（临床兽医学专业论文）重组hlag1基因的克隆、原核表达、纯化及功能的初步研究.pdf

摘要 h l a g 是一种非经典的h l a i 类分子，与人类免疫耐受有关。诱导对移植抗原的免疫 耐受是使移植物获得长期存活的关键。人类和哺乳动物的妊娠过程是自然界中存在的一种天 然的同种、 异体免疫耐受模型。在母胎界面的细胞滋养层上高表达的h l a g 能够抑制子宫蜕 膜n k 细胞的杀伤活一陛，在保护胎儿不被母体排斥的过程中具有重要的作用。但h l a g 究竟 是哪些特定构象或氨基酸同n l ( 细胞上其特异性受体相互作用，目前尚没有明确的结论。我 们研究的日的就是通过比较正常和特定氨基酸的突变的h l a g 分子与特异性受体之间的作 用力的强弱及功能活性变化米探讨h l a g 与其受体的作用机制。 本研究用基冈丁程技术将b i r a 酶底物肽( b s p ) 的编码基因克隆到m l c 分子上，利用 其与生物素特异性稳定结合的能力及生物素的多价性，将姗c 分子捆绑成四聚体复合物，从 而在m h c 分子与k 1 r 结合的过程中从而标记和识别n k 细胞。本试验研究的目的就是构建 和表达该融合蛋白，为h l a g i 与其受体的作用机制研究奠定基础。 研究利用p c r 的方法分别扩增了h l a g i 的胞外功能基闪 i l b s p 基冈，用s o ep c r 将它们 拼接成融合基冈( h b ) ，并将h b 克隆至载体p e t 2 8 a ，成功构建成了表达载体p e t 2 8 a h b 。将 其转化b l 2 1 ( d e 3 ) 菌，在最佳的诱导表达条件r ，n 3 7 ，在含i m m o l l 的i p t g 的l b 培养基中 融合蛋白羊hb2 m 分别于诱导5 h ，3 h ，两蛋白均以包涵体的形式得到了大量的表达。s d s p a g e 电泳显示其分子最分别为3 6 k d 和1l k d ，与预期相符。在w e s t e r nb l o t 免疫印迹分析，融合蛋 白与8 7 g 单克隆抗体，hb2 m 与其腹水多克隆抗体发生特异性反应。由丁融合蛋白在大肠杆菌 中表达始终形成包涵体，而h l a g 胞外区本身含有两个二硫键，给为蛋白质正确折叠造成很 人困难，因此，在对表达产物形成的包涵体溶解、洗涤、复性等一系列过程中，摸索出融合 萤r h l a g 1 复性的最适条件，提高其复性率。融合蛋白包涵体经6 m o l l 的尿素溶解后用c + 离子树脂纯化，获得理想的纯化效果。hb2 m 蛋白包涵体经洗涤溶解后目的蛋白浓度占全部 包涵体蛋自的3 0 ，满足辅助h l a g 1 融合蛋白复性的要求。 霞组融合蛋白h l a g 1 在与hb2 m 稀释法共复性，超滤浓缩后，在1 0 ug m l 的浓度下， 分别以n k 9 2 和k 5 6 2 细胞为效应细胞和靶细胞，在5 ：1 和2 5 ：1 的效靶比例下，用乳酸脱 氢酶法( i , d h 法) 测定n l ( 细胞对k 5 6 2 细胞的杀伤活性。结果表明l oug m 1h l a _ g l 融合蛋 白能显著抑制n k 细胞的杀伤活性加入1 9ug m lh l a g 1 融合蛋白抗体8 7 g 能阻断大部分 h l a g 1 的抑制活性。 关键词：h l a g 1 ，b s p ，h a ：m ，表达，免疫耐受 a b s t r a c t h l a gi san o n c l a s s i c a lm h cc l a s s i c a lim o l e c u l ei n v o l v e di ni m m u n o t o l e r a n c e t h e i n d u c t i o no fi m m u n o - t o l e r a c eo ff o r e i g ng r a f t si st h ek e yt ol o n g - t e r ms u r v i v a l o ft r a n s p l a n t e d t i s s u e t h eh y p e r a c u t er e j e c t i o no ff o r e i g ng r a f t sh a sb e e ng r e a t l yi n h i b i t e di nx e n o t r a n s p l a n t a t i o n b ye l i m i n a t i n gt h en a t u r a la n t i b o d ya n db yu s i n gi n h i b i t o rc o m p l e m e n t s b u td u et ot h ep r e s e n c e o fd e l a y e dx e n o g r a n f t sr e j e c t i o n ，t h ep r o b l e mo fi m m u n o l o g i