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温州医学院硕士学位论文 e c f p s u m o e y f p 融合基因的构建、表达及其鉴定 中文摘要 目的 通过g a t e w a y 技术结合酶切连接的方法，将e c f p 基囚、c y f p 基因与人 s u m o 基因连接起来形成e c f p s u m o e y f p 融合基因，并将此基因在大肠杆 菌b l 2 1 中表达，为进一步的荧光共振能量转移研究打下实验基础。 方法 1 通过p c r 技术将e c f p 基囚扩增出来，并通过两步法p c r 反应和b p 反应将 e c f p 基凶片段克隆到到质粒p d e l i v e r 0 2 ，构建入门克隆e c f pd e v 0 2 ，并经过 提取质粒、经酶切鉴定，并测序确定。 2 通过p c r 技术将e y f p 基冈扩增出来，并通过两步法p c r 反应和b p 反应将 e y f p 基因片段克隆到到质粒p d e l i v e r 0 1 ，构建入门克隆e y f pd e v 0 1 ，并经 过提取质粒、经酶切鉴定，并测序确定。再通过酶切、连接和r j 反应，将 e y f p 基因克隆到表达载体p r e c e i v e r b 0 1 1 中，构建表达载体e y f pb 0 1 1 。 3 构建融合基因：p c r 扩增s u m o i ，s u m 0 2 ，s u m 0 3 基因，通过酶切、连 接，与e y f pb 0 1 1 构建融合的s u m o i e y f pb 0 1 1 ，s u m 0 2 e y f pb 0 1 1 ， s u m 0 3 e y f pb 0 1 1 表达载体；p c r 扩增e c f p 基凶，纯化该基因，通过酶 切、连接，分别与s u m 0 1 e y f pb 0 1 1 ，s u m 0 2 e y f pb 0 1 1 ，s u m 0 3 e y f p b 0 1 1 构建e c f p s u m 0 1 一e y f pb 0 1 1 ，e c f p s u m 0 2 e y f pb 0 1 1 ， e c f p s u m 0 3 e y f pb 0 1 1 融合基因表达载体。 4 融合基因e c f p s u m 0 1 e y f p ，e c f p s u m 0 2 e y f p ，e c f p s u m 0 3 e y f p 分别在大肠杆菌b l 2 l 中表达并纯化，通过用s d s p a g e 鉴定融合基因，并 通过n i n t a 离子交换柱层析纯化，最终得到纯化后的融合蛋白，并以酶切 实验初步分析了s e n p 相对于底物e c f p s u m o e y f p 的酶切特异性。 结果 1 成功的构建入门克隆e c f pd e v 0 2 和e y f pd e v 0 1 ，成功构建表达载体e y f p b 0 1 1 。 2 成功的构建融合基因e c f p s u m o s e y f p ，并同时构建s u m o s 三种亚型的 融合基因。 3 e c f p s u m o e y f p 蛋白在大肠杆菌b l 21 获得可溶性表达，s d s p a g e 分析 表明表达产物分子质量( m r ) 与预期相符，u l p 、s e n p s 对底物 1 温州医学院硕士学位论文 e c f p s u m o s e y f p 的酶切特异性检测表明e c f p s u m o s e y f p 可被有效酶 切用于荧光共振能量转移底物。 结论 利用p r e c e i v e r b o ! 。l 表达载体表达e c f p s u m o e y f p 蛋白，为进一步的 荧光共振能量转移研究打下了实验基础。 关键词：s u m o ，s e n p ，e c f p s u m 0 e y f p 融合蛋白，原核表达，纯化，克隆 2 温州医学院硕士学化论文 c o n s t r u c t i o n ，e x p r e s s i o na n di d e n t i f i c a t i o no f e c f p s u m o e y f pf u s i o ng e n e a b s t r a c t o b j e c t i v e t oc o m b i n ee c f pg e n e ，e y f pg e n ea n dh u m a ns u m og e n et oc o n s t r u c t e c f p s u m o - e y f pf u s i o ng e n e b yg a t e w a yt e c h n o l o g y ，t oe x p r e s st h ef u s i o n p r o t e i nt h r o u g ht r a n s f o r m i n gi n t oe c o l ib l 21 ，t h u st oe s t a b l i s has o u n df o u n d