（临床检验诊断学专业论文）抗ctgf单链抗体的制备及其在抑制肺纤维化形成中的作用.pdf

l 剃i 必y 17 6 13 4 7 p r e p a r a t i o no f a n t i - c t g fs c f va n di t se f f e c t o ni n h i b i t i o no f d e v e l o p m e n to fp u l m o n a r y f i b r o s i s at h e s i ss u b m i t t e dt o s o u t h e a s tu n i v e r s i 妙 f o rt h ea c a d e m i cd e g r e eo fm a s t e ro fm e d i c i n e b y g o ul i x i a s u p e r v i s e db y a s s o c i a t ep r o f e s s o r w u g u o - q i u s c h o o lo fc l i n i c a lm e d i c i n e s o u t h e a s tu n i v e r s i t y a p r i l 2 0lo 东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用 过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示了谢意。 研究生签名： 蜀囡盎 日期： 鲨! 堡，茎! 垄2 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的 复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内 容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可 以公布( 包括以电子信息形式刊登) 论文的全部内容或中、英文摘要等部分内容。论文 的公布( 包括以电子信息形式刊登) 授权东南大学研究生院办理。 研究生签名：毯厘啦导师签 研究生签名：! 鸢酬强导师签 中文摘要 抗一c t g f 单链抗体的制备及其在抑制肺纤维化 形成中的作用 东南大学医学院 研究生：苟丽霞导师：吴国球副教授 摘要 背景：结缔组织生长因子( c o i l i l e c t i v et i s s u e 擎。嘶hf a c t o r c t g f ) 作为转化生长因子 ( t r a n s f o m i n gg r o w c hf a c t o r b e t a ，t g f - p ) 的下游效应因子，可以介导细胞迁移、侵袭、 血管发生和细胞凋亡，促使胶原及纤维连接蛋白等细胞外基质的产生和沉积，可能是最 终导致组织器官纤维化的关键因子；肺纤维化是严重威胁人类健康的致死性肺间质疾 病，以肺间质中间质细胞的异常增殖、弥漫性或局限性成纤维细胞灶的存在为主要病理 特征，目前对肺纤维化的传统治疗对改善病人生存率或阻止病程进展缺乏明确的依据。 目的：获得具有生物学活性的抗c t g f 单链抗体( s i n g l e c h a i nv 撕a b l e 行a g m e n to f 觚t i b o d y ，s c f v ) 纯品；研究其在抑制肺纤维化形成和发展中的作用；探索其对肺成纤 维细胞表型转化的影响以及可能的信号通路，初步阐明其作用机制。 方法：1 将p e t 3 2 a 一眦s c f v h i s 质粒转化e c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) 感受态细胞，i p t g 诱导表达 融合蛋白，用n 1 ar e s i n 亲和层析初步纯化后用凝血酶酶切，s e p h a d e x g 5 0 凝胶过滤层 析再次纯化，用s d s p a g e 方法鉴定纯度；以双夹心e l i s a 方法检测抗体的免疫活性； 2 通过气管内注射博莱霉素建立小鼠肺纤维化模型，尾静脉注射抗c t g fs c f v 进行干预。 将实验动物分为四组：n s + n s 组( 气管内与尾静脉均注射生理盐水) ，n s + s c f v 组( 气 管内注射生理盐水，尾静脉注射抗c t g f 单链抗体) ，b l m + n s 组( 气管内注射博莱霉 素，尾静脉注射生理盐水) ，b l m + s c f v 组( 气管内注射博莱霉素，尾静脉注射抗c t g f 单链抗体) ，分别于7 、1 4 、2 8 天时测定小鼠肺泡灌洗液细胞总数以及细胞分类计数、肺 组织羟脯氨酸含量；肺组织石蜡切片h e 染色与m a s s o n 染色观察肺泡炎和肺纤维化程度； 免疫组织化学染色法观察肺中c t g f 表达的部位及表达量；3 用c t g f 刺激体外培养的人 肺成纤维细胞，然后用抗c t g fs c f v 干预，用w | e s t e mb l o t t i n g 检测0 【s m a 及磷酸化 e r k l 2 表达量的变化。 