畜禽产品开始进入国际市场，但由于药残超标而 被某些国家退货、销毁，甚至中断贸易往来。如：出口日本的肉鸡，由于“克球 粉”在肉鸡中残留超标，相继被退货和中断出口。出口法国的蜂蜜由于农药。杀 虫脒”残留超标而被退货。1 9 9 8 年4 月，从内地出口到香港的生猪，其内脏食 后导致1 7 人中毒，其原因是内脏中含有违禁药物“盐酸克伦特罗”。此外，我国 出口的畜禽产品还多次出现含安眠酮类、雌性激素、抗生素等药物残留超标而被 取消出口的事件。 在国内，一些文献报道了用国际t c c 法测定的我国部分地区市售鲜牛乳中抗 生素残留的情况。安增海1 9 9 7 年，张利琴1 9 9 9 年，常建军2 0 0 0 年测得西宁市 市售鲜牛乳中抗生素阳性率分别为2 、i i 7 和5 3 。国内“瘦肉精”( 盐酸克 伦特罗) 中毒事件时有发生，引起了中国人的普遍担心，据不完全统计，1 9 9 8 年 以来，相继发生1 8 起瘦肉精中毒事件，中毒人数达1 7 0 0 多人，死亡1 人。据一 些新闻记者调查。添加瘦肉精是养猪多年来的潜规则，而监管部门似乎无力遏制 我国是一个发展中国家。1 9 8 0 年以来，党和政府为解决城乡人民的菜蓝子， 曾采取一系列措施法促进养殖业发展，满足人民对动物源食品的量的需求，但对 残留未加以重视。残留的发生率及其对人体的危害一直是未知数，是一个潜在的 隐患 1 2 兽药残留的危害 尽管动物性食品中兽药残留水平大多较低，人们食用的数量有限，一般不易 2 扬州大学硕士学位论文 引起急性中毒( 除盐酸克仑特罗残留引起人急性中毒之外的其他例子是不多的) 。 但畜禽饲养过程中长期而大量的用药，尤其是非治疗目的用药，所导致的动物性 产品中药物残留对人类健康的影响是不容忽视的。许多兽药或添加剂都有一定的 毒性，如曾经广泛应用的氯霉素可引起再生障碍性贫血，氨基糖苷类抗生素有较 强的肾毒性等，青霉素类和磺胺类某些药物可引起过敏反应。目前，在残留毒理 学方面意义较大的药物主要包括：抗生素类、合成抗菌素类、抗寄生虫药、生长 促进剂和杀虫剂。其中抗生素和合成抗菌素类药物统称为抗微生物药物，是最主 要的药物添加剂，约占药物添加剂的6 0 4 1 。 1 2 1 兽药残留对人体健康的危害 药物残留对人类健康的危害作用，一般来说，并不一定表现为急性毒性作用。 但如果人经常摄入低剂量的同样残留物，在一段时间后，则可由于残留物在体内 的逐渐蓄积而导致各种器官病变，甚至癌变。某些过敏体质的个体，对有些药物 的敏感性比一般个体高，即使接触的药物残留量很低，也可能引起变态反应。 1 2 1 1 变态反应、过敏反应与细菌耐药性 兽用抗菌药物在动物体内残留蓄积，人食用这类动物产品除可发生中毒外， 还可引发过敏反应、变态反应，或使机体产生耐药性。有许多抗菌药如青霉素、 四环素、磺胺类等均有一定抗原性，可引起人们的过敏反应。青霉素具有强抗原 性。而且广泛应用于人和动物，因而具有极大的潜在危险性。过量使用抗生素或 其他抗菌药物会使敏感菌产生耐药性，侵药效下降。国内外许多研究认为，抗菌 药残留可以对人体胃肠道的正常菌群产生不良的影响，并通过长期接触这些低浓 度的药物引发病原微生物的耐药性，破坏微生态平衡。如今，无论是在动物体内， 还是在人体中，细菌的耐药性已经达到相当严重的程度l ，j 。 1 2 1 2 “三致”作用 现已发现许多兽药具有致畸、致癌和致突变作用。硝基咪唑类、硝基呋喃类、 喹嗯啉类、雌激素、砷制削等药物都已被证明具有“三致”作用，许多国家都已禁 止将这些药物用于食品动物。大剂量的磺胺二甲嘧啶( s m 2 ) 等磺胺类药可诱发 啮齿动物甲状腺增生，并有致肿瘤倾向( 6 】而目前磺胺类药物在牛、羊、猪等家 畜中的应用极为广泛，且药物代谢缓慢，半衰期长，是造成动物性食品兽药残留 的重要药物f 7 l 。