a t i o n f o rt h ef u r t h e rr e s e a r c ho fp r e p a r i n gf lu o r e s c e n c er e s o n a c ee n e r g yt r a n s f e r ( f r e t ) e x p e r i m e n t m e t h o d s 1 e c f pg e n ew a sc l o n e da n dt r a n s f o r m e di n t op l a s m i dp d e l i v e r 0 2b yt w o s t e p p c ra n db pr e a c t i o n p l a s m i de x t r a c t i o n ，r e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s ed i g e s t i o na n d s e q u e n c i n gw a sc o m p l e t e dt ov e r i f yt h ee n t r yc l o n ee c f pd e v 0 2w a sc o n s t r u c t e d c o r r e c t l y 2 e y f pg e n ew a st h e nc l o n e da n dt r a n s f o r m e di n t o p l a s m i dp d e l i v e r 0 1b y t w o - s t e p p c ra n db p r e a c t i o n ，f o l l o w e db yp l a s m i de x t r a c t i o n ，r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s ed i g e s t i o na n ds e q u e n c i n gt ov e r i f yt h ec o r r e c tc o n s t r u c t i o no fp l a s m i d ， t h e nt h e e n t r y c l o n ee y f pg e n ew a st r a n s f o r m e di n t o e x p r e s s i o n v e c t o r p r e c e i v e r - b 01 1b yr e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s ed i g e s t i o n ，l i g a t i o na n dr jr e a c t i o n 3 t h es u m o ig e n e ，s u m 0 2g e n ea n ds u m 0 3g e n ew e r ea m p l i f i e db yp c r a n dc o m b i n e dw i t he y f pb 01 it oc o n s t r u c te x p r e s s i o nv e c t o rs u m o1 一e y f p b o i 1 ，s u m 0 2 一e y f pb 0 1 1a n ds u m 0 3 一e y f pb o i 1r e s p e c t i v e l y ，f o l l o w e db y f u r t h e rc o m b i n e dw i t he c f pa m p li f i c a t i o np r o d u c t st of o r me c f p s u m oi e y f p b 0 1 1 ，e c f p s u m 0 2 e y f pb 0 1 1a n de c f p s u m 0 3 e y f pb 0 1 1 4 t h ef u s i o n g e n e s e c f p s u m oi - e y f p ，e c f p - s u m 0 2 一e y f pa n d e c f p - s u m 0 3 一e y f pw e r et r a n s f o r m e di n t oe c o l ib l 21a n di n d u c e db yi p t gf o r t h ee x p r e s s i o n ，a n dr e c o m b i n a n tp r o t e i n sw e r ea n a l y z e dw i t hs d s p a g ea n d p u r i f i e db yn i - n t aa g a r o s ec o l u m ni o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y ，t h e nt h es p e c i f i c e n d o n u c l e a s ed i g e s t i o no fs e n pt ot h