（临床医学专业论文）spla2iia对人脐静脉内皮细胞内皮功能影响的研究.pdf

目录 英文缩略词表 中文摘要 a b s t r a c t 实验材料 前言 第一部分s p l a 2 一i i a 诱导体外培养的人脐静脉内皮细胞粘附因子的表达 实验方法 实验结果 讨论 第二部分s p l a 2 一i i a 诱导体外培养的人脐静脉内皮细胞e t l 、e n o s 的表达 实验方法 实验结果 讨论 创新性和展望一7 2 局限性7 2 综述7 3 致谢8 4 2 3 4 7 加 坫均殂匏 盯鼹的田 a n o v a a s b s a c l d m s o d n a e b e d t a e l i s a e n o s e 孓l f c s h r p h s p g m e c i c a m 1 k d m r n a o d p a g e p b s p c r r p m r t p c r s d s s p l a 2 i i a t b s v c a m 1 4 - b p b 英文缩略词表 a n a l y s i so fv a r i a n c e a t h e r o s c l e r o s i s b o v i n es e r u ma l b u m i n c o n 矗d e n c ei n t e r v a i d i m e t h y ls u i f o x i d e d e o x y r i b i n u c i e i ca c i d e t h i d i u mb r o m i d e e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y e n d o t h e i i a in i t r i co x i d es y n t h a e n d o t h e l i n 1 f e t a lc a l f s e r u m 气 h o 体e 翰d i s hp e m x i d a s e h e p a r a ns u i p h a t ep i o t e o g l y c a n h u m a nu m b c a iv 西ne n d o t h e i i a ic e s i n t r a c e n u l a ra d h e s i o nm o i e c h l e - 1 k i l o d a l t o n m e s s e n g e ri t n a o p t i c a ld e n s i 锣 p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s p h o s p h a t e - b u f f e r e ds a i i n e p o l y m e r a c h a i nr e a c t i o n r e 、r o l u t i o n sp e rm i n u t e r e v e r s et r a n s c r i p “o np o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n s o d i u md o d e c y i s u l f i a t e s e c 他t o r yp 舡o s p h o l i p a s ea 2g m u pi 队 t n sb u f f e rs o i u t i o n v h s c u i a rc e na d h e s i o nm o l e c u l a rl 4 b r o m o p h e n n a c y lb r o m i d e 方差分析 动脉粥样硬化 牛血清白蛋白 置信区间 二甲基亚砜 脱氧核糖核苷酸 溴乙锭 乙二胺四乙酸 酶联免疫吸附剂测定 内皮型一氧化氮合酶 内皮素一1 胎牛血清 辣根过氧化物酶 硫酸肝素蛋白多糖 人脐静脉内皮细胞 细胞间粘附分子一l 千道尔顿 信使r n a 光密度 聚丙酰胺凝胶电泳 磷酸盐缓冲液 聚合酶链式反应 辏? 分钟 逆转录一聚合酶链式反应 十二烷基磺酸钠 i i a 类分泌型磷脂酶a 2 t r i s 缓冲液 血管细胞粘附分子一l 4 一二溴苯乙酮 3 中文摘要 研究背景 动脉粥样硬化( a t h e r o s c i e r o s i s ，a s ) 疾病是当今国内外发病率和病死率都较高的 疾病之一。作为一种全身弥漫性的病理状态，a s 是大多数心血管疾病的病理基础。 炎性反应细胞及其释放的产物已被认为是最主要的促动脉粥样硬化因素。i i a 类分 泌型磷脂酶a 2 ( s e c r e t o r yp h o s p h o l i p a s ea 2g r o u pi i a ，s p l a 2 一i i a ) 作为个 新近研究的重要的炎性反应介质，近年来越来越多的证据表明其在a s 的发生和发 展中也有重要作用。目前关于s p l a 2 一i i a 的研究多集中在对巨噬细胞的影响以及与 脂代谢的关系上，对内皮细胞的研究较少，还没有研究说明s p l a 2 一i i a 对内皮功能 的影响。内皮功能紊乱是动脉粥样硬化发生的重要始动环节，明确s p l a 2 一i i a 的致 炎效应是否会影响血管内皮功能，有助于理解s p l a 2 一i i a 致动脉粥样硬化的机制， 并有助于采取针对性的措施预防a s 的发生。 