苯丙咪唑类抗蠕虫药是国内常用的驱虫药，该药通过抑制细胞活 性杀灭蠕虫等多种肠道寄生虫，抗蠕虫效果良好。然而对于人体来说，其抑制细 胞活性的作用同时使其具有潜在的致突变性和致畸性例。除肾毒性外，链霉素琴 具有潜在的致畸作用，可引发动物体细胞突变，影响生育并造成遗传性疾病州 陆江：伊维菌素单克隆抗体的研制与应用 1 2 1 3 激素样作用 兽用激素类药物残留，会影响人体正常激素水平、功能，并有一定的致癌性， 可表现为儿童早熟、肥胖儿、儿童异性化倾向、肿瘤等。b 一肾上腺素受体激动 剂引发急性中毒，出现头痛、心动过速、狂躁不安、血压下降，国内外均有大规 模食物中毒案例【l o 】。己烯雌酚和己烷雌酚能扰乱激素平衡，导致妇女更年期紊乱、 儿童早熟、男性女性化、生育能力降低，诱发女乳腺癌卵巢癌等疾病【l l i 。我国农 业部已规定禁止将所有激素类及有激素类样作用的物质( 甲基睾丸酮、玉米赤霉 醇、醋酸甲孕酮等) 作为动物促生长剂使用。 1 2 2 对我国动物性食品出口贸易的影响 我国的肉类和禽蛋总产量现居世界第一位。人均占有量也已超过世界平均水 平。但是，我国畜产品在国际市场上缺乏竞争力，出口比例很低。这很大程度上 在于畜禽疾病、药物残留以及饲料和环境的污染等因素导致的产品质量较差。自 1 9 9 0 年以来，我国出口欧盟、日本、美国等国家的鸡肉、猪肉、兔肉等畜禽产 品，由于农药、兽药残留及重金属等有害物质超标，被拒收、扣留、退货、销毁、 索赔和中止合同的现象时有发生，甚至许多传统大宗出口创汇的畜禽产品被迫退 出国际市场l l q 1 9 9 5 1 9 9 6 年，欧盟经考察和评估认为，中国的兽医卫生状况 达不到欧盟指令要求，从而做出从1 9 9 6 年8 月1 日起禁止从中国进口禽肉的决 定，使我国禽肉出口失掉了欧盟市场【i 。2 0 0 2 年3 月4 日，我国运往留尼望岛” 的冻兔肉被检出含有抗生素，紧接着冻鸭肉中也检出含有氯霉素，荷兰政府将检 出问题的6 8 个中国货柜就地销毁，不仅造成了巨大的直接经济损失，而且对中 国畜禽产品的国际声誉也造成了十分恶劣的影响1 1 4 1 。 1 2 3 对药物开发和畜牧生产的影响 由于药物滥用，细菌产生耐药性的速度不断加快，耐药能力也不断增强，使 得抗菌药物的使用寿命逐渐缩短要求不断开发新的品种以克服细菌的耐药性， 从而增加了新药开发的压力：人类长期接触某种抗生素，可使机体体液免疫和 细胞免疫功能下降，以致引发各种病变，发生疑难病症；用药时产生不明原因的 毒副作用，使细菌耐药性增加，并给临床诊治带来困难；奶中抗生素的残留还会 导致以奶类为原料工业( 酸奶奶酪和其他牛奶产品) 的生产问题。抗生素的存 在影响生产菌的存活，干扰发酵奶制品的初始培养奶中抗生素残留导致酸奶和 奶酪发酵失败是生产中常遇到的问题。 1 2 4 对环境的危害 动物用药以后药物以原形或代谢物的形式随粪、尿等摊泄物排出，残留予 扬州大学硕士学位论文 环境中。进入环境中的残留兽药，在多种环境因子的作用下，可产生转移、转化 或在植物中富集，然后进入食物链而损害人体健康。兽药残留对环境的影响程度 取决于兽药对环境酌释放量及其在环境中降解的速率。有些抗生素在肉制品中降 解速度很慢，即使加热也不能使抗生素完全灭活，如链霉素类等。某些抗生素的 降解物具有更强的溶血作用和肝中毒作用。将含有兽药残留的废弃物随意放置、 丢弃、将对周围环境构成潜在威胁，如破坏土壤和水中的微生物平衡，引起生态 环境的失衡、造成环境的污染等。 1 3 兽药残留的监控 近几年来，照着生活水平逐渐提高，人们对动物性食品质量和安全的要求越 来越高，动物性食品中的兽药残留也越来越成为全社会共同关注的公共卫生问 题。