es u b s t r a t ee c f p - - s u m o - e y f pw a sa n a l y z e d b yr e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s ed i g e s t i o n r e s u i t s 3 1 e n t r y c l o n ee c f pd e v 0 2 ，e n t r y c l o n ee y f pd e v 01a n de x p r e s s i o nv e c t o r e y f pb 0 1 1w a ss u c c e s s i v ec o n s t r u c t e d 2 t h ef u s i o ng e n ee c f p s u m o s e y f pa n dt h r e es u b t y p e sf u s i o ng e n e so f s u m o sw e r ec o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l y 3 t h es o l u b l ee x p r e s s i o n p r o d u c t s o fe c f p - s um o - e y f pp r o t e i nw e r e a c q u i r e di ne c o l ib l 2 1 s d s p a g ea n a l y s i ss h o w e dt h er e l a t i v em o l e c u l a r m a s so f t h e s ef u s i o np r o t e i nw e r ec o n s i s t e n tw i t ht h e o r e t i c a lo n e s ，a n de c f p - s u m o s 。e y f p c a nb ed i g e s t e de f f e c t l y f o rf l u o r e s c e n c er e s o n a c ee n e r g yt r a n s f e r ( f r e t ) e x p e r i m e n tt h r o u g ht h es p e c i f i ce n d o n u c l e a s ed i g e s t i o no fu l p a n ds e n pt ot h e s u b s t r a t ee c f p s u m o e y f p c o n c l u s i o n w ee x p r e s s t h ee c f p s u m o e y f pp r o t e i n b ye x p r e s s i o n v e c t o r p r e c e i v e r - b 0 1 1 ，w h i c he s t a b l i s has o u n df o u n d a t i o n f o rt h ef u r t h e rr e s e a r c ho f p r e p a r i n gf l u o r e s c e n c er e s o n a c ee n e r g yt r a n s f e r ( f r e t ) e x p e r i m e n t - k e v w o r d s ：s u m o ，s e n p ，e c f p s u m o - e y f p f u s i o n p r o t e i n ，p r o k a r y o t l c e x p r e s s i o n ，p u r i f i c a t i o n ，c l o n e 4 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已 经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已 在文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名： 互阻吼珥丛 关于学位论文使用授权声明 本人完全了解温州医学院有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留 学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将 。学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权 将学位论文的内容编入有关数据库进行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇 编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 日期： 导师 温州医学院硕士学位论文 前言 小泛蛋白样修饰蛋i 兰l ( s m a l lu b i q u i t i n 1 i k em o d i f e r ，s u m o ) 是存在于真核生 物中高度保守的蛋白家族，虽然s u m o 化修饰过程与泛素化修饰过程的酶体系 具有高度同源性，循环过程相似，s u m oc 端序列与泛素有8 0 同源性，二级 结构上极其相似，并且两者的四级结构都具有典型的“泛蛋白折叠”【l ，2 】，但两者 存在截然相反的生物学功能。