研究目的 1 通过测定与分析多种内皮细胞分泌因子的表达水平，包括一氧化氮( n i t r i c o x i d e ，n o ) 、内皮素一1 ( e n d o t h e l i n ，e t - 1 ) 、一氧化氮合酶( n i t r i co x i d e s y n t h a s e ，e n o s ) ，细胞间粘附分子一1 ( i n t e r c e l l u l a ra d h e s i o nm o l e c u l e l ， i c a m - 1 ) 和血管细胞粘附分子一l ( v a s c u l a rc e l la d h e s i o n m 0 1 e c u l e l ，v c a m 一1 ) ， 探索不同浓度的s p l a 2 一i i a 刺激对血管内皮功能的影响。 2 通过观察4 一b p b ( 4 _ b r o m o p h e n n a c y lb r o m i d e ，s p l a 2 一i i a 水解作用的抑制剂) 对s p l a 2 一i i a 诱导的内皮功能影响的变化，初步探讨s p l a 2 一i i a 的作用机制， 以了解s p l a 2 一i i a 的水解作用是否参与了对内皮细胞的诱导作用。 研究方法： 1 体外分离培养人脐静脉内皮细胞( h u m a nu m b i li c a lv e i ne n d o t h e l i a lc e l l s ， h l n r e c ) 。 2 不同浓度的s p l a 2 一i i a 体外刺激h u v e c 细胞，设置3 个浓度( 0 0 1 、o 1 、 l u g m 1 ) ，以未加任何药物刺激培养的细胞作为空白对照，以1 0 n g m 1t n f - q 刺激培养的细胞作为阳性对照，利用试剂盒检测内皮细胞卜清的一氧化氮浓度， 并利用荧光定量逆转录多聚酶链反应( r e a 卜t i m ep c r ) 方法分析一氧化氮合酶 ( e n o s ) 、内皮素一l ( e n d o t h e l i n ，e t 一1 ) 、细胞问粘附分子一l ( i c a m 1 ) 和血 管粘附分子一l( v c a m 一1 ) 的m r n a 表达水平的变化，还利用w e s t e r nb l o t 法分 4 析i c a 卅l 、v c 肿l 在蛋白水平的表达水平变化。 3 采用体外分离培养h u v e c 的方法，以lu g m ls p l a 2 一ii a 、1 0 n m o l 几4 一b p b 单独 或联合刺激内皮细胞，利用试剂盒检测内皮细胞上清的一氧化氮浓度，并通过 r e a l _ t i m ep c r 检测分析e n o s 、e t l 、i c a m l 、v c a m 一1 转录水平的变化，用 w e s t e r nb 1 0 t 法分析i c a m l 、v c a m 一1 在蛋白水平的表达变化。 4 用s p s s1 7 o 软件进行数据统计分析，组间比较用单因素方差分析( o n e w a y a n o v a ) ，多重比较采用l s d 和s n k 法。p o 0 5 为有统计学意义。 研究结果： 1 0 1u g m l 和1u g m 1 的s p l a 2 一i i a 均能诱导脐静脉内皮细胞i c a m - l 、v c a m - l m r n a 的表达( p o 0 1 ) ，且诱导作用呈浓度依赖性( p o 0 5 ) ：并且s p l a 2 一i i a 可上调内皮细胞i c a m - l 、v c a m 一1 蛋白表达水平，呈浓度依赖性。 4 一b p b 干预组细胞的i c a m 一1 、v c a m 一1m r n a 的表达较lu g m 1s p l a 2 一i i a 单独 刺激组显著降低( i c a m - 1 ：0 6 5 0 1 2v so 3 5 0 0 8 ，p 0 0 l ；v c a m 一1 ：0 8 5 o 1 4v so 6 0 0 2 l ，p o 0 5 ) ，4 一b p b 处理也明显降低1 0 n g m 1t n f _ a 诱导 的i c a m _ 1 、v c a m _ 1m r n a 的表达( i c a m _ l ：o 7 2 o 0 3v s0 4 7 0 0 3 ，p o 0 5 ； v c a m 一1 ：1 2 4 o 0 4v so 8 2 0 0 9 ，p o 0 5 ) ；4 一b p b 处理降低s p l a 2 一i i a 或 t n f - a 诱导的i c a m - l 、v c a m - 1 蛋白的表达。 o o l u g m l 、o 1 u g m l 、1u g m l 的s p l a 2 一i i a 均能诱导脐静脉内皮细胞e t 一1 m r n a 的表达( p o 0 1 ) ，并且诱导作用呈浓度依赖性( p o 0 5 ) ；lu g m 1s p l a 2 一i i a 能明显抑制脐静脉内皮细胞e n o sm r n a 的表达( p o 0 5 ) ；o 1 u g m 1 和lu g m 1 的s p l a 2 一i i a 均能明显抑制内皮细胞n o 的生成( p 0 0 5 ，p o 0 1 ) 。 4 一b p b 处理明显减弱lu g m 1s p l a 2 一i i a 调节的e t - 1 、e n o sm r n a 的表达( e t l ： 1 5 2 o 0 6v s1 1 3 0 0 6 ，p o 0 1 ；e n o s ：一o 3 8 o 0 lv s 一0 1 5 o 0 2 ， p 0 0 5 ) ；4 一b p b 处理也明显减弱1 0 n g m 1t n f a 调节的e t _ 1 、e n o sm r n a 的表 达( e t 一1 ：1 8 9 0 0 0v s1 3 8 o 0 5 ，p o 0 l ；e n o s ：一1 5 2 0 1 2v s 一0 9 6 0 0 4 ，p 0 0 5 ) 。 