兽药残留不但影响人类的身体健康，而且极大的阻碍了畜牧业的健康发展， 影响我国的出口贸易和国际形象。因此，我们应尽快地加强和完善对兽药残留的 监控工作，建立科学的动物性食品兽药残留监控体系，规范生产用药，减少残留， 从而提高我国畜禽产品在国际市场的竞争力，保护人体健康。 欧美等世界发达国家和地区于2 0 世纪6 0 年代就开始了兽药残留监控的研究 工作，制定了较为完善的兽药残留限量、休药期等法规标准【i “。美国农业部食 品安全检查署( f s i s ) 从1 9 6 7 年即开始制定国家年度残留监测计划( n r p ) 1 1 7 该年度计划列出了对美国国内的畜禽产品和进口畜禽产品的检测数量、检测重点 等，并根据动物所接触的化合物的潜在危险和对人体健康的影响，进行综合性评 价。1 9 9 6 年，欧盟农业部长理事会正式通过关于激素的一揽子规定措施，并于 1 9 9 6 年5 月以9 6 2 3 e c 指令在欧盟官方公报上发表。该指令具有严密性和可操 作性，明确规定了在畜牧业中禁止使用某些激素( 如1 ，2 二苯乙烯类，己烯雌 酚) 及促生长索或抑制甲状腺素作用的药物，并扩大到p 若奋剂等”此外， 欧盟还立法决定从2 0 0 6 年1 月起在动物饲料中全面禁止使用抗生素( 包括目前 允许在饲料中使用的四种抗生素) 我国的残留研究和监控工作起步较晚。随着我国加入世贸组织，兽药残留问 题进一步受到了政府及社会各界的高度重视。为加强兽药残留监测，向社会提供 安全卫生的动物性食品，提高人们的生活质量，国务院及有关部门已逐步制定了 有关法规和兽药残留检测方法。1 9 9 7 年以来，我国陆续出台了 饲料添加剂允 许使用品种目录、允许作饲料添加剂的兽药品种及使用规定、动物性食品中 兽药最高残留限量、饲料药物添加剂使用规范、食品动物禁用的兽药及其它 化合物清单，修订了兽药管理条例及饲料管理条例等，为我国兽药残 留监控工作奠定了基础。1 9 9 9 年我国发布了中华人民共和国动物与动物源性 食品残留物质监控计划，这是是我国第一份正式的药物残留监控计划。如今农 业部每年都会制定年度动物住产品中兽药残留监控计划，确定年度监控的动物务l 织及其残留兽药检测任务i i ”。 标准的检测方法是开展兽药残留监测及监督的前提。为促进监测监督工作的 顺利有效开展，应尽快研制出快速、准确、简便的检测方法。制定国家或行业标 陆江：伊维菌素单克隆抗体的研制与应用 准。目前我国已经制定了多个残留量检测方法和检测标准，如农业部于2 0 0 1 年 1 1 月发布的动物源食品中兽药残留检测方法，规定了包括呋喃唑酮、磺胺类 总残留及个别药物、氯羟毗啶、莫能菌素和盐霉素等l o 种药物残留的检测方法 弘”。2 0 0 3 年1 月2 2 日，农业部又发布了1 2 种动物性食品中兽药如拉沙洛西钠、 卡巴氧、硝基咪唑类等药物残留的检测方法。 我国今后将取消兽药地方标准，兽药注册也要重新分类。今后兽药的注册申 请将按国家标准的兽药申请、进口兽药申请和兽药补充申请( 如改变给药途径、 靶动物与剂型的兽药申请等) 来进行；兽药评审也将实行退审制和评审答辩，兽 药标准将实行暂行标准及标准转正制度。此外，还要继续制订兽药的休药期，严 格执行休药期规定。2 0 0 0 年版中国兽药典中只规定了3 0 种药的休药期，还 有大多数药物没有休药期的规定，从而导致了兽药的超量使用、延长使用，给兽 药残留的产生留下空间【2 l 】。因此，必须结合我国的制剂水平和用药方式制定兽药 使用休药期，并对已有休药期的药物或添加剂按规定严格执行。 动物性食品的安全关系到生产者、兽医科研人员、政府、教育部门等各方面， 尤其是兽药生产者和畜禽饲养者，必须首先具有安全生产动物性食品的自觉性和 商度的素质，正确选药，齐j 量疗程适当，合理的联合用药和轮换用药，既要保；牵 动物疾病的有效防治，又要保障对动物和人的安全，从源头上防止兽药残留，才 能有效控制或避免兽药残留对人类健康的影响。 