c a lr e j e c t i o ni nt r a n s p l a n t a t i o nh a s n o tb e e nc o m p l e t e l yd i s s o l v e d p r e g n a n c y i nh u m a na n dm a m m a n l s p r e s e n t s i n t r i g u i n g e v i d e n c eo fn a t u r a l i m m u n o t o l e r a n c eo fs e m i a l l o g e n t i cg r a f t s h l a gw h i c hi sh i g he x p r e s s e do nt h ec y t o t r c p h o b l a s tc e l l sa tt h em a t e r n a l f e t a li n t e r f a c e ，p l a y sa ni m p o r t a n tr o l e i nt h em a t e r n a l f e t a l t o l e r a n c ea n di np r o t e c t i n gt h ef e t a ln o tb e i n gr e j e c t e db ym a t e r n a lb yi n h i b i t i n gt h ec y t o l y s i so f n kc e l l si nt h ed e c i d u a so fu t e r u s h o w e v e rt h e r ei sn o tac l e a rc o n c l u s i o nt h a tw h i c hs p e c i a d c o n f o r m a t i o n so ra m i n oa c i d si n t e r a c tw i t ht h es p e c i a lr e c e p t o r so nn kc e l l s t h ep u r p o s eo fo u r r e s e a r c hi st of i n do u tt h em e c h a n i s mt h a ti n t e r a c t i n go ft h e mb ym u t a t i n gs o m ea m i n oa c i d e ( s ) i n h l a g lm o l e c u l ea n dt h e no b s e r v i n gt h ec h a n g e si na f f i n i t ya n da c t i v i t yb e t w e e nt h e m i tw a sr e p o r t e dt h a tc t lc e l l sc o u l db ee a s i l ys i g n e da n dr e c o g n i z e dd u r i n gm h c s c o m b i n e dw i t ht c rw h e nm h c sc o n v e r g e dt oat e t r a m e rw h i c hw a sm a d ea sb e l o w w h e ng e n e o fb i r ae n z y m es u b s t r a t ep e p t i e s ( b s p ) w a sc o n n e c t e dw i t hg e n eo fm h ci nt h et a i lo fc a r b o x y w i t hg e n e t i ce n g e e r i n gt e c h n i c st h eb s pw o u l dc o n n e c tw i t hb i o t i nf i r m l y b e c a u s eo fi t m u i r i v a l u ec h a r a c t e rt h eb i o t i nm o l e c u l ec o u l dc o n n e c tf o u rb s pm o l e c u l e h o w e v e rr e p o r t sa r e n o to b s e r v e dw h e t h e ri ti ss u i tf o rh l a ga n dw h e t h e rh l a gr e m a i n st h ef o n c t i o na f t e rt r e a t e d w i t ht h et e c h n i c t h ep u r p o s eo fo u rs t u d yi st oc o n f i r mt h ei n f e ra n dd os o m ef o u n