结论： 1 s p l a 2 一i i a 能剂量依赖性地诱导内皮细胞i c a m l 、v c a m l 、e t _ 1 的表达，抑制 e n o s 的表达，减少n o 的生成。 5 2 s p l a 2 一i i a 的水解作用是其影响内皮细胞i c a m - 1 、v c a m _ l 、e t l 和e n o s 表达 的机制之一。 3 t n f q 诱导内皮细胞表达i c a m l 、v c a m l 、e t 一1 、e n o s 的过程中可能有 s p l a 2 一ii a 的活化和参与。 关键词：s p l a 2 一i i a ，动脉粥样硬化，内皮功能 6 t h ee f f e c t so fs p l a 2 i i ai nh u m a nu m b c a lv e i ne n d o t h e h a lc e s a b s t r a c t b a c k g i o u n d ： c o r o n a 哆h e a r td i s e a s ei sam a j o rc a r d i o v a s c u l a rd i s e a s ei nt h ew o r i dw i t hh i 曲e r m o r b i d i 妙a n dm o r t a l i 吼a t h e m s c l e r o s i si sab a s i cp a t h o i o g i c a lc h a n g ei nc a r d i o v a s c u l a r d i s e a s e 1 n f l a i i l m a t o 巧r e a c t i o n sa n dc ”o k i n e sh a v e b e e nr e c o g n i z e d勰t h em o s t i m p o n a n tf h c t o r st 0 t h ep a t h o g e n e s i so fa t h e r o s c i e r o s i s r e c e n t l y ，m o r ea n dm o r e e v i d e n c e sd e m o n s t r a t et h a ts e c r e t o 巧p h o s p h o i i p a s ea 2g r o u pl i a ( s p l a 2 - i i a ) ，a san e w i n f l a m m a t o 哕c ”o k i n ea p p e a r s t 0b ea n i m p o n a n ti n f l a m m a t o d ， m e d i a t o ro f c a r d i o v a s c u l a rd i s e a s ea n dm a yp l a yap i v o t a lr o l ei nt h ep a t h o p h y s i o l o g yo fa s c u l t e n t l y ；s t u d i e so fs p l a 2 一i l aa r ef o c u s e do nt h ee f 梵c to fm a c r o p h a g e sa n dt h el i p i d m e t a b o l i s m t h e r ei sn or e s e a r c hr e v e a i e dt h e 向n c t i o no fs p l a 2 1 i ao ne n d o t h e l i a lc e l i s a st h ee n d o t h e l i a ld y s f h n c t i o ni st h ei n i t i a lg e n e s i s 南ra t h e r o s c l e r o s i s ，t ou n d e r s t a n d w h e t h e rt h ea f 凳c to fs p l a 2 - l i ao n p r o i n f l 拥m a n t o 口 e f & c t se x e r ti nv a s c u l a r e n d o t h e l i a lc e l l sm a yh e l pt oc o m p r e h e n dt h em e c h a n i s mi n d u c e db yt h es p l a 2 - i i a i n v o l v e di na sa n dm a ya l s 0c o n t r i b u t et 0t h et a i g e t m a n a g e m e n tt 0p r e v e n tt h e d e v e i o p m e n to f a s o b j e c 缸v 鹤： 1 t oi n v e s t i g a t et h ee 仃e c to fd i 毹r e mc o n c e n t r a t i o n so fs p l a 2 - i i ao nh u m 锄 u m b n i c a lv | e i ne n d o t h e l i a lc e l l s ( h u v e c ) ，w em e a s u r et h ee x p r e s s i o no fn i t r i c o x i d e 洲o ) ，e n d o t h e l i n - l ( e t - 1 ) ，n i t r i co x i d es y n t h a s e ( e n o s ) ，i n t e r c e l l u l a ra d h e s i o n m o l e c u l e - l ( 1 c a m 1 ) a n dv a s c u l a rc e l la d h e s i o n m o i e c u i e - 1 ( v c a m - 1 ) a 舭rt h e s t i m u l a t i o no fs p l a 2 i l aa td i 疵r e n tc o n c e n t r a t i o ni nv i t r o 2 i no r d e rt 0 帅d e r s t a n dw h e t h e rt h eh y d r o l y s i se 仃e c to fs p l a 2 - i 认i si n v o l v e di nt h e i n d u c t i o no fe n d o t h e l i a ic e l l s ，w ee x p l o r et h em e c h a n i s mo fs p l a 2 - i l aw h i c hm a y l e a dt ot h ed y s 向n c t i o no fe n d o t h e l i a lc e i l st h r o u g ht h eo b s e r v a t i o no fn o ，e t _ l ， e n o s i c a m 1 锄dv c a m 1i nh u v e ca r e rs t i m u l a t i o no ft h ec u i t u r e dc e l l sw i t h 4 - b r o 啦o p h e n a c y lb r o m i d e ( 4 - b p b ) w h i c hi n h i b i t ss p l a 2 - i i ae m 可m a t i ca c t i v i 妙 m e t h o d s ： 1 e n d o t h e l i a lc e l l sw e r ei s o i a t e d 行o mh u m a i lu m b i l i c a l c o r dv e i na n di n c u b a t ei ne c m c o m p l e t ec u l t u r em e d i u mi nv i t r o 2 e n d o t h e l i a lc e l l sw e r es e r i a l l yp a s s a g e d ( 1 ：2r a t i o ) i n t oc o s t a rt i s s u e c u l t u r ef i a s k s ( 7 5 - c m 2v e s s e i s ) c o a t e dw i t hl g e l a t i n t h e3 r dt o5 山g e n e r a t i o n sw e r eu s e dt 0 7 c a r 科o u tt h es t u d y 3 c o n f l u e n th u v e cc e i l sw e 陀c u l t u r e di i ls e r u m f k em e d i u m 向r6 hb e f o r e 仃e a t m e n t sf o r2 4hw i t ht h r e ed i f 诧r e n tc o n c e n t r a t i o n sg r o u p s ( o o l 、o 1 、lu g 如1 ) o f s p l a 2 一i l aa n dl0 n g m lt n f - 伍，1o n m o l 几4 - b p ba l o n eo rc o m b i n e d e n d o t h e l i a l c e l ln i t r i co x i d ec o n c e n t r a t i o ni nt h es u p e m a t a n tw a sd e t e c t e db yk i t t h em r n a e x p r e s s i o n l e v e l so fe t 1 ，e n o s ，i c a m - l ，v c a m 一1w e r ed e t e 硼i n e db yr e a l t i m e p c r 4 s t i m u l a t e dh u v e cw e r ei y s e da n dp r o t e i nc o n c e n t r a t i o n sw e r em e a s u r e d e q u a i a m o u n t so fc e l ll y s a t ep r o t e i nw e r e 卸a l y z e db yl2 s d s p a g eg e i s t h el c a m - l p r o t e i ne x p r e s s i o nw 弱d e t e c t e db yw b s t e mb i o tm e t h o d 5 a i ls t a t i s t i c a la n a l y s e sw e r ep e r f o 硼e du s i n gt h es p s ss t a t i s t i c sp r o g r a m ，v