1 4 兽药残留的检测方法 药物残留检测是实施药残监控的基本手段。与药品检测不同，药残检测的特 殊性和复杂性在于待测物的痕量、动态、浓度波动范围大，样品基质复杂、干扰 物质多，以及样品基质和待测组分有不确定性，要求分析技术具有灵敏度高、选 择性或分离能力强和线性范围宽等特点，传统意义上的化学分析方法通常不能独 立进行。药残分析技术自2 0 世纪6 0 年代以来发展迅速，成为农业化学、分析化 学中最活跃的研究方向之一。现阶段，色谱、质谱、电泳、免疫分析及联用技术 不断优化和日趋完善，使得兽药残留的检测工作逐渐简化。 兽药残留的检测是对复杂混合物中的痕量组分进行定性定量的技术。最初的 残留分析技术仅限于化学分析法、比色法和生物测定法，缺乏专一性、灵敏度低。 上世纪5 0 年代出现了薄层色谱( t l c ) ，使分析方法有所改进。6 0 年代后气相 色谱( g c ) ，高效液相色谱( i i p l c ) 等分析技术得到飞速发展，同时应用了许 多高灵敏的检测器，大大拓展了分析范围。直至现在，色谱法、光谱法及其联用 技术仍是兽药残留分析技术的主流，并围绕高分辨( 分离) 和高灵敏两大精髓发 展，以期能简化分析过程，提高分析效能，特别是多残留分析能力和降低成本叫 8 0 年代后，免疫分析法被逐渐应用于兽药残留分析，由于其具有常规理化分析 技术无可比拟的选择性和灵敏度，近年来，兽药残留免疫分析技术得到了国内外 广泛关注，几乎所有重要酌兽药都已建立或试图建立免疫分析方法。这些发展趋 势与兽药的日益广泛应用，种类和结构的日趋复杂及低剂量化密切相关。 我国目前常用的检测方法有微生物法、h p l c 法、酶联免疫吸附测定法 ! 扬州大学硕士学位论文 ( e l i s a ) 等等。近年来农业部相继发布的部分动物源食品中兽药残留检测方法 见表l l 表l2 0 0 1 年2 0 0 3 年农业部发布的部分动物源食晶中兽药残留检测方法 残要兽残留组织凳翼 检测限 残要兽 残留组织 芸翼 检测限 呋：畦：第h p 。l c ，l 纛o p g k 募g l蒜繁善t s 眺 簧翟篇h p l ，c ：。眺嚣蛳枷脏h p l c l 眺 磺胺二鸡肌肉、肝 鬻 鸡蛋h p l c 柳跳 甲；啶脏、肾脏 h p l c 2 0 帆 撤鼍邮l c ”如等舢脏h p l c 2 。眺 氯羟毗鸡肌肉，肝 星和环舫、肝脏、肾 h p l c ：! ? 二- 皑脏 h p l c ，0 飕他 丙沙里脏 。一 莫能德鸡肌肉、葵能菌素嘲i i 量艘鸡肌肉、脂嚼喹艘 素和盐脂肪、肝h p l c 5 0 i l g ，l 【g l 盐稀 和氟甲肪，肝脏，肾h p l c 2 0 t t g k g l 氟 霉素脏、肾脏 素l o o p g , k g 喹脏 甲喹2 0 雌, k g ， 纸色 1 胺苯甲h 脂肪、肝 ：。： 苯唑西鸡肌肉、肝谱法+ 1 5 0 i l g , k g 。醇脏，肾脏 一一 林脏，肾脏微生 1 9 3 p g ，k g 2 5 0 i t e a g 物法 苎肌竺：只触 青霉素鸡肌肉、肝微生 躺素舫? ? 、蒹5 0 0 眺 ，类脏，肾脏物法 1 0 蝤慨 肾脏 克笋猪尿e l i s a 忡g ，l青萎素 牛奶 簇 椭 8 竺翟巴_ 肝h p l j c 2 0 p 叶g 嚼喹酸 嚅喹艘 和氟f f i带皮鱼肌肉h p l c2 0 p 眺勘氟 曙啉脏，肾脏 9 喳 r f i 畦2 0 p e , k g 陆江：伊维菌素单克隆抗体的研制与应用! t 4 1 样品前处理 待测物的样品处理和检测是药物残留分析的两个基本主题。