结果：经过两步层析纯化后，抗c t g fs c f v 纯度达到9 0 以上，体外免疫学试验显示 目的蛋白具有良好的c t g f 结合活性。经抗c t g fs c f v 处理后第7 天、第1 4 天，b l m + n s 组和b l m + s c f v 组小鼠b a l f 中细胞总数及巨噬细胞、淋巴细胞明显高于其它组 ( p 0 0 5 ) ，b l m + s c f v 组明显低于b l m + n s 组( 尸 0 0 5 ) ；肺病理切片h e 和m a s s o n 染色显示b l m + s c f v 组肺泡炎和纤维化程度降低； 东南大学硕士学位论文 免疫组织化学染色结果显示，b l m + s c f v 组与b l m + n s 组相比，肺组织中c t g f 的表 达明显减少；w e s t e mb l o t t i n g 结果显示，人肺成纤维细胞用c t g f 刺激后再以s c f v 干 预后，q - s m a 明显低于c t g f 组( p 0 0 5 ) ，磷酸化e r k l 2 水平明显低于c t g f 组 ( 氏o 0 5 ) 。 结论：c t g f 可促进肺成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，导致细胞外基质合成增加；抗 一c t g fs c f v 可有效抑制c t g f 的生物学活性，延缓博莱霉素诱发的肺纤维化；中和c t g f 活性的方法是抑制肺纤维化形成和发展的一条有效途径。 关键词：结缔组织生长因子；单链抗体；博莱霉素；肺纤维化；肺成纤维细胞 i l 英文摘要 p r e p a r a t i o no f a n t i - c t g fs c f va n di t se f f e c t o ni n h i b i t i o no fd e v e l o p m e n to fp u l m o n a r y f i b r o s i s p o s t 铲a d u a t e ：g o ul i - x i a 1 u t o r ：w ug u o - q i u c i i n i c a lm e d i c a lc 0 1 l e g eo fs o u m e a s tu i l i v e r s i t ) ， a b s t r a c t b a c k g r o u n d ：c o 皿e c t i v et i s s u eg r o w mf j 扰t o r ( c t g f ) m a yr e g u l a t ec e l lm i g r a t i o n ，i n v a s i o n ， a j l g i o g e n e s i s ，a 1 1 0 s ，a n dp r o d u c t i o na l l dd e p o s i t i o no fc o l l a g e na i l d 舶r o n e c t i n ，嬲w h i c hi s ad o w n s t r e 锄e 虢c t o ro f 仃a 1 1 s f o m i n gg r o 叭hf a c t o r ( t g f p ) c t g fm a yb ea k e yf a c t o rm a t i r o l v e di nt h ed e v e l o p m e n to ft i s s u ef i b r o s i se v e n t u a l l y p u l m o n a d ，f i b r o s i si sal e t h a l i n t e r s t i t i a ll u n gd i s e a l s ew h i t c hc h a u r a c t e r i z e dw i t hf o 册a t i o no ff i b r o b l a s tf o c i a sa i l da b n o 咖a l p r o l i 免r a t i o no fi n t e r s t i t i a lc e u si n n l e1 u n 班i s s u e t h e r ew e r en o te n o u g he v i d e n c e st 1 1 a t t r a d i t i o n a lt r e a 仃n e n t st op u l m o n a d rf i b r o s i sc o u l di m p r o v ep a t i e n ts u n r i v a lo rp r e v e n tt l l e p r o g r e s s i o no ft h ep u l m o n a d ，f i b r o s i s o b j e c t i v e ：t h er e s e a r c hi sa i m e dt oo b t a i nt l l er e c o m b i n a n tp r o t e i no ft h ea 1 1 t i c t g fs c f v ( s i n g l e - c h a i nv 