e r s i o n 17 0 d a _ t aa r ep r e s e n t e da sm e a n s 土s d ap - v a l u eo fp 0 ：0 5w a sc o n s i d e r e da s s i g n i f i c a n t o n e - w a ya n o 、，aw e r eu s e dt 0e v a l u a t ed i 侬：r e n c e sb e t w e e n 2g r o u p s k e s u n s ： 1 s p l a 2 - i i ao fo 1u m l 卸dlu 咖is i g n i f i c a n t l yu p - r e g u l a t e dt h em r n ae x p r e s s i o n o fi c a m - la n dv c a m 一1 i nac o n c e n t r a t i o nd e p e n d e n tw a y ( p o o1 ) t h ee 仃e c to f s p l a 2 - l l a0 np r o t e i nl e v e lo fi c a m - la n dv c a m 1w e r eh 追h l yc o n s i s t e n tw i t h m r n al e v e l 2 4 - b p ba b o l i s h e dt h eo v e re x p r e s s i o no fm r n ao fi c a m 一1 卸dv c a m li n d u c e d b yt h es p l a 2 一l i ai nlu g i i l l ( i c a m - l ：o 6 5 士o 1 2v s0 3 5 士0 0 8 ，p o 0 l ；v c a m l ： o 8 5 士o 1 4v s0 6 0 士0 2 l ，p o 0 5 ) a n dt h e t n f - ai n1 0 n g m l ( i c a m - l ：0 7 2 士o 0 3 v so 4 7 士o 0 3 ，p o 0 5 ；v c a m - 1 ：1 2 4 土o 0 4v so 8 2 士0 0 9 ，p 0 0 5 ) 4 b p br e p r e s s e d t h ep r o t e i nl e v e lo fl c a m 一1a n dv c a m lu p r e g u l a t e db ys p l a 2 l i a0 rt n f - a 3 s p l a 2 - l l ai n c r e a s e dt h em r n ae x p r e s s i o no fe t - li nac o n c e n t r a t i o nd e p e n d e n t w a y ( p 0 0 5 ) ；lu g m lo f s p l a 2 l i ad r a m a t i c a yd e c r e a s e dt h em r n a e x p r e s s i o n o fe n o s ( p 0 0 5 ) ；s p l a 2 一i i ai n c r e a s e dt h el e v e lo f n o i no 1u 卧n j 釉dlu g m lr e s p e c t i v e i y ( p 0 0 5 ，p 0 o1 ) 4 4 一b p ba b o l i s h e dt h eu p _ r e g u la t i e dm r n ao fe t - l 、e _ n o si n d u c e db ys p l a 2 一l l ai n lu 咖l ( e t - l ：1 5 2 士0 0 6v s1 1 3 士0 0 6 ，p o 0 l ；e n o s ：一o 3 8 士o 0 lv s o 1 5 士o 0 2 ， p o 0 5 ) a n dt n f - ai n1 0 n g m l ( e 7 r - l ：1 8 9 士0 0 0v s1 3 8 士o 0 5 ，p o 0 l ；e i n o s ： 一1 5 2 士0 1 2v s - o 9 6 士o 0 4 ，p f _ 驻日垒 ! q q 2 q 垒鱼：3 l 【! l 盈h o m os a p i e n sg l y c e r a l d e h y d e 3 p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e ( g a p d h ) ，m r n al e n 垂h = 1 31o q 星丛星! 旦；2 2 zq q hg l y c e r a l d e h y d e 一3 - p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e 【h o m os a p i e n s 】 ( o v e rl0 0p u b m e dl i n k s ) s c o r e = 3 7 4b i t s ( 4 0 ) ，e x p e c t23 4 l d e n t i t i e s2 2 0 2 0 ( 10 0 ) ，g 印s 2 o 2 0 ( 0 ) s t r 锄d = p l u s p l u s q u e r yl c t c t g c t c c t c c t g t t c g a c2 0 i li i i li i s b j c t 3 0c t c t g c t c c t c c t g t t c g a c4 9 s c o r e = 3 7 4b i t s ( 4 0 ) ， e x p e c t = 3 4 l d e n t i t i e s = 2 0 2 0 ( 10 0 ) ，g a p s = o 2 0 ( 0 ) s t r a n d = p i u s m i n u s q u e r y l15a c g a c c 从a t c c g t t g a c t c13 4 | li i | li i i il i l i s b jc t l4la c g a c c a a a t c c g t t g a c t cl2 2 2 ) 该引物扩增产物与其它基因无交叉同源性存在，可使用。 