d a t i o nw o r k a b o u tt h em e c h a n i s mb e t w e e nh l a - ga n di t sr e c e p t o r s i nt h ee x p e r i m e n t sg e n e sl o c a t e di ne x t r a m e m b r a n c er e g i o no fh l a - g 1 ( s i m p l ea sh ) a n d b s p ( s i m p l ea sb 、w e r ec l o n e dw i t hp c rr e s p e c t i v e l y , a n dt h e yw e r ec o n n e c t e dt oac o m b i n e d g e n e ( s i m p l ea sh b ) b yt e c h n i co fs o ep c r t h e nt h ec o m b i n e dg e n ew a sc l o n e di n t oe x p r e s s i n g v e c t o rp e t 2 8 a a f t e rj d e n t i f yw i t hr e s t r i c te n d o n u c l e a s e sc l e a v a g ea n a l y s i s ，p c ra n n l y s i sa n d s e q u e n c ec o n f t r m e di tw a sp r o v e dt h a tc o m b i n e de x p r e s s i n gv e c t o rp e t 2 8 a h bi s c o n s t r u c t e d s u c c e s s f u l l y i nt h eo p t i m i z e de x p r e s s i n gc o n d i t i o nb o t hs t r a i n s d e 3 一p e t 2 8 a h ba n dd e 3 - p e t 2 3 a - h1 3 2 m ，w e r ei n c u r a t e da tt h ep r e s e n c eo fl m m o l li s o p r o p y l b d - t h i o g a l a c t o s i d e ( 1 r r g ) a t3 7 。c f o r5a n d3h o u r sr e s p e c t i v e l y b o t ho ft h ep r o t e i n sc o u l db eg r e a t l ye x p r e s s e di ni n c l u s i o nb o d y a n dt h et w op r o t e i n sm o l e c u l ew e i g h tw a sa b o u t3 6 k da n d1 l k d h bc o u l dr e a c tw i t hm o n o c l o n e a n t i g e n8 7 gw h i l eh1 32 mw i t hm u l t i c l o n ea n t i g e nw h i c hi sm a d ef r o ma s c i t e si nw e s t e r nb l o t a n a l y s i s 1 n c l u s i o nb o d yc o n t a i n e dh bp r o t e i nc o u l db ew e l lp u r e dw i t l lc 0 2 + r e s i na f t e rl y s i s e d i n6 m o i lu r e a a n di n c l u s i o nb o d yc o n t a i n e dh1 32 mc o u l db eu s e dt oh e l ph b r e f o l d i n ga f t e ri t b ew a s h e ds e v e r a lt i m e sa n db et r e a t e dw i t h6 m o l lu r e a t h ec o n t e n to fp r o t e i nh1 32 mr e a c h e d a b o u t3 0 i na l lp r o t e i n si nt h ei n c l u s i o nb o d y p r o t e i nh1 32 mw a sr e f o l d e dw i t hd i a l y s i sw h i l ep r o t e i nh bw i t hd i l u t i o na tt h ep r e s e n c eo f