而由于动物性食 品中药物残留的痕量和生物基质的复杂性，使得样品前处理成为兽药残留分析过 程中的关键。目前已有的样品前处理方法有多种，除了传统的组织匀浆法、振荡 法、索氏提取法或液液萃取法外，又发展了多种新技术，包括固相萃取技术 ( s p e ) 、基质固相分散技术( m s p d ) 、超临界流体萃取技术( s f e ) 、免疫亲和 色谱技术( i a c ) 、分子印迹技术( m i p ) ，凝胶渗透色谱、膜分离技术等等 2 3 1 ， 在药物残留分析的应用中各有特点。 固相萃取利用固体吸附剂吸附液体样品中的耳标化合物，与样品的基体和干 扰化合物分离，通过洗脱达到分离和富集目标化合物的目的。固相萃取采用高效、 高选择性的吸附剂( 固定相) ，可以净化很小体积的样品( 5 0 1 0 0 “j ) j ，能显 著减少溶剂的用量，简化样品处理过程，减少费用。s p e 可用于复杂样品中微量 或痕量目标化合物的提取、净化、浓缩或富集，是目前兽药残留分析样品前处理 中的主流技术，贯穿于当前大部分残留检测方法中，现已发展出固相微萃取 ( s p m e ) 及微波萃取技术( m a e ) 。 基质固相分散是由b a k e r 等1 2 5 i 在1 9 8 9 年提出的一种快速样品处理技术，是 在s p e 的基础上改进的样品处理方法，依靠机械剪切力、c 1 8 键合相的去垢效 应和巨大的表面积使样品结构破碎并且在填料表面均匀分散，浓缩了传统的样品 前处理中所需的样品匀化、组织细胞裂解、提取、净化等过程，避免了样品匀化、 转溶、乳化、浓缩造成的待测物损失，而且固定相处理样品的比容量大，提取净 化的效率较高【2 6 1 。 当物质的存在温度和压力超过其临界温度和临界压力时，该物质通常处于超 临界流体状态。超临界流体具有特殊的热力学和流体动力学性质，用作流动相时 具有较高的分离效率，适用于分析热不稳定和高分子量化合物。在兽药残留分析 的样品前处理方面，s f e 与其它技术如溶剂萃取、蒸馏、常规柱色谱等相比，显 示了许多特点，如速度快、效率高、选择性强、几乎不消耗溶剂等优点，十多年 来，在环境监测、医药卫生、食品检验等领域得到广泛应用1 2 q 。 免疫亲和色谱技术是以免疫结合反应为基础的柱色谱技术。将抗体与惰性基 质偶联制成免疫吸附剂后装柱，当待测组分流经i a c 桂时，抗原与相应抗体选 择性结合，其余杂质则流出色谱柱。再利用适宜的洗脱剂将抗原洗脱，使样品得 到有效分离、净化和浓缩。i a c 的最显著优点在于对待测物的高效、高选择性保 留能力，特别适用于复杂样品极稀组分的净化与富集【2 02 射。i a c 柱再生处理后 可重复使用。多残留分析色谱( m i a c ) 和高效亲和色谱( h p i a c ) 是其发展方 2 9 1 1 4 2 仪器分析法 s 扬州大学硕士学位论文 目前的仪器分析法主要有气相色谱法( g c ) 、高效液相色谱法( h p l c ) 、超 临界流体色谱法( s f c ) 、毛细管电泳法( c e ) 以及气相色谱质谱联用技术 ( g c - m s ) 、液相色谱质谱联用技术( l c - m s ) 等各种联用方法。 g c 以气一液分配、气一固分配为原理，常甩于挥发性兽药的检测，如氯霉 素和氨基糖苷类抗生素，检测限一般为p g k g 级。但大多数兽药的极性或沸点偏 高，需要繁琐的衍生化步骤，从而限制了g c 的应用。 几乎所有的化合物，包括高极性离子型待测物和大分子物质，均可以用 h p l c 进行测定。h p l c 的分离机制与常规柱色谱相同，但填料更加精细( 西5 1 0 “m ) ，需高压泵推动，柱效高( 1 0 3 塔板m ) ，速度快，实现了操作自动化，降 低了检测限，缩短了检测周期。