撕a b l ef 如l e n to fa n t i b o d y ) w i t hb i o l o g i c a la c t i v 咄a n di n v e s t i g a t et h e i n h i b i t i o ne 虢c to ft h es c f va n t i b o d yo nd e v e l o p m e n to fp u l m o n a r y 舶r o s i s n l ee 肫c t so n t r m s f o m a t i o no ft h ef i b r o l a s t si n t ot h em y o f i b r e l a s t sa 1 1 ds i 舯a lp a t r w a yi n v o l v e di i lw 2 l s a l s oe x p l o r e d m e t h o d s ：1 i p t gw 嬲u s e dt 0i n d u c et h e e x p r e s s i o n o f 如s i o np r o t e i n 撕e rt 1 1 e p e t 3 2 a - 地【a - s c f v h i sp l a s m i dw a st 啪s f o 咖e di n t ot 1 1 ec o m p e t e mc e l l so fe c o l ib l 21 ( d e 3 ) t h em s i o np r o t e i n 、v a sd i g e s t e dw i t hm r o m b i n 撒e rp 嘶f i e d 淅t l lt h en ir e s i na 伍1 1 i 哆 c h r o m a t o 伊a p h y t h e 肌t i - c t g fs c f vw a st h e nr e _ p u r i f i e d 、i mg e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h y s d s - f a g ew a u su s e dt oa n a l y z em ee x p r e s s i o na n dp u r i f i c a t i o no ft 1 1 es c f v d s e l i s aw a s u s e dt od e t e c tt h ea c t i v i 够o ft l l ea n t i - c t g fs c f v 2 m i c ew e r ei 坷e c t e dw i t l lb l e o m y c i n ( b l m ) v i at r a c h e a ( 5 m g k g “) t oe s t a b l i s ht h em o d e l so fp u l m o n a r yf i b r o s i sf o l l o w i n gb y i 画e c t e dw i t ha n t i - c t g fs c f vv i ai n t r a v e n o u s m i c ew e r er a n d o m l ys e p a r a t e di n t 0f o u r g r o u p s t h em i c eo fn s + n sg r o u pw e r ei n j e c t e dw i t l lp h y s i o l o g i c a ls a l i n ev i at r a c h e aa n d i n t r a v e n o u s t h en s + s c f vg r o u p 、e r e 硼e c t e dw i t hp h y s i o l o g i c a ls a l i n ev i a 仃a c h e aa 1 1 d 觚t i c t g fs c f vv i ai n t r a v e n o u s 1 1 1 eb l m + n sg r o u pw e r e e c t e db l mv i at r a c h e aa n d p h y s i o l o g i c a ls a l i n ev i ai n t r a v e n o u s n l eb l m + s c f vg r o u pw e r e e c t e db l mv i at r a c h e a 柚ds c f vv i an 仃a v e n o u s 。