hb2 ma n dn o n a p e p t i d e a f t e rb e i n gc o n d e n s e dw i t hu l t r a f t l t r a t i o np r o t e i nh bw a sa d d e dt ot h e m i x t u r ec e l l so fn 1 4 0 2a n dk 5 6 2a taf i n a lc o n c e n t r a t i o n1 0u 咖l i ut h es o l u t i o n t h el y s i sr a t e o fn k 9 2t ok 5 6 2w a sm e a s u r e dw i t hl d hm e t h o da tt h er a t eo f5 ：1a n d2 5 ：1r e s p e c t i v e l yf o r n k 9 2 ：k 5 6 2 t 1 1 er e s u l t ss h o w e dt h a tp r o t e i nh bi n h i b i t e dt h el y s i so fn l ( 9 2t ol ( 5 6 2c e l l s n a p p a r e n t l ya taf i n a lc o n c e n t r a t i o no f1 0ug h a k e yw o r d s ：h l a - g 1 ，e x p r e s s i n g ，p u r i f i c a t i o n ，i m m u n o t o l e r a n c e i l i 缩写 a d c c a m p a p c b p c l i t a c r e b c t l e v t g g m c s f h h l a g h 1 32 m l f ny l l t l u r s 】p t g 】r f l 】s r e l m mm o t i f i t i mm o t i f k d l ( i r k n a l a c z u r s m h c m l n m l n f - kb n k p m s f p c r r p m s o e t c r 主要缩略语 英文 a n t i b o d y d e p e n d e n tc e l lc y t o t o x i c i t y a m p c i l i n a n t i g e np r e s e n tc e l l b a s ep a i r d a s s1 it r a n s a c t i v a t o r c a m pr e s p o n s i v ee l e m e n tb i n d i n gp r o t e i n c y t o t o x i cl y m p h o c y t e e x 仃a f i l l o u st r o p h o b l a s t g r a m g r a n u l o c y t em a c r o p h a g e c o l o n ys t i m u l a t i n g f a c t o r h o u r h u m a nl e u k o c y t ea n t i g e n g h u m a n1 32m i c m g l o b u l i n i l l t e r f e r o n y l gl i k et r a n s c r i p tf a m i l y i m i n u n ( 羽o b u l i n - l i k et f a n s c r i r l i s l s o p r o p u l - 1 3 - d - t h i o g a l a c t o s i d e i n t e r f e r o nr e g u l a t o r yf a c t o r - 1 i n t e r f e r o ns t i m u l a t e dr e g u l a t o r ye l e m e n t i m m u n o r e c e p t o rt y r o s i n e - b a s e da c t i v a t i o nm o t i f s i m m u n o r e c c p t o rt y r o s i n e b a s e di n h i b i t i o nm o t i f s k i l o d a l t o n k i l l e rc e l li n h i b i t o rr e c e p t o r k a n a m y c i n 1 3 g a l a c t o s i d a s e l e u c o c y t ei m m u n o g l o b n l i n l i k er e c e p t o r s