泛素化修饰的靶分子主要被蛋白酶体降解，而 s u m o 化修饰则增加蛋白质的稳定性。s u m o 通过异肽键与靶蛋白连接，参与 多种蛋白质的翻译后修饰，介导不同的细胞内反应，如靶分子定位、功能调节 及相互作用，参与调控线粒体分裂、d n a 损伤修复，近年来发现s u m o 化修饰 还能够调节基因组稳定性、调控离子通道及生物节律1 3 , 4 , 5 。所有的s u m o 蛋白 都具有保守的泛素结构域和c 端又 2 g l y 的断裂连接位点，为特异的蛋白蛋白相 互作用提供结构基础1 6 1 。脊椎动物中已发现四个s u m o 成员，分别为 s u m o 一1 ，2 ，3 ，4 。 s u m o 化循环是由s u m o 特异性蛋白酶s e n p ( s e n t r i n s p e c i f i cp r o t e a s e ) 家族 调节的可逆循环。s e n p 属于半胱氨酸蛋白酶超家族，功能是切除s u m o 前体的 c 端，及介导去s u m o 化使s u m o 分子重新进入循环【7 1 。哺乳动物中至少有8 种 s e n p ，称为s e n p i 8 。它们在细胞中的定位不同，不同的酶对不同的s u m o 具 有一定的底物特异性i s , 9 。由于s u m o 化修饰参与哺乳动物重要的生理生化调 节，s u m o 调节紊乱会导致很多疾病的发生【5 1 ，而s e n p 的表达及活性与s u m o 化密切相关。因此，s e n p 的表达情况可以作为一种检测指标，可以通过体外定 性及定量检测s e n p 的表达情况，来评价s u m o 化修饰。 为了在凝胶上区别s u m o 前体及其成熟状态，本文构建并表达了 e c f p s u m o e y f p 融合蛋白，即在s u m o 两端分别加e c f p ( e n h a n c e dc y a n f l u o r e s c e n tp r o t e i n ) 平口e y f p ( e n h a n c e dy e l l o wf l u o r e s c e n tp r o t e i n ) ，s u m o 与e y f p 之间的“g g ”位点会在s e n p 酶作用下使7 0 k d a 的融合蛋白断裂为成熟形式的 4 3 k d a 的e c f p s u m o 和2 7 k d a 的e y f p 分子。以这种方法我们初步鉴定了 s e n p l c ( s e n p lc a t a l y t i cd o m a i n ) 和s e n p 2 c 的底物特异性。此外，融合蛋白 e c f p s u m o e y f p 可用于荧光共振能量转移实验检测s e n p 的活性及含量，评 价s u m o 化修饰，具有一定的应用与临床诊断的潜力。 s u m o 化与疾病的相关性可将其作为疾病临床检测靶标，目前常规的免疫 学方法无法予以鉴别。因此探索新的检测方法是非常必要的。荧光共振能量转 移( f r e t ) 技术构建的蛋白酶检测器具有高灵敏度和高特异性，可用于通过检 测s e n p 的表达及活性进而评价s u m o 化，本实验的工作对进一步开展基于 5 温州医学院硕士学位论文 f r e t 的临床相关研究做了充分的准备。 温州医学院硕士学化论文 第一章e c f p 基因的克隆 1 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 菌种与细胞株 含e c f p 基因序列的质粒 p d e l i v e r 0 2 e c o i ld h 5 a a d a p t o r r e c f pp r i m e r 1 1 2 酶制剂 b pc l o n a s e x m n i t 4d n a 连接酶 三rc l o n a s e 1 1 3 试剂、试剂盒类 质粒小量抽提试剂盒 p c r 产物纯化试剂盒 d n a 片段胶回收试剂盒 中i i j 大学惠赠 复能基因公司 复能基因公司 复能基因公司 m w g b i o t e c h 公司合成 复能基因公司 n b e 公司 n b e 公司 复能基凶公司 宝生物工程( 大连) 有限公司 宝生物工程( 大连) 有限公司 宝生物工程( 大连) 有限公司 1 1 4 分子量标准品 d l 2 0 0 0d n al a d d e rm a r k e r 宝生物工程( 大连) 有限公司 d l 2 0 0 0 + 1 5 0 0 0d n al a d d e rm a r k e r 宝生物工程( 大连) 有限公司 蛋白分子量标准l p h a n n a e i a 公司 1 1 5 仪器设备 p u r