a t l e7 t h ，14 t ha i l d2 8 m 姬e ri i l t r a t r a c h e a l e d b r o n c h o a l v e o l a rl a v a g e n u i d ( b a l f ) w e r e c o n e c t e df o rc e l l sc o u n t i n ga n dc l a s s i f i c a t i o n ，a n dp u l m o n 踟了t i s s u e sw e r e i i i 东南大学硕上学位论文 s a m p l e df o rh y d r o x y p r o l i n ea s s a y h ea i l dm a s s o ns t a i na n di m m u n o h i s t o s t a i n i n gw e r eu s e d t oo b s e r v et h ed e 髀eo fa l v e o l i t i sa j l d 舶r o s i s 3 t 1 1 ec u l n 鹏d h 啪a 1 11 u 1 1 9 助r o b i a s t sw e r e i n t e e n e dw i t ha n t i c t g fs c f va r e rt r e a t e dw i t hc t g f t h ew 色s t e mb l o tw 2 l su s e dt o a n a l y z et h ee x p r e s s i o no fa - s m a a n dp h o s p h o - e r k1 2 r e s u l t s ：t h es c f vw a ss e p a r a t e df r o mt h ef u s i o np 孤n e r b yg e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h y a r e ra m n i t yc h r o m a t o g r a p h ya i l dc l e a v a g eb yt h o m b i n ，a n dt h ep u r i 够c o u l dr e a c ho v e r9 0 i m m u n o r e a c t i v i 哆s t u d yd e m o n s t r a t e dt h a tm i ss c f v 、eo b t a i n e dw i t h o u ta n yr e n a t u r e t r e a t m e n th a das p e c i a la 侬n i 何t o w a r d sc t g f a tt h e7 t ha n dl4 ma n e rt r e a t m e mo f a i l t i c t g fs c f v ，t h en u m b e ro ft o t a lc e l l sa n dm a c r o p h a g e sl y m p h o c y t e si 1 1b a l fi nt h e b l m + n sg r o u pa n db l m + s c f vg r o u pw e r eh i g h e rt l l 肌o t h e rg r o u p s 俨 o 0 5 ) ，a n dt h e b l m + s c f v 挚o u pw e r el o w e rt h a nm eb l m + n s 孕o u p 妒 o 0 5 ) h es t a i n a n dm a s s o ns t a i ns h o w e dt h a tt t 伧b l m + s c f v 黟o u ph a dal o w e rd e g r e eo fa l v e o l i t i sa n d 助r o s i si nc o m p 撕s o nw i t hm eb l m + n sg r o u p al o w e re x p r e s s o no fc t g fi nl 眦gt i s s u e s i nt h eb l m + s c f vg r o u pw a sf o u n db yi h l 】枞l n o k s t o 赋n i n ga sc o m p a r e dw i t ht h eb l m + n s g r o u p w b s t e mb l o ts h o w e dal o 、e re x p r e s s o no f0 【一s m ai ns c f vi n t e r v e n t i o n 黟o u pa s c o m p a r e d 、i t ht h ec t g fg r o u p ( p 0 0 5 ) ，a i l da1 0 w e re x p r e s s o no fp h o s p h o e r k l 2a s c o m p a r e dw 池t i l ec t g fg r o u p 俨 0 0 5 ) c o n c i u s i o n ：c t g fc a l lp r o m o t e 舶r o b l a s t st r a s f o m e di n t om y o 丘b r o b l a s t sa n dt h es m e s i s o fe x n a c e l l u l a u rm a t r i x ( e c m ) a m t i - c t g fs c f vc a ne 衔c i e n t