3 1 4i c a m _ 1 引物设计 1 ) 在n c b l n u c l e o t i d e 数据库搜h o m os a p i e n si n t e r c e l l u l a ra d h e s i o nm o l e c u l el ( i c a m l ) 的m r n a ，l o c u sn m _ 0 0 0 2 0 1 ，序列全长3 2 4 9b p 。找到编码区( c d s 3 2 0 一1 9 1 8 b p ) ，选取3 8 7 - 6 5 0 和6 5 1 9 5 6 两个外显子( e x o n ) 作为目的检测序列( 如 下图突出显示部分) 。 h o m os a p i e n si n t e r c e l l u l a ra d h e s i o nm o l e c u l e1 ( 1 c a m1 ) 的m r n a c d s3 2 0 1 9 1 8 g e n e = ”i c a m l i - ”一 g e n e j 秒n o n y m = ”b b 2 ；c d 5 4 ；p 3 5 8 ” n o t e = ”c e l ls u r f a c eg l y c o p r o t e i np 3 5 8 ；i n t e | c e l l u l a r a d h e s i o nm o i e c u l el ( c d 5 4 ) ，h u m a nr h i n o v i f l j sr e c e p t o r ； l c a m - l ；m a j o rg r o u pr h i n o v i r u sr e c e p t o r ，t c o d o ns j t a r fl b r o d u c 产”i n t e r c e l l u l a ra d h e s i o nm o l e c u l elp r e c u r s o r ” 3 0 1t t g c a a c c t ca g c c t c g c t at g g c t c c c a g c a g c c c c c g gc c c g c g c t g cc c g c a c t c c t 3 6 1g g t c c t g c t cg g g g c t c t g tt c c c a 4 2 1 4 8 l 5 4 l 6 0 1 6 6 1 7 2 l 7 8 1 8 4 l 9 0 l 9 6 l ，搿 g 器鑫爹殇龟l 鬻囊 鬃磊誊爹季麟蠡琵鳓缘蕊磊锈镌玺t 季? 磁磊番锋繇蟛彘雅磋幽鬣翅缒蠢童垂缫 诒，；+ p ? ，4 ，0 二一蠼7 ；f ，啊憧7 虢 7 # p 0 # 龆p j ，o ，一l ? ，? 扣，一二z ，| 彬分? 坼j ，| 搿! ”啦 吩。o j “y 辔# 赣 缴熊囊鳝够彩黪缓够鹈雾鬟燃铹磐嫩够彩够貉够鲧粼够铭够黪嬖蠡燃鳞 籀a 琴i 辫籀辚缮鹾戳磁蘸：锸蘸女餮移簧磁鳜遴巍羁溺 辍鹚酾褫磁凝镢磁籀纛貉杉，巍舔菇蕊；舔黼囊薄酝黼 貔磊麓籀磊磊貔磊藕簇磊磊磊缓蓊蕤蘸簇簇缀磊鳜缓纛惫纛磊篪缀蓖澜t c c t g c c a g c g a c tc c c c c a c a a ct t g t c a g c c cc c g g g t c c t a g a g g t g g a c ac g c a g g g g a c 将上述目的序列输入p r i m e r5 软件，获得引物： f o r w a r d ：5 t g t g c a a g a a g 觚a g c c a a c c a 一3 ： r e v e r s e ：5 t g g c a g c g t a g g g t 从g g t r - 3 ( 下划线处为上下游引物) ，跨外显子设计，扩增片断长度1 5 9 b p 。 2 ) 将卜述引物应用o l i g o6 软件进行评估，验证结果提示：引物t m 值( 卜游 6 0 9 ，下游5 9 9 0 ) ；g c 含量为5 4 7 ；3 端无二级结构形成，无引物二聚体 及发夹样结构形成，错配引发效率 r - 丝璺奠丛q q q 2 q 1 ：2 l 豳h o m os a p i e n si n t e r c e l l u l a ra d h e s i o nm o l e c u l e1 ( i c a m l ) ， m r n a l e n 醇h = 3 2 4 9 q 基奠星! q ；3 3 墨三! 