e l a bc l a s s i c 超纯水仪 h a n g p i n gf a 2 0 0 4 分析( 称量) 天平 a i rt e c h 超净工作台 蛋白电泳及蛋白转印系统 h z q x 1 0 0 振荡培养箱 英国e l g al a b w a t e r 公司 上海精科天平实业有限公司 苏净集团安泰公司 美国b i o r a d 公司 哈尔滨东联电子技术开发有限公司 温州医学院硕士学位论文 m y c y c l ep c r 仪 d y y 5 型稳压稳流电泳仪 g e n eg e n i u s 生物成像系统 5 4 17r 小型台式高速冷冻离心机 5 8 0 4r 台式高速大容量冷冻离心机 美国b i o r a d 公司 北京六一仪器厂 英国s y n g e n e 公司 德国e p p e n d o r f 公司 德国e p p e n d o r f 公司 1 2 方法 1 2 1 e c f p 的上下游引物设计 根据g e n e b a n k 中的序列信息，使用p r e m i e r 5 0 软件设计引物。e c f p 的 上下游引物设计，计时于引物两端加上x m nl ，x h ol 的酶切位点。引物的长度 以2 5 p b 左右为宜，回文序列长度不超过6 b p ，重复序列不超过4 b p ，茎环结构的 长度不超过3 b p ，t m 值在5 0 。c 6 5 ，g c 含量在3 0 - 6 0 之间。 表1 实验用引物序列 引物序列 e c f pp f ( f w d ) 5 lg a a g g a a a c g g t a c c a t g a g t a a a g g a g a a g a a c t t t t c 一3 e c f pp r ( r e v ) 5 ，_ t g c g g c c g c a c t c g a g c t a t t t g t a t a g t t c a t c c a t 一3 7 1 2 2 两步p c r 反应扩增e c f p 第一步p c r 反应体系： 成分 l ) 含e c f p 的质粒 p r e m i e rp f p r e m i e rr f m i x d d h 2 0 0 3 0 4 0 4 8 1 6 3 ( m i x ：p f u4 1 a i ，5 ua m p l i f i e r0 2 0 , 1 ，d m s o2 l ，d d h 2 01 8 1 ) 反应条件如下： 9 4 9 4 5 5 6 8 6 8 ；兰i 三；) 5 c y c - e s 8 温州医学院硕士学位论文 第二步p c r 反应体系： 反应条件如下： 成分 量( 止) 第一步p c r 产物 接头引物a d a p t o r - r m i x d d h 2 0 2 2 1 6 3 0 9 4 9 4 6 2 6 8 6 8 ；薰 2 5 c y c - e s 取8 9 lp c r 产物进行l 琼脂糖( 0 5 x t b e ) 凝胶电泳 1 2 3 纯化p c r 产物 1 ) p c r 产物加t e ( p h 8 0 ) 补至2 0 0 “! ，加1 0 0 i t l2 5 p e g ； 2 ) 离心( 1 2 0 0 0 r p m * 1 5 m i n ) ； 3 ) 上清，加2 0 0 p i7 5 乙醇； 4 ) 离心( 1 2 0 0 0 r p m * 8 m i n ) ； 5 )室温挥发至干； 6 ) d d h 2 0 溶解沉淀，取5 1 a l 电泳。 1 2 4b p 反应得到e n t r y c l o n ee c f pd e v 0 2 反应体系如下： 成分 量0 t l ) e c f p 两步p c r 纯化产物 5 x b pb u f f e r p d e li v e r 0 2 b pc l o n a s e d d h 2 0 3 4 l 4 8 加好后，充分混匀置于2 5 反应2 h 9 温州l 廷学院硕士学位论文 1 2 5 转化 1 )将感受态细胞d h 5 a 从- 8 0 冰箱取出置冰中融化； 2 )在火菌的1 5 m l 离心管的管盖上标上记号c l o n e 代号； 3 )超净台中取5 lb p 产物到已标记好的1 5 m l 离心管底部，加入1 0 0 1 a l 感 受态细胞，冰浴6 0 m i n ； 4 )于4 2 热激l m i n ，然后冰浴3 m i n ： 5 ) 加入4 0 0 9 l 的s o c 培养基，放入3 7 ( 2 摇床，2 2 0 r p m ，1h ； 6 ) 从摇床中取出转化物，于超净台巾取5 0 0 p , l 到k + t 平板上，加入1 0 颗 灭菌的玻璃珠，轻摇几秒，将之涂干涂匀； 7 )将l b 平板倒置放入3 7 。c 恒温箱过夜。 