m a j o rh i s o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e x m i n u t e m i l l i l i t e r n u c l e a rf a c t o rkb n a t u r a lk i l l e rc e l l p h e n y l m e t h y ls u l f o n y lf l u o r i d e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r o u n dp e rm i n u t e s e c o n d g e n es p l i c i n gb yo v e r l a pe x t e n s i o n tc e l lr e c 印t o r v 中文 抗体介导的细胞毒性作用 氨苄青霉素 抗原递呈细胞 碱基对 i i 类反式激活因子 环腺苷单磷酸反应因子结合 蛋白 细胞毒性t 细胞 绒毛外细胞滋养层细胞 克 粒白巨细胞集落刺激因子 小时 人类白细胞抗原g 人微球蛋白 间介素y 抗原样转录家族 免疫球蛋白样转录子 异丙基硫代一b - d 半乳糖营 干扰素调铮因子1 干扰索刺激调节元件 酪氨酸免疫受体激活性基序 酪氨酸免疫受体抑制性基序 千道尔顿 杀伤细胞抑制性受体 那霉素 1 3 j 卜乳糖苷酶 白细胞免疫球蛋白样受体 主要组织相容性复合物 分钟 毫升 核冈子k b 自然杀伤细胞 苯甲基磺酰氟 聚合酶链反应 转分钟 秒 t 细胞受体 t g f - b t b t j t n f v e g f 1 32 m t r a n s l a t eg r o w t hf a c t o r - b tl y m p h o c y t eh e l pc e l l tl y m p h o c y t ei n h i b i tc e l l t u m o rn e c r o s i sf a c t o r v a se p i t h e l i u mg r o w t hf a c t o r 1 32m i c r o g 】o b u l i n v i 转化生长因子b t 辅助细胞 t 抑制细胞 肿瘤坏死因子 血管内皮生长因子 微球蛋白 图： 插图和附表清单 图卜l ，h l a g 基因结构3 图1 2 ，i v l h c 四聚体示意图1 0 图2 一i ，融合基冈h b 拼接流程示意图1 7 图2 2 ，重组质粒p e t 2 8 a - h b 载体的构建流程图2 1 图2 3 ，h l a g l 胞外区片段的p c r 扩增2 5 图2 4 ，生物素接受肽基因的p c r 扩增2 5 图2 5h ，b 片段拼合的电泳图2 6 幽2 6 ，重组质粒p g e mt - e a s yh b 酶切图2 6 图2 7 ，菌落p c r 对重组质粒p g e mi - e a s yh b 的初步鉴定2 7 图2 8 ，空质粒p e t 2 8 a 的双酶切图2 8 图2 9 ，菌落p c r 初步筛选p e r 2 8 a h b 的阳性克隆2 8 图2 1 0 ，重组质粒p e t 2 8 a h b 及其酶切图2 8 图2 一1 1 融合蛋白氨基酸序列3 1 图31w e s t e r nb l o t 转膜安装示意图3 8 图3 2 ，p e t 2 3 a b2 m 蛋白的诱导表达4 1 图3 3 ，h l a - g 重组蛋白的诱导表达4 1 图3 3 ，表达蛋白的w e s t e rb l o t 鉴定4 2 图3 4 ，标准蛋白光密度吸收图4 3 图4 一l 不同效靶比时的n k 细胞杀伤率比较4 7 表： 表3 1 不同温度i p t g 浓度和诱导时间对截断型h l a - g 1 蛋白表达的比较4 2 表3 2 不同温度i p t g 浓度和诱导时间对b2 m 蛋白表达的比较4 2 表3 3 不同浓度的b s a 吸光光度值4 3 v 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：弓长淘鼠 时间： 0 。吐年莎月，夕日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 导师签名： 张两履 场乜融t | 时间：o ，于年月步日 时间：沙j 年f 月移日 中国农业大学硕士学位论文前言 1 1 文献综述 第一章前言 诱导移植抗原使其免疫耐受是使移植器官组织在宿主中获得长期存活的关键。目前在器 官，组织移植过程中，尽管天然抗体和补体抑制剂等免疫抑制剂的应用使得超急性免疫排斥反应 得到了一定程度的控制，但由于延缓性免疫排斥反应的存在，因此未能从根本上解决移植过程中 的免疫排斥反应。 但是在哺育动物的妊娠过程中，胎儿作为母体的一种半异体移植物在生理条件下却不被母 体所排斥而正常发育和分娩。这一生理现象的内在机制为我们解决移植过程中的免疫排斥反应提 供了一种新思路。 