丛! ii n t e r c e l l u l a ra d h e s i o nm o l e c u l e1 【h o m os a p i 明s 】 ( o v e rl0 0p u b m e dl i n k s ) s c o r e = 4 1 0b i t s ( 4 4 ) ， e x p e c t = o 2 6 i d e n t i t i e s22 2 2 2 ( 10 0 ) ，g a p s 2 o 2 2 ( 0 ) s t r a n d = p l u s p l u s q u e r yl t g t g c a a g 从g a t a g c c a a c c a2 2 | i l i i ii s b jc t 5 6 8t g t g c a a g a a g a t a g c c a a c c a5 8 9 s c o r e = 3 7 4b i t s ( 4 0 ) ， e x p e c t = 3 2 i d e n t i t i e s = 2 0 2 0 ( 1 0 0 脚，g a p s = 0 2 0 ( o 呦 s t r a n d = p l u s 厂m i n u s q u e r y 10 7t g g c a g c g t a g g g t a a g g t t12 6 | l | ii li i | l l s b j c t7 2 6 t g g c a g c g t a g g g t a a g g t t 7 0 7 4 ) 该引物扩增产物与其它基因无交叉同源性存在，可使用 3 1 5v c a m 1 引物设计 1 ) 在n c b 价、i u c i e o t i d e 数据库搜h o m os a p i e n sv a s c u l a rc e na d h e s i o nm o i e c u l el ( v c a m l ) ，的m i 王n a ，l o c u sn m _ 0 8 0 6 8 2 ，序列全长2 8 4 3b p 。找到编码区( c d s 1 2 1 2 0 6 4 b p ) ，选取1 8 5 - 4 6 0 和4 6 l 7 8 l 两个外显子( e x o n ) 作为目的检测序列( 如 下图突出显示部分) 。 h o m os 印i e n sv a s c u l a rc e l la d h e s i o nm o i e c u l el ( v c a m1 ) 的m r n a c d s1 2 1 2 0 6 4 g e n e = ”v c a m l ” g e n e s y n o n y m = ”c d l 0 6 ：d k f z p 7 7 9 g 2 3 3 3 ： i n c a m 一1 0 0 ：m g c 9 9 5 6 1 ” n o t e = 一i s o f o r mbp r e c u r s o rise n c o d e db yt r a n s c r i p t v a r i a n t2 ：c d l 0 6a n t i g e n ；v c a m l ：v c a m1 ：v a s c u l a rc e l l a d h e s i o np r o t e i nl ” c o d o ns t a r t = l p r o d u c t = 一v a s c u l a rc e l la d h e s i o np r o t e i n1i s o f o r mbp r e c u r s o r 一 1 8 1 2 4 l 3 0 1 3 6 l 4 2 1 4 8 1 5 4 1 6 0 l 6 6 l 7 2 1 7 8 1 8 4 1 疆丝童毯薹g 邕垂i i 邈连兰i 戮菇琵纯墓髫釜霉i 菇：强鳓籀褥鼍鬈魄i 绷 貉舅器毒彩a 曼7 “c 8 馘t 职c 8 9g e t 嚣獬j 戳雩场e 善鹾籀馥鑫誊稀照嘉萎戋霉壤磁罐 黪够a g g a a 爹，蔫鹈缝毫每g 龋，罐够客馥嗡g 爹鳓g 锣奄艺t 繇，够秘蚴凌墨墨笔g 酾罐锈 歉瑷韬毒t 宅名i 酸镑瑶旋j 始旋旋最螽。7 教泌g t 誊番疆蓉，7 毛簪蘸垂巍参；菇薹专旗罐 凝弱藕矗嬲溺溺囊弱磊磊磊磊鹪锄邈葫毳彝纛磊磁纛熬驻旗翩捌 薹t a t c a c c c aa g a a t a c a g tt a t t t c t g t ga a t c c a t c c ac a a a g c t g c aa g a a g g t g g c t c t g t g a c c at g a c c t g t t c c a g c g a g g g tc t a c c a g c t cc a g a g a t t t tc t g g a g t a a g 将上述目的序列输入p r i m e r5 软件，获得引物： f o n ，a r d ：5 一a a t g a g g g g a c c a c p 汀1 a c g c - 3 ： r e v e r s e ：5 - c c a g a g g g c c a c t c a a a t g a a t 3 ( 下划线处为卜下游引物) ，跨外显子设计，扩增片断长度1 6 6 b p 。 2 ) 将上述引物应用o l i g o6 软件进行评估，验证结果提示：引物t m 值( 上游 6 2 7 ，下游6 2 9 ) ；g c 含晕为4 4 6 ；3 端无二级结构形成，无引物聚体及 发夹样结构形成，错配引发效率 广驻虱趟丛墨q 鱼墨2 ：亘j 【i 豳h o m os a p i e n sv a s c u l a rc e l la d h e s i o nm o l e c u l e1 ( v c a m1 ) ，t f a n s c r i p tv a r i a n t2 ，m r n al e n 醇h = 2 8 4 3 q 基趟垦! q ；z 垒12y 丛! iv a s c u l a rc e l la d h e s i