1 2 6p c r 检菌 反应体系如下： 成分 量 单菌落 e c f pp r i m e rp f e c f pp r i m e rp r m i x d d h 2 0 半个 0 5 9 l 0 5 9 l 8 1 x l 16 l ( m i x ：p f u4 9 l ，5 ua m p l i f i e r0 2 9 l ，d m s o2 p l ，d d h 2 01 8 9 1 ) 反应条件如下： 9 4 5 m i n 9 4 3 0 s e c 5 5 * ( 23 0 s e c l2 5 c y c l e s 6 8 l m i n 6 84 c7 m i n 取8 1 a lp c r 产物电泳 1 2 7 接种 挑取阳性菌落接种至5 m lk a n a 抗性l b 培养基试管，放入3 7 c 摇床， 2 2 0 r p m 培养过夜。 1 2 8 提取质粒e c f pd e v 0 2 1 ) 取3 m l 菌液，分两次1 2 0 0 0 r p m 离心3 0 s ，弃上清： 温州氏学院硕士学位论文 2 、 加入2 5 0 t t ls o l u t i o ni ，振荡器重悬； 3 ) 加入2 5 0 y is o l u t i o ni i ，轻轻颠倒4 6 次，混匀： 4 1 加入3 5 0 p ls o l u t i o n l i i ，轻轻混匀，冰浴1 0 m i n ，1 2 0 0 0 r p m 离心l o m i n ； 5 ) 取上清至核酸纯化柱，1 2 0 0 0 r p m 离心1 r a i n ； 6 ) 加入5 0 0 p 1b u f f e rh b ，稍微放置一会再离心，转速逐渐升高至1 0 0 0 0 r p m ， 离心1m i n ； 7 ) 加入7 0 0 id n a w a s hb u f f e r ，1 2 0 0 0 r p m 离心l m i n ，洗两次； 8 1 空管1 2 0 0 0 r p m 离心2 m i n ； 9 )将核酸纯化柱转至1 5 m l 离心管，加入6 0 i t llm mp h 8 0t r i s - h c i 离心 l m i n ，将离心后溶液保存至2 0 。c 冰箱。取2 i i l 质粒进行1 琼脂糖( 0 5 x t b e ) 凝胶电泳。 1 2 9p c r 检测质粒e c f pd e v 0 2 反应体系如下： 成分 量( b l ) p l a s m i d e c f pp r i m e rp f e c f pp r i m e rp r m i x d d h 2 0 0 5 0 5 0 5 8 l5 5 ( m i x ：p f u4 1 a l ，5 u a m p l i f i e r0 2 1 a l ，d m s o2 p l ，d d h 2 01 8 p 1 ) 反应条件如下： 9 4 c 5 m i n 9 4 ( 2 3 0 蹴、 5 5 3 0 s e c l 2 5 c y c l e s 6 啦 m i n j 6 8 7 m i n 取8 “i 检菌产物进行1 琼脂糖( o 5 x t b e ) 凝胶电泳 1 2 1 0e c f pd e v 0 2 测序 将提取的e c f pd e v 0 2 质粒送至复能公司测序 2 结果 2 1 两步p c r 反应扩增e c f p 1 1 ! ! ! ! ! ! ! 1 2 些 2 1 1 两步p c r 反应 扩增的基因h 段大小约为7 5 1 b p ，与预期值相一致。结果如同12 所示。 图l3 两步p c r 产物纯化产物电泳 2 2b p 反应得到e c f p 入门克隆 2 , 2 1b p 反应产物转化后p c r 检菌 p c r 鉴定。如图14 ，除第7 、8 道外，其它均为阳性。挑选阳睦苗落接利 至k a n a 抗性l b 培养基。 m k 学院碰任论丘 7 5 i b p暖 刚i4b p 反应产物转化后p c r 检菌 2 2 2 提取质粒e c f pd e v 0 2 接种的茼液中提啦质粒e c f pd e v 0 2 ，1 琼脂糖凝胶电林显示，所提质粒大 小与预期值相一致。结果如罔15 所不。 罔15 提取质粒e c f p d e v 0 2 2 2 3 p c r 检测质粒e c f p l ) e v 0 2 扩增的荜因片段= 小约为7 5 】b 9 ，1j 预期值相一致 韫州学院碰学n 论文 图16p c r 检测质釉e c f p d e v 0 2 2 2 4 e c f p d e v 0 2 测序 将得到的入门克隆e c f pd e v 0 2 ，经测序验证，测序结果与g e n e b a n k 报道 的e c f p 基因序列相一致，说明从中山大学赠送的质粒中成功克隆了e g f p 的基 因序列，并将摹因序列构建到入门克隆d e v 0 2 中。