其中反相h p l c 发展最快，日前已成为大多数兽 药残留的常规分析方法。h p l c 法可用于半挥发性、非挥发性、极性以及热不稳 定性物质的分析，是兽药残留定量、定性分析的有效手段m ”l 。 超临界流体色谱是一种介于气相色谱和高效液相色谱之间的色谱技术。揉合 了g c 的高速度、高效率和h p l c 的选择性强、分离效能高等优点，从而为分析 有机化合物开辟了新的途径。s f c 可配备g c 、h p l c 的各种检测器，可在较低 温度下分析分子量较大、对热不稳定、低挥发性的化合物h 2 1 。 毛细管电泳是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各 组成之间的淌度和分配行为上的差异而实现分离的分析技术，适用于分析离子型 和手性化合物。该技术操作简单，分析速度快，具有很高的分离效率，可达几百 万个理论塔板数。c e 与一定的检测器搭配使用可达到较高灵敏度，目前应用较 多的有紫外可见检测器、质谱、电化学检测器等p ”已有c e - m s 测定8 种磺胺 药的报道。 各种分析技术联用是现代兽药残留分析乃至整个分析化学方法上的发展特 点。计算机的应用加速了这一趋势。联用技术可扬长避短，一般兼分离、定量和 定性( 分予结构信息) 于一体，因而特别适用于确证性分析常见的联用技术， 如t l c m s 、g c m s 、l c m s 、c z e m s 、l c n m r 、s f c m s 等。其中l c m s 现在已较广泛地应用于药残检测中，其灵敏度较荧光检测器高1 个数量级，能方 便地对n g 级的兽药残留组分进行检测与结构确证1 3 4 ”】 t 4 3 免疫检测技术 免疫分析技术( t a s ) 是以抗原抗体的结合反应为基础的分析技术，是2 0 世 纪八、九十年代优先研究开发和利用的兽药残留分析技术之一，其特点是特异性 高，灵敏、快捷、简单，可以大大简化甚至省去前处理过程，不需要贵重仪器， 对操作人员的技术要求不高，容易普及和推广。免疫分析有多种类型，包括酶免 疫测定法( e i a ) 、荧光免疫测定法( f i a ) 、胶体金免疫测定法( c g i a ) 、免疫 传感器、免疫苍片、流动注射免疫分析法( f i i a ) 等口“，近来还有人尝试将纳米 技术应用到免疫检测中1 3 “”j 。 酶免疫测定法使用酶进行标记，在残留分析中最常用的是酶联免疫吸附试验 ( e i ! i s a ) 。通过免疫动物制备针对小分子化合物的特异性抗体，利用抗原抗体 陆江：伊维菌素单克隆抗体的研制与应用! 的特异性反应和酶标记物的放大作用，对样本中的微量小分子化合物进行定量测 定具有灵敏、特异、简便快速、成本低等特点，在动物性食品、农产品、土壤 和人体内药物分析、激素测定等方面有较多成功应用。 胶体金免疫测定法是一种利用胶体金颗粒作为标记物的新免疫分析技术。抗 原或抗体能够吸附胶体金颗粒表面形成一个蛋白质层，形成稳定的蛋白质溶液。 以条状纤维层析材料为固相( 通称试纸条) ，通过毛细作用使样品溶液在层析条 上泳动，并同时使样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体( 如抗体或抗 原) 发生高特异、高亲和性的免疫反应，层析过程中免疫复合物被富集或截流在 层析材料的一定区域c 检测带) ，通过酶反应或直接运用可目测的标记物( 如胶 体金) 而得到直观的实验现象( 如显色) 而游离标记物则越过检测带，达到与 结合标记物自动分离之目的p ”“。 