l yi i 蛳b i tt h ea c t i v 时o fc t g f a 1 1 da 1 1 e v a t ep u l m o n a r yf i b r o s i si nm i c em o d e li 1 1 d u c e db yb l m nm a yb ea ne 仃e c t i v e p a t h w a yt oi n h i b i tt h ed e v e l o p m e n to fp u l m o n a r ) rf i b r o s i sb yr l e u t m l i z i n gt l l ea c t i v i t ) ，o f c t g f k e yw o r d s ：c o 衄e c t i v et i s s u eg r o w mf a c t o r ( c t g f ) ，t h es i i l g l e - c 梳nv 撕a b l ef m 舯e n to f 觚t i b o d y ( s c f v ) ，b l e o m y c 洫，p u l m o n a r yf i b r o s i s ，l u n gf i b r o b l a s t i v i i i 3 实验结果 4 讨论 5 结论 第三部分抗c t g f 单链抗体对人肺成纤维细胞的影响 l 实验材料” 2 实验方法” 3 实验结果 4 讨论 5 结论 全文结论 参考文献 致谢 4 2 作者简介 v 4 3 4 4 5 2 5 3 h 唱 唱 m 坫 墙 侈 加 加 弱 弱 弘 靳 加 钉 东南大学硕_ j ：学位论文 英文缩写 a s m a b a l f b s a b f g f c a m p c o p d c t g f d m s o e c m e d t a e g f e l i s a e g f f g f e r k f b f f h e p e s h l 冲 h s c i g f i l 1 i p f i p t g l r p m f p b s p d g f p 1 3 k 缩略词表 英文全称 a s m o o t hm u s c l ea c t i n b r o n c h o a l v e o l a rl a v a g ef l u i d b o v i n es e l l l ma l b u m i n b a s i cf i b r o b l a s tg r o 、t hf a c t o r c y c l i ca d e n o s i n em o n o p h o s p h a t e c l l r o n i co b s t m c t i v ep u l m o n a d rd i s e a s e c o r m e c t i v et i s s u eg r 0 、机hf a c t o r d i m e t h y ls u l p h o x i d e e x t r a c e l l u l a u rm a t r i x e t h y l e n ed i 锄i n et e t r a a c e t i ca c i d e p i d e m a lg r o 叭hf a c t o r e m 【y m el i n 薹( e di m m u n o s o r b e n ta s s a y e p i d e n n a lg r o w t l lf a c t o r f i b r o b l a l s tg r o 叭hf i a c t o r e x t r a c e l l u l a rs i g n a l - r e g u l a t e d 虹n a s e f i b r o b l a s t f i b r o b l a s tf o c i h y d r o x y e t h y lp i p e r a z i n e e t h a n e s u l f i o n i c a c i d h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e h e p a t i cs t e l l a t ec e l l h n s u l i n - l i k eg m w c hf a c t o r i n t e r l e u k i n - l i d i o p a t h i cp u l m o n a d rf i b r o s i s i s o p r o p y l 一1 - t 1 1 i o p g a l a c t o p y r a j l o s i d e l o wd e n s i t ) ，l i p o p r o t e i nr e c e p t o r m y o 纳r o b l a s t p h o s p h a t e - b u f 五：r e ds a l i n e p l a t e l e t d e r i v e d 缪o w t hf a c t o r