（中西医结合基础专业论文）独活寄生汤对豚鼠膝骨关节炎早期干预的研究.pdf

yi1甥煳 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立完成 的，文中除注明引用的内容外，不包含任何其他已经发表的科研成果。 对本文研究做出重要贡献者，已在文中以明确方式表明。本声明的法 律责任完全由自己承担。 论文作者签名导师签名 关于学位论文使用授权的声名 本人完全知道中国中医科学院有关保留使用学位论文的规定，同 意学校保留或向国家有关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许 被查阅和借阅。本人授权中国中医科学院可以将本学位论文的全部或 部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复印 手段保存和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名华显益l 日期一 ； ， ； ； 目录 摘要”l 文献综述l 7 文献综述2 1 4 正文”2 0 前言b i i p o 2 0日吾”一”“” 第一部分独活寄生汤对豚鼠骨关节炎早期干预的形态学研究 1 材料与方法2 3 2 结果一”2 6 3 小结“”2 8 第二部分独活寄生汤对豚鼠骨关节炎早期软骨蛋白多糖干预的研究 1 材料与方法2 9 2 结果”3 3 3 以、结”“4 0 讨论”4 2 结论”4 6 参考文献4 7 附图”一“一“”“”4 8 致谢”5 2 个人简历5 3 独活寄生汤对豚鼠膝骨关节炎早期干预的研究 摘 要 1 研究背景 骨关节炎( o s t e o a r t h r i t i s ，o a ) ，是最常见的一种慢性、进展性关节疾病。其 病理特点为关节软骨变性、破坏、软骨下骨硬化，关节边缘和软骨下骨反应性增 生、骨赘形成。该病好发在负重较大的膝关节、髋关节、脊柱及手指关节等部位。 临床上以关节疼痛、肿胀畸形、僵硬、功能障碍为主要表现。o a 发病率随年龄 的增长而增加，特别是当今世界进入老龄化，该病的发生率呈逐年上升趋势。 由于o a 的病因和发病机制是一个非常复杂的过程，到目前为止尚未完全阐 明。因此如何对o a 进行早期诊断和治疗成为医学界的一大难题。现代医学研究 认为关节软骨的损伤是o a 的始动因素和中心环节，也是治疗的关键。而关节软 骨的损伤则是以软骨中的蛋白多糖的降解和流失为首发事件。o a 早期的病理学 特征是软骨细胞周围的基质缺损，这是细胞周围的蛋白水解酶和胶原水解酶作用 的结果。随着病情的进展会出现更多的软骨基质缺损，同时出现软骨纤维化、软 骨面出现裂隙和软骨面的缺损。o a 早期关节软骨中的蛋白多糖在机械应力、各 种酶类的降解及一系列细胞因子等的共同作用下发生改变。蛋白多糖的变化包扩 两个方面，一方面是它在关节软骨中的含量减少，另一方面是它的组成和分布也 发生明显的变化。因此，对o a 的特异性治疗应是针对于关节软骨的病理改变， 修复软骨基质的缺损和恢复软骨细胞的功能。目前治疗o a 的常用药物有非甾体 抗炎药( n s a d s ) 、改善症状的慢作用药( s y s a d o a ) 和关节腔注射剂三大类。 o a 属中医“痹症范畴。中医学认为，机体关节的活动，筋脉的舒通，都 以脾气健运，肝肾盛实，气血充盈，经络畅达为基础。因为肾主骨生髓，肝藏血 柔筋活络，脾主肌肉与四肢。所以肢体关节、筋脉、腰膝之病皆与脾、肝、肾密 切相关。如果肝肾不足，气血虚弱，则会使风寒湿邪乘虚而入，形成风寒湿痹证。 黄帝内经痹论篇日：“风寒湿三气杂至，合而为痹也，。 痹者，闭也， 就是闭阻不通之意。人体肝肾精血不足，筋脉失养，寒湿之邪侵入人体，流注关 节，使气血痹阻。因此，其基本病机为肝肾亏虚、气血不足为本，风寒湿热、痰 瘀互结为标，中药多以补益肝肾、益气养血、祛风散寒除湿、化痰逐瘀通络为主。 独活寄生汤为唐代医家孙思邈创制，载于其著备急千金要方一书中，是 治疗风寒湿痹证的重要方剂之一。本方具有祛风散寒、蠲痹止痛、补