许多研究表明妊娠早期子宫内膜出现大量的n k 细胞，尤其在母胎界面的绒毛膜外的滋养 层细胞中，n k 细胞是最丰富的淋巴细胞，占所有淋巴细胞的9 5 。n k 细胞对限制滋养层细胞 过度侵蚀正常胎盘的形成起着重要的调节作用。n k 细胞作为主要调控细胞之一，其作用机制与 滋养层细胞表达人类白细胞抗原g ( h u m a nl e u k o c y t ea n t i g e n ，g ，h l a g ) 有关”j 。 h l g 属干人类主要组织相容性复合物( m a j o rh i s o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e x ，m h c ) ，后者是 迄今为止己知免疫系统中最复杂，最具多态性的一类分子，也称之为人类白细胞抗原，调节免疫 细胞的相互作用。人类m h c 基因位于第6 号染色体短臂( 6 p 2 1 3 ) ，占人类整个基因组的1 3 0 0 0 ， 全长3 6 0 0 k b ，几乎相当于大肠杆菌整个染色体的长度。它包括2 2 4 个基因座位，其中1 2 8 个为功 能性基冈，即有产物表达，9 6 个为假基因。在1 2 8 个功能基因中，3 9 8 基因和免疫系统有关， 特别是i i 区域中几乎所有基因均显示免疫相关功能1 2 1 。传统上将m h c 分为i 、i l 、i i i3 类p j 。 i 类基因包括h l a a 、h l a b 、h l a c 、h l a e 、h l a f 、h l a g 、h l a h 、h l j 、h l a x ， 其产物存在于几乎所有有核细胞的表面。其中h l a a ，b ，c 等位点所编码的分子称为经典h l a - i ( h l aia ) 类分子；h l a e ，f ，g ，h 等因其有限的多态性及其编码产物低水平的细胞表面 表达而有别于经典的h l a - i 类因而称之为非经典的h l a i ( h l a ib ) 分子。h l a - e 是目前 研究较为清楚的非经典h l a - l 类分子，广泛分布在各种成人组织，另外在胎盘和胎且_ = 也存在。 h l a - e 分子与n k 细胞受体c d 9 4 n k g 2 a ，c d 9 4 n k g 2 b ，c d 9 4 n k g 2 c 相互作用，从而影响 n k 细胞的功能。h l a - g 与h l a - f 分子的分布较窄，h l a - f 主要分布在b 淋巴细胞、静止的t 淋巴细胞和皮肤；h l a g 主要分布在胎盘组织，男性生殖细胞。移植组织，肿瘤组织和感染组 织。 h l a - i i 类分子为h l a d p ，d q d d r 等系列抗原，分布较窄。基因区靠近中央着丝点一侧， 长约1 0 0 0 k b 。与h l a 一1 类基因座不同之处住丁它们总是成对出现，分别编码h l a - 1 i 类分子的 a 链和b 链。主要分布在b 淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞和活化的t 淋巴细胞上，将外源性 抗原提呈给c d 4 1 细胞。某些t 辅助细胞( 1 飞) ，t 抑制细胞( t i ) 也有表达。 h l a i i i 类分子为补体成分，其基因末端位于h l a i 类和h l a i i 类基因区之间，许多基因 中国农业大学硕上学位论文 前言 座编码分子的功能尚不清楚，部分基因产物与先天免疫以及炎症有关。目前已确定的主要包括 c 2 ，c 4 ， b f 等补体成份以及肿瘤坏死因子t n f ( t u m o rn e c r o s i sf a c t o r ) 家族成员，l t a ( 1 y m p h o t o x i n - a ) 和l t b ( 1 y m p h o t o x i n b ) 等。 h l a - g 同其它m h c1 分子相比具有很多相同的特点。它们膜外部分有3 个功能区，从其 n - 末端起分别称为o1 ，a2 ，a3 ，且每个功能区都约由9 0 个氨基酸残基组成。其中a3 氨基酸 序列具有很大的保守性。它们都是以三分子复合物的形式表达于细胞表面，包括一个与h l a g 重链结台的微球蛋白( b2m i c r o g l o b u l i n ，b2 m ) 4 - 6 l 和1 ，2 区域结合一个抗原肽。与h l a - g 结合者为一个约九个氨基酸的多肽链。它们以一种抗原加工相关转运蛋白( t a p ) 依赖方式递呈抗 原，从而表达其生物学功能。 1 1 1h l a - g 基因及基因表达和调控 h l a - g 的基因首先是由g e r a g h t y 等克隆并测序，由于它存在于6 0k b 的h i n di i i 酶切片 段中，被命名为h l a 6 0 ；为避免在命名中使用标点符号，1 9 8 8 年m c a l p i n e 建议将该基因命名 h l a - 6 0 ；1 9 9 0 年b o d m e r 等发布的m a 命名通报中将该基因正式命名为h l a g 。