p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l 3 一k i n a s e v i 中文全称 仅平滑肌肌动蛋白 支气管肺泡灌洗液 牛血清白蛋白 碱性成纤维细胞生长因子 环磷酸腺苷 慢性阻塞性肺疾病 结缔组织生长因子 二甲基亚砜 细胞外基质 乙二胺四乙酸 表皮生长因子 酶联免疫吸附试验 表皮生长因子 成纤维细胞生长因子 细胞外信号调节激酶 成纤维细胞 成纤维细胞灶 羟乙基哌嗪乙磺酸 辣根过氧化物酶 肝星状细胞 胰岛素样生长因子 白细胞介素1 特发性肺纤维化 异丙基1 硫代b 呋喃半乳 糖苷 低密度脂蛋白受体 肺肌成纤维细胞 磷酸盐缓冲液 血小板源性生长因子 磷脂酰肌醇( 3 ) 激酶 缩略词表 p k c s d s s t a t t e m e d t g f d t n f 嘣s v e g f p r o t e i nk i n a s ec s o d i u md o d e c y ls u l p h a t e s i g n a l t m s d u c e r s t r a n s c r i p t i o n 蛋白激酶c 十二烷基硫酸钠 肌da c t i v a t o r so f 信号转导蛋白 t e t 删：l 】e t h y le t h y l e n ed i a m i n e t r a l l s f l 0 肌i n gg r o 叭hf a c t o r b e t a t u m o rn e c r o s i sf a c t o r t r i s ( h y d r o x y m e t h y l - ) 锄i n o m e t h a i l e v 瓠c u l a re n d o t h e l i a lg r o 叭hf a c t o r i 四甲基乙二胺 转化生长因子- p 肿瘤坏死因子 三羟甲基氨基甲烷 血管内皮细胞生长因 子 文献综述 文献综述 c t g f 与纤维化的关系 结缔组织纤维化是绝大多数的慢性组织、器官损伤共同的终末病理过程，无论是由 于血管功能障碍、炎症、代谢损伤、创伤，还是环境因素，一旦启动了纤维化的病理过 程，其结果是正常的组织结构逐渐被纤维化组织替代，并最终导致受损器官的功能障碍 或者衰竭，这成为医学领域需要解决的主要难题之一。近年来，人们对于组织器官纤维 化的发生、发展的机制以及阻断其发生发展的研究给予了很大的关注，经过多年的研究 发现，在纤维化形成的过程中，有许多细胞因子和生长因子都起到很重要的作用，如转 化生长因子p ( t g f p ) 、结缔组织生长因子( c t g f ) 、血小板源生长因子( p d g f ) 、血 管内皮生长因子( v e g f ) 、白细胞介素1 ( i l 1 ) 、胰岛素样生长因子( i g f ) 掣卜3 】都通 过各种途径参与纤维化的形成。其中t g f b 是参与纤维化形成的最重要的因子，而c t g f 则是t g f p 诱导纤维化形成的主要的下游因子，在病理情况下，其过度表达与某些增生 性或纤维化疾病的发生发展密切相关，如硬皮病、肾纤维化、肝硬化、肺纤维化、动脉 粥样硬化等。 lc t g f 基因以及蛋白结构 c t g f 蛋白是高度保守的c c n 多肽家族成员之一。c c n 家族成员包括c t g f ( n s p 1 2 ) ，c y r 6 1 ( c e f l 0 ) ，n o v 以及w i s p l e l m l ( m s p ，w n t i n d u c i b l es e c r e t e d p r o t e i n ) ， w i s p 2 r c o p l ，w i s p 3 ，人c t g f 与大鼠、小鼠之间同源性很高，分别是9 6 、9 4 ， 人c t g f 基因位于染色体6 q 2 3 1 ，有5 个外显子，4 个内含子【4 】，其m r n a 长2 4 k b ， 起始点为a t g ，5 端编码区编码1 个分泌肽和4 个功能结构域，3 端编码区包含3 个 a 1 t t a 位点，3 端非编码区含有调控转录后表达的反式作用元件【5 6 】。 c t g f 蛋白为肝素结合型，含3 4 9 个氨基酸，富含半胱氨酸，m r 3 8 0 0 0 ，c t g f 蛋 白n 末端有一个分泌信号肽结构域，随后依次有四个功能结构域，第一个为胰岛素样 生长因子结合蛋白区( i g f b p ) ，属于i g f 结合位点，可以与i g f 结合；第二个是v w f ( v o nw i l l e b r a n df - a c t o r ) 因子的c 型重复区( v w c ) ，可能是t g f p 与c t g f 结合的位 点；第三个是血小板反应蛋白i 型( t s p 1 ) 重复区，可以促进c t g f 与可溶性或基质 大分子物质结合，如结合硫化复合糖；第四个是富含半胱氨酸的c 末端( c t ) ，t g f d 、 p d g f 以及n g f 都有与c t g f 相似的c t 结构，该结构可使生物分子之间二聚化，也与 受体结合有关【7 ，8 】。这四个功能结构域都由各自独立的外显子编码【6 1 。