e c f p 的核酸序列如下： a r g a g t 似g g a g a a g a a c t t 丌a c t g g a g i t g t c c c a a l t c t t g t t g a a n a g a l g o t g a t g r r a a t g o g c a c a a a 盯丌c t g t c a g t g g a g a g g g t g a a g g t g a l 、g c a a c a l a c g g a a a a c l r a c c c l l a a a 兀t 1 t t g c a c t a c t g g a a ac t a c c t g t t c c a t g g c c c a c c c t c g t g a c c a c c c t g a c c t g g g g c g t g c a g t g c t t c a o c c o c l a c c c c g a c c a c a t g a a g c a g c a c g a c t t c l t c a a g t c c g c c a r g c c c g a a g g c l a c g t c c a g g a g c g c a c c a t c l l t t c a a g g a c g a c g g c a a c l a c a a g a c c c g c g c c g a g g t g a a g t t c g a o g g c g a c a c c c t g g t g a a c c g c a t c g a g c t g a a g g g c a l l c g a c t i c a a g g a g g a c g g c a a c a l c t g g g g c a c a a g c t g g a 0 1 a c a a c t a c a t c a g c c a c a a c g t c n u m a c c g c c g a c a a g c a o a a g a a c g g c a t c a a g g c c a a c t t c a a g a t c c g c c a c a a c a t c g a g g a c g 0 c a g c g t o c a g c t c g c c g a c c a c l a c c a g c a g a a c a c c c c c a t c g g c g a c o g c c c c g t g c t g c t g c c c g a c a a c c a c t a c c t g a g c a c c c a o t c c g c c c l l t c g a a a g a t c c c a a c g a a a a g a 6 a g a c c a c a l - o g t c c t t c t t g a g 丁几1 g 1 a a c a g c t g c t g g g a 丌 c a c a t g g c a t g g a t g a a c t a t a c a a a t a g 温州医学院硕士学位论文 第二章e y f p 基因的克隆 1 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 菌种与细胞株 含e y f p 基因序列的质粒载体复能基凶公司 p r e c e i v e r 。m l5 a p d e l i v e r 0 1 复能基因公司 p r e c e i v e r - b 0 1 1 空载体 复能基因公司 e c o i ld h 5 a 复能基冈公司 a d a p t o r - r 复能基因公司 e c f pp r i m e r m w g b i o t e c h 公司合成 1 1 2 酶制剂 t 4d n a 连接酶 x m n i l rc l o n a s e b pc l o n a s e 1 1 3 试剂、试剂盒类 质粒小量抽提试剂盒 p c r 产物纯化试剂盒 d n a 片段胶回收试剂盒 n b e 公司 n b e 公司 复能基因公司 复能基因公司 宝生物工程( 大连) 有限公司 宝生物工程( 大连) 有限公司 宝生物工程( 大连) 有限公司 1 1 4 分子量标准品 d l 2 0 0 0d n al a d d e rm a r k e r 宝生物工程( 大连) 有限公司 d l 2 0 0 0 + i5 0 0 0d n al a d d e rm a r k e r 宝生物工程( 大连) 有限公司 蛋白分子量标准ip h a n n a e i a 公司 1 2 方法 1 2 1 引物设计 e c f p 与e y f p 两端序列相同，因此可用同一对引物。 1 2 2 两步p c r 反应扩增e y f p 基因 温州i 廷学院硕士学位论文 第一步p c r 反应体系如下： 成分 量( 此) p r e c e i v e r - m15 a ( 5 0 n g i t 1 ) p r e m i e r ( 5 p m o l i t 1 ) h s h fm i x d d h e o t o t a l 0 2 0 4 1 2 1 2 4 2 5 ( h s h fm i x ：h s h f0 2 l a l ，5 x h s h fb u f f e r5 1 a l ，2 5 p md n t p0 2 i _ t i ，5 m 9 2 + 5 p l ， d d h 2 01 6 1 a 1 ) 反应条件如下： 9 8 9 8 6 0 7 2 7 2 第二步p