h l a g 基因 位于距离h i a - a 约1 1 0 2 2 0 b p 处。其基因序列和结构与经典i 类分子高度同源，包括8 个外显 子和7 个内含子。外显子1 编码信号肽；外显子2 - 4 编码胞外a 1 n3 结构域；外显子5 编码跨 膜区；外显子6 8 编码胞内区。由于外显子6 第二个密码子为终止密码，导致h l a g 抗原分子 的胞内区短于经典l 类。h l a g 剪接可产生7 种m r n a ，即g 1 、g 2 、g 3 、g 4 、可溶性g 1 ， g 2 和g 3 p 。后三者也称之为h l a - g 5 ，h l a - g 6 h l a g 7 。h l a - g 7 是2 0 0 0 年由p a s c a le t a l 发现的”j 。g 1 为全长，g 2 、g 3 、g 4 分别缺失外显子3 、外显子3 和4 、外显子4 。g s 由包括内 含子4 的m r n a 翻译而成，由于该内含子中有终止密码，导致其跨膜区及胞内区不翻译，从而 形成可溶性h l a - g 。h l a g 7 成熟m r n a 包含内含子2 ，而内含子2 存在终止密码，因此只产 生了一种分子量为7 k d 的可溶性分子，它仅由a1 功能区和内含子2 编码的2 个氨基酸残基连接 组成( 见图1 - 1 ) 。同其他的i 类基因相比，包括h l a e 和h l a f ，h l a g 7 未发现存在这些短 的异构体，因此这种可变剪接可能是h l a g 位点特异性的【9 】。 已知h l a - i 类基因的启动子区存在3 个上游调控元件：增强子a ，干扰素刺激调节元件 ( i n t e r f e r o ns t i m u l a t e dr e g u l a t o r ye l e m e n t ，i s r e ) ，和s x y 调节元件。他们各自结合不同的反式作 _ ；l 冈子。增强子a 元件含有n f - kb ( n u c l e a rf a c t o r kb ) 的结合位点，包括两个kb 位点( kb1 和k b2 1 和s p l 转录因子结合位点；i s r e 结合干扰素调节因子l ( i n t e r f e r o nr e g u l a t o r y f a c t o r - 1 ，i r f i ) 家族的转录因子，介导由各类干扰素，尤其是y 干扰素诱导的i 类基因的转录活化；s x y 调节元 件由s 、x ( 包括x 1 和x 2 位点) 、y 盒组成。x 1 盒结合r f x 复台体；x 2 盒也叫n 位点，结合 a t f c r e b ( c a m pr e s p o n s i v ee l e m e n tb i n d i n gp r o t e i n ) 家族的转录因子；y 盒也叫增强子b ，结 台n f y ，r f x ，a t f c r e b 和n f y 形成一个非常的多蛋白复合体结合s x y 元件，这个复合体可 结合i i 类反式激活因子( c l a s si it r a n s a c t i v a t o r ，c 1 i t a ) ，从而活化i 类和类基因的转录 1 0 - 1 1 1 。 但是n f - kb ，i r f - 1 和c i i t a 等介导的途径对非经典的h l a - g 基因的转录无效i l “。研究表明 h l a - g 基因增强子a 的x b l 和k b 2 位点核苷酸序列发生变异，导致其对n fk b 的亚单位p 5 0 同源二聚体高亲和力，但不能结合具有反式激活作用的n f kb 其它亚单位1 1 3 1 。同时由于h l a g 2 1 s r e 核苷酸变异( 相对于h l aia 核苷酸部分缺失) 从而失去了与i r f 蛋白的结合能力，因此 h l a g 的i s r e 元件不能介导由i f n - y 诱导的h l a g 分子的表达f 1 1 。另外h l a g 基因的x 2 和y 盒发生变异，阻碍了在s k y 元件上形成r f x 、a t f c r e b 和n f y 多蛋白复合体，c1 1ta 的结合也因此受到阻碍，所以h l a - g 不能被c i l l a 反式激活。这样由于基因的变化引起h l a g 三条主要的反式激活途径均不能发挥作用，从而使得h l a g 同其他h l ai 类分子之间存在如此 大的差别。 图1 - 1 ，h 1 a g 基因结构 1 1 2h l a - g 的有限的多态陛和组织限定性分布 h l a g 最初认为不存在多态性，但是随着新的h l a - g 等位基因的发现，表明h l a g 还是 具有一定的多态性。1 9 9 2 年g e r a g h t y 等发现，在h l a - a 和h l a - g 之间有一个高度多态的区域， 这一区域在某种h l a 单倍型时缺失，使两基因之间的距离缩短5 0 k b 以上。