在研究过程中还发 现了一些具有生物学活性的c t g f 亚型结构，这些c t g f 亚型结构由翻译后加工处理或 剪接而形成，例如在体外培养的人原始成骨细胞株h c s 2 2 8 中可分离出较高浓度的无羧 基端c t 区的c t g f 蛋白i 引。 2c t g f 表达的分布与调控 东南大学硕士学位论文 大量的研究显示成纤维细胞、内皮细胞、软骨细胞及平滑肌细胞均可表达c t g f ， 在结缔组织、胎盘以及伤口愈合部位的组织发生纤维化时，组织中c t g f 呈现过表达状 态【l o 1 4 1 。双夹心e l i s a 结果检测显示，硬皮病病人的水疱液中c t g f 含量的多少可以 反映硬皮病病人纤维化的程度【l4 1 。c t g f 的表达可能存在依赖t g f d 和非依赖t g f p 两种表达模式，c t g f 生理水平的表达有赖于机体许多细胞因子或生长因子的平衡作用， 这些因子在体内失去平衡则可能会导致机体病理状态的出现，大量研究显示，成纤维细 胞表达c t g f 主要依赖于t g f p 的诱导。 i g a r a s h i 等【1 5 】发现t g f p l 可以在体外诱导人包皮成纤维细胞过表达c t g f 和细胞 外基质成分，而p d g f 、e g f 和b f g f 等则无此功能，环己亚胺不能阻断t g f d 1 对c t g f 的诱导表达，这表明c t g f 基因的表达受t g f b 1 直接调控。在组织创伤修复时，再生 组织中t g f p l 表达的增高出现在c t g f 增高之前，组织持续纤维化的形成是多种生长 因子共同作用的结果，其中t g f p 1 诱导纤维化的发生，c t g f 则维持纤维化的发展【1 6 】。 c t g f 的反义寡核苷酸或中和性抗体可以抑制t g f p 1 诱导皮肤发生纤维化的作用，表 明t g f d 1 通过c t g f 介导才发挥其促纤维化的作用。 t g f p 主要通过s m a d 3 s m a d 4 途径、p k c 和r a s m e m r k 等多种信号途径诱导 c t g f 表达，c t g f 反过来可以诱导这些信号通路中的因子，形成一个正反馈环，这些 通路错综复杂形成网络【1 7 ，1 8 】。研究发现，c t g f 通过m e 列e r k l 2 和p 1 3 k 信号途径诱 导人肾小管上皮细胞h k 2 表达i l k 从而参与肾脏纤维化过程1 1 9 】。通过p 4 2 4 4m a p k ( e r k l 2 ) 信号通路诱导软骨细胞增生，通过p 3 8 脚k 通路诱导细胞分化，通过e r k l 2 信号通路促进大鼠肾肌成纤维细胞增殖，通过p 1 3 舯l 和转录激活子3 ( s t a t 3 ) 信号通 路促进人胚肺成纤维细胞增殖【2 0 刁j 。 糖皮质激素和纤维蛋白酶也可以诱导c t g f 的表达。d a m m e i e r 等【2 0 】发现应用地塞 米松干预体外培养的成纤维细胞后，成纤维细胞中c t g f 的表达显著增高，并且c t g f 表大量的增高具有时间和剂量的依赖性，所以糖皮质激素可直接诱导c t g f 的表达。 c h a m b e r s 等【2 1 】发现生理浓度的纤维蛋白酶可使胚胎成纤维细胞c t g fm i 矾a 的表达上 调5 倍，使成人成纤维细胞c t g fm i a 的表达上调7 倍，同时c t g f 蛋白合成也相应 地增加，环己亚胺和t g f p 1 的中和性抗体都不能抑制该现象的发生，表明在正常组织 修复和纤维化的过程中，纤维蛋白酶能够有效的诱导c t g f 表达，进而促进结缔组织的 形成。 n 盯a 、c a m p 以及前列腺素类物质可以抑制c t g f 表达。g r o t e n d o r s t 等【2 2 】发现升 高靶细胞中的c 刖p 水平能选择性地抑制c t g f 基因的表达和胶原的合成。 3c t g f 的生物学功能 3 1 促进细胞增殖 c t g f 通过有丝分裂蛋白激酶及细胞外信号调节激酶调节内皮细胞、软骨细胞及乳 腺癌细胞等多种细胞的增殖【2 3 丑，2 5 1 。c t g f 具有较强的丝裂原活性，能刺激成纤维细胞 的活化、增殖，并诱导成纤维细胞与肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞的转化从而导致组 2 文献综述 织器官纤维化1 2 6 j 。i i 型肺泡上皮细胞及激活的成纤维细胞可以通过自分泌或旁分泌的方 式产生c t g f 蛋白，成纤维细胞表型的转化和细胞外基质的沉积在肺纤维化进展过程中 起重要作用。 c t g f 和t g f d 均可显著增加正常大鼠肾成纤维细胞中i 型胶原、整合素q 5 和纤 维连接蛋白基因的转录，促使肾脏纤维化的发生与进展。c t g f 是t g f p 刺激大鼠肾成 纤维细胞增殖过程中所必须的生长因子，c t g f 的中和性抗体和c t g f 反义寡核苷酸可 分别从蛋白水平与核酸水平特异性的阻断t g f p 对大鼠肾成纤维细胞的诱导作用【2 引。 