c r 反应体系如下： lm i n 3 0 s e c 30sec5c，ycles40sec ll 一， 7 m i n 成分 量( “l ) 第一步p c r 产物 a d a p t o r - r ( 5 p m o l l a l ) h s h fm i x d d h 2 0 t o t a l 2 2 2 4 2 2 5 0 反应条件如下： 9 8 l m i n 3 0 s e c 9 8 1 0 s e c 5 8 ( 2 3 0 s e e i 2 5 c y c l e s 7 2 c4 0 s e c 7 2 7 m i n 取8 ip c r 产物进行1 琼脂糖( 0 5 x t b e ) 凝胶电泳 1 2 3 纯化p c r 产物 1 ) p c r 产物加t e ( p h 8 0 ) 补至2 0 0 t l ，加1 0 0 i ，t l2 5 p e g 2 )离心( 1 2 0 0 0 r p m 木1 5 m i n ) 温州医学院硕士学位论文 3 )弃上清，加2 0 0 9 l7 5 乙醇 4 ) 离心( 12 0 0 0 r p m * 8 m i n ) 5 )弃上清，乙醇室温挥发至干 6 ) 加2 0 9 ld d h 2 0 溶解沉淀，取4 p l 电泳 1 2 4b p 反应得到e n t r y c l o n ee y f pd e v o l 反应体系如下： 成分 量( l ) e y f p 两步p c r 纯化产物 5 x b pb u f f e r p d e li v e r 01 ( 3 0 0n g 9 1 ) b pc i o n a s e d d h 2 0 t o t a l 3 4 l 4 8 2 0 加好后，充分混匀置于p c r 仪中2 5 。c 水浴中反应2 h 1 2 5 转化 6 p lb p 产物，加入1 0 0 p l 感受态细胞，冰浴6 0 m i n 。于4 2 。c 热激1m i n ，然后 冰浴3 m i n ，加入4 0 0 1 的s o c 培养基，放入3 7 摇床，2 2 0 r p m ，l h r 。然后取 5 0 0 p l 涂到k a n a 抗性r 板上，置3 7 c 恒温箱过夜。 1 2 6p c r 检茵 反应体系如下： 成分 量 单菌落 e y f p p r i m e r ( 5 p m o l 1 ) m i x d d h 2 0 t o t a l 半个 1 l a l 8 9 l 1 6 p l 2 5 p l ( m i x ：p f u4 p l ，5 ua m p l i f i e r0 2 9 l ，d m s o2 p 1 ，d d h 2 0i 8 p 1 ) 反应条件如下： 9 4 5 m i n 1 7 温州医学院硕士学位论文 9 4 5 5 6 8 6 8 取8 p l 榆菌产物电泳 1 2 7 接种 挑取阳性菌落接种至5 m lk a n a 抗性l b 培养基试管，放入3 7 摇床，2 2 0 r p m 培养过夜 1 2 8 提取质粒e y f pd e v 0 1 步骤同前，取l l 质粒进行l 琼脂糖( 0 5 x t b e ) 凝胶电泳 1 2 9p c r 检质粒e y f pd e v 0 1 反应体系如下： 成分 量( p l ) e y f pd e v o l 质粒 e y f pp r i m e r ( 5 p m o l 1 ) m i x d d h 2 0 t o t a l 0 2 1 8 1 5 8 2 5 ( m i x ：p f u4 l i ，5 ua m p l i f i e r0 2 1 a l ，d m s o2 1 a i ，d d h 2 01 8 p 1 ) 反应条件如下： 9 4 5 m i n 9 4 3 0 s e c 5 5 o 3 0 s e c l5 c y c l e s 6 8 l r a i n j 6 8 7 m i n 取8 p l 检菌产物进行1 琼脂糖( o 5 x t b e ) 凝胶电泳 1 2 1 0i l l 反应获得表达载体e y f pb 0 1 1 1 )酶切反应： 用a c c 6 5 1 分别对e y f pd e v 0 1 质粒和p r e c e i v e r - b 0 1 1 空载体进行酶切： 成分 量( p l ) y 2 l i 、 m m 呱峨m m 3 3 7 温州医学院硕士学位论文 e y f pd e v o l l0 x n eb u f 佗r 3 a c c 6 5 1 1 0 0 x b s a d d h 2 0 t o t a l 5 2 0 3 0 2 1 2 5 2 0 3 7 * ( 2 水浴锅中进行酶切反应2 h r s 。之后置6 5 。c 2 0 m i n 灭活。取1 u l 质粒， 3 u l 酶切产物电泳。 分 量( 1 a l l p r e c e i v e r b 0 1 1 l0 x n eb u f - f e r 3 a c c 6 5 i 1 0 0 x b s a d d h 2 0 t o t a l l5 2 o 5 0 2 2 3 2 0 3 7 * (