1 9 9 3 年m o r a l e s 等报 道了3 个新的h l a - g 等位基冈，从而证明h l a g 基因有多态性【1 5 】。目前已发现1 5 个h l a - g 等位基因且包含一个无效基因1 1 “，其中有5 个有氨基酸序列差异。借助p c r s s c p 技术发现， 外显子3 即2 是h l a - g 多态性集中的区域。但是在经典h l ai 类分子的功能必需区h l a - g d n a 序列高度保守同时因其存在核营酸“同义”或“沉默”置换，即该核苷酸序列的变化不 引起氨基酸种类的改变，减少了h l a g 蛋白水平的多态性，因此与经典m ai 类核酸高变区比 较h l a - g 相对应的区域多态性有限i l ”。 3 中国农业大学硕士学位论文前言 h l a - g 在体内的分布局限于特定组织。其抗原的表达最早见于母胎界面绒毛外细胞滋养层 细胞( e x t r a r i l l o u st m p h o b l a s t ，e v t ) 。近几年的研究表明，h l a - g 主要表达于胎盘组织、男性 生殖细胞、移植组织、肿瘤组织及感染组织。随着研究的深入，现已证实多种类型的细胞均可表 达h l a g 。转录后的h l a - g 分子，表达于孕卵着床期植入母体子宫内膜的胎盘组织中，而此处 恰恰不表达经典h l ai 类分子( h i aia ) 。在绒毛膜外细胞滋养层，包括侵入子宫蜕膜的细胞滋 养层中，h l a g 高表达，在胎盘绒毛的合胞体滋养层中，h l a g 表达水平较低。在妊娠前三个 月胎盘绒毛膜血管内皮细胞，胸腺髓质上皮细胞和活化的外周血单核细胞上1 4 l ，以及羊水和羊膜 细胞上都可见h l a g 的表达【1 。与胎盘组织相类似，睾丸组织中也不表达h l aia ，而是高表 达h l aib 。但不同的是，在精子形成细胞中不表达h l a - g ，反而高表达h l a - e 。f i s z e r 认为 h l a 的这种特定分布可能与精子形成细胞免受自身免疫攻击有关1 1 9 1 。 研究证明在一些人类黑色素瘸细胞系和活检组织中也有h l a - g 蛋白表达如黑色素瘤、肾 癌、乳腺癌、膀胱癌、原发性皮肤淋巴瘤、肉瘤、非何杰金氏淋巴瘤、肺癌、神经胶质瘤等。在 病毒感染过程中活化的巨噬细胞和树突状细胞以及炎症过程中如在皮肤炎症性疾病银屑病中均 发现了h l a g 的表达。另外发现两个滋养层来源的肿瘤细胞系b e w o 和j e g 一3 上都有h l a - g 的 表达1 2 0 。l i l a 发现部分心脏移植病人的移植心脏表达m a g ( 1 8 ) ，并可维持6 个月以上。并且 h l a g 阳性的病人，急性排斥反麻发生率明显降低，并且未见慢性排斥反应口”。肺部感染时， 在活化的巨噬细胞和树突状细胞表面h l a - g 被上调表达，并且它会影响抗原呈递，降低免疫应 答有效性，有助丁二炎症进展口”。除胚胎组织、眼组织、脑组织、胸腺组织和某些肿瘤组织外，虽 然在人体其他组织虽也有h l a g m r n a 的表达，却未检出h l a g 蛋白产物，而且h l a - g m r n a 的表达水平远低于其在相应组织中经典h l a i 类基因m r n a 的水平。说明h l a g 在组织分布上 具有明显的组织限定性。 1 1 3h l a - g 的功能 从作用对象来看，h l a - g 同n k 细胞、t 细胞、细胞囡子等有着广泛的联系；从h l a - g 调控的生理或病理过程来看，它可参与生殖免疫、移植免疫、肿瘤免疫及炎症过程等。 日前对h l a g 分子功能的研究多集中在h l a g 1 分子1 2 3 | ，研究表明：1 ) h l a - g 1 分子对 抗原特异性c d 8 + t 细胞的细胞毒活性和同种异型t 细胞增殖反应有抑制作用伟 染h l a - g 1 的胶 质瘤细胞可抵抗c d 8 + t 细胞的溶解作用) ，而且在促进1 1 4 分泌的同时抑制1 f ny 和1 n fy 的释 放，从而诱导朝分泌t h 2 型细胞因子的转换，即t h 2 极化作用口”。2 ) h l a - g 1 是一个保护性分子， 它可以和抑制性受体i l t 2 ，i l t 4 ，k l r 2 d l 4 直接结合，从而抑制蜕膜和外周血n k 细胞的细胞 毒作用。i l t 2 ，i l t 4 属于i l t ( i gl i k et 珊s c t i p tf a m i l y ) l l r 基因家族，k i r 2 d i m 属于k i r l 0 3 基因 家族。r i t e a u 等的研究表明，i l t 2 是h l a g 1 分子抑制新分离n k 细胞细胞毒作用的主要受体， 他们认为h l a - g 1 分子主要通过结合i l t 2 抑制n k 细胞的细胞毒作用，而其它一些抑制受体只 在特定条件下发挥