对系统性硬化症患者的病灶区成纤维细胞进行研究后发现，硬化期成纤维细胞中c t g f m r n a 的表达较炎症期明显增高，过度表达c t g f 可促进成纤维细胞迁徙、增殖以及产 生细胞外基质成分，加速纤维化的进型2 9 1 。胆管上皮细胞合成和分泌t g f b 、c t g 币、 p d g f 及内皮素1 等因子，这些因子作用于不同的肝细胞，可以导致门静脉性肝硬化【3 0 】。 3 2 调节细胞外基质基因的表达 c t g f 能够刺激成纤维细胞增殖、细胞外基质产生、肉芽组织形成和纤维化，在多 种人体组织器官纤维化疾病与创口愈合过程中，都伴有c t g f 表达的增高，提示c t g f 参与细胞外基质的合成。大量研究显示，动物纤维化模型的组织中都有c t g f 的高表达。 c t g f 可以促进多种细胞外基质成分如蛋白多糖、i 、i i 、型胶原以及纤维连接蛋白、 层粘蛋白的产生，可以抑制细胞外基质的降解，包括抑制降解细胞外基质成分的酶类如 胶原酶、基质金属蛋白酶的活性，并且促进这些酶抑制因子的表达，从而导致组织器官 纤维化p 。用c t g f 的中和性抗体或c t g f 反义寡核苷酸来中和c t g f 的活性，可以抑 制某些药物或t g f p 所诱导的e c m 成分的产生。 1 晰g gs m 等1 3 2 】发现重组c t g f 可诱导人成纤维细胞表达纤维连接蛋白，且纤维连 接蛋白m i 矾a 的表达量与c t g f 呈剂量依赖性的关系，用c t g f 抗体中和c t g f 后， 纤维连接蛋白的表达受到抑制。x u 等【3 3 】发现，转染c t g f 反义基因或用c t g f 的中和 性抗体都可以抑制t g f d 1 诱导体外培养的人皮肤成纤维细胞合成e c m ，而转染c t g f 基因或应用外源的c t g f 蛋白都能诱导人皮肤成纤维细胞合成e c m ，这表明c t g f 能 够直接诱导结缔组织细胞增殖和e c m 合成。 3 3 介导细胞粘附，刺激细胞迁移，促进血管形成 c t g f 可以诱导细胞的增殖和迁移，c t g f 的细胞趋化作用可以促进新生血管的形 成，这在创伤愈合过程中使成纤维细胞迁移至创伤处起到重要的作用。c t g f 在整合素 0 r v p 3 的参与下使细胞具有化学趋向性和运动性，可直接促进内皮细胞的迁移，在损伤修 复和纤维化疾病常同时出现e c m 沉积和血管形成，c t g f 在体内外均有促血管形成作 用。 重组c t g f 蛋白可促进血管内皮细胞的粘附、增殖和迁移，并且该作用的大小与 c t g f 有剂量依赖性的关系。s k m o 掣3 4 l 发现，在培养皿中只有处于增殖期和正在迁移 至空白区域的细胞的c t g f 表达才呈阳性，用c t g f 反义寡核苷酸可以阻滞这些细胞的 增殖和迁移。有研究显示当缺乏c t g f 时，纤维连接蛋白和t g f b 诱导小鼠成纤维细胞 东南大学硕士学位论文 粘附、迁移以及基质合成的作用均明显降低，t g f d 诱导i 型胶原和a s m a 产生的功 能也被减弱3 5 ，3 6 1 。f a l l 等【3 7 】在体外实验中发现，如果c t g f 过度表达，血管平滑肌细胞 的生长率和迁移率都显著增加，该作用可被c t g f 的特异性抗体所抑制。 3 4 促进软骨增生和骨骼发育 c t g f 在软骨的发生、骨骼的发育和重塑过程中发挥重要作用。n a k a l l i s h i 掣3 8 j 发现 c t g f 基因在兔的软骨细胞和人的软骨肉瘤细胞中均有高表达，而成骨细胞中无c t g f 表达，原位杂交结果显示c t g f 主要表达于胎鼠的肋软骨细胞和脊柱的肥大软骨细胞 中。x u 等1 3 w 发现骨硬化病大鼠模型骨骼c t g f 的表达明显高于正常大鼠。 4c t g f 的受体与配体 尚未发现c t g f 的特异性受体，c t g f 可以通过与整合素、硫酸肝素结合糖蛋白以 及低密度脂蛋白受体相关蛋白结合【4 0 ，4 1 1 ，从而发挥其生物学作用。 c t g f 可促进一些胞外蛋白与它们的细胞表面受体结合，在这过程中c t g f 可能是 一个衔接分子，4 l j ，其通过与细胞表面的整合素0 【v d 3 结合促进内皮细胞的粘附与血管 生成，与0 【i i p 3 结合促进人血小板的粘附，与旺m p 2 结合促进血单核细胞的粘附【4 2 1 。c t g f 对成纤维细胞的增殖、迁移以及诱导基质分泌的作用可能与c t g f 蛋白的肝素结合域有 关【4 引，研究发现c t g f 诱导软骨细胞增殖和迁移时需要硫肝糖蛋白的存在【矧。所以， c t g f 与细胞膜表面的硫肝糖蛋白结合是c t g f 发挥其生物学功能的主要原因之一。 c t g f 与低密度脂蛋白受体( l r p ) 结合可激活大鼠肝星状细胞( h s c ) 【4 1 1 ，碘化的c t g f 也可以与l r p 结合【4 引，这种相互作用与c t g f 被细胞吞噬及其在胞内被降解有关。 研究显示，研究体外培养的c t g f 基因敲除胎鼠的成纤维细胞时发现，纤维连接蛋 白促进成纤维细胞粘附的作用明显减弱1 45 。体内研究显示，皮下注射c t g f 和t g f d 都可以导致暂时的纤维变性反应，注射c t g f 后可以