免疫传感器是生物传感器的一种，传感器的生物敏感层与复杂样品中特定的 目标分析物之间通过抗体与抗原之间的识别反应，产生一些物理化学信号c 如光、 热、声、质量、颜色、电化学等) 的变化，这些变化通过不同原理的传感器( 如 光敏感、压电装置，光极、热敏电阻、离子选择性电极等) 转换成第二信号( 常 为电信号) ，经放大后显示或记录1 4 ”。利用兽药与特异性抗体结合反应特性研制 出的免疫传感器，可用于对相应兽药残留进行快速定量定性检测i 托枷。其最大 特点是便携性，免疫传感器高度的自动化、微型化与集成化减少了对使用者及环 境技术条件的依赖，测定速度快，适合现场或野外进行快速筛选检测。然而，由 于其在生物物质的有效性和重复性、仪器小型化和自动化、制备成本和运行成本 等方面的困难，免疫传感器技术的商品化应用远落后于实验室研究水平【4 6 l 。 蛋白芯片兽药残留检测技术是二十一世纪发展起来的一种新的食品中兽药 残留量检测技术，除具有灵敏度高、特异性强、样品前处理简单、检测方便快速 等优点外，还可实现对多种兽药同时并行检测，显示出生物芯片的并行性和高通 量性且生物芯片容易实现集成化和自动化，在兽药残留的自动化检测上具有一 定的优势。目前用于兽药残留检测的生物芯片正处于发展的初期，可检测的兽药 种类相对较少，但初步实现了多残留检测。2 0 0 5 年，北京博奥公司和北京检验 检疫局联合研发出“兽药残留蛋白芯片检测平台系统”，可以实现对猪肉、猪肝、 鸡肉、鸡肝4 种组织以及猪尿中恩诺沙星、磺胺二甲嘧啶、链霉素、克仑特罗的 半定量检测【棚 1 4 4 兽药残留酶免疫分析方法的建立 兽药在保证和促进畜牧业发展，满足人类对畜产品需求上发挥着显著的作 用，但近年来由于不合理用药和非法用药造成动物性食品中兽药和添加剂残留非 常严重，且因兽药残留超标而引起的食物中毒事件屡有发生，食品安全的问题已 引起全社会广泛的关注，许多国家为此投入了大量技术、资金和人力来开发和应 用兽药残留分析新技术，并制定了相应的法规来加强管理。 免疫分析方法以其特异、灵敏、简便、快速、成本低等优点，近年来备受重 视。决定免疫分析效果的主要因素是抗体的选择性和亲合性，而这些性质又很大 扬甜 大学硕士学位论文 程度上取决于半抗原结构。一般来说，可直接用待测药物作为半抗原与载体蛋白 或多肽偶联，但该药物必须具有能够和载体反应的活性基团( 如羧基、氨基、羟 基等) ，且偶联物能够暴露出待测物的特征结构【4 s 】。某些情况下需要通过化学方 法人工添加上适宜的活性基团以及“间隔臂”，甚至人工方法合成具有待测物特 征的半抗原。偶联后的半抗原特异性结构必须位于载体的远端，作为抗原决定簇， 才可制各出特异性的抗体。在族特异性半抗原的设计中，可以用具有母核结构的 化合物作为抗原决定簇 1 4 4 1 人工抗原的合成 免疫分析是以抗体作为生物检测器的分析技术，而大多数兽药是小分子物 质( 分子量小于1 0 0 0 ) ，本身不具有诱导产生抗体的能力，因此将兽药小分子与 载体蛋白质偶联制备人工抗原成为建立兽药酶免疫分析方法的关键所在。 常用来作为兽药人工抗原的载体蛋白质有牛血清蛋白( b s a ) 、卵清蛋白 ( o v a ) 、钥孔血蓝蛋白( k l h ) 、人血清白蛋白( h s a ) 、结核杆菌毒素蛋白( t t ) 等。 目前，用的最多的是b s a ，因为其物理化学性质稳定、不易交性、价廉易得。而 且赖氨酸含量高，自由氨基多，在不同的和离子强度下均有较大的溶解度，在含 有有机溶剂( 如无水毗啶，n ，n 一二甲基甲酰胺) 情况下均可和半抗原进行偶联， 且在偶联后仍保持可溶状态。 药物分子内如果有反应功能团，则可根据具体情况用适当的双功能交联试剂 与交联方法使半抗原与载体偶联；对于羧基半抗原如氟喹诺酮类、聚醚类、头孢 菌素类、肽类等，常采用混合酸酐法、n 一羟基琥珀酰亚胺活性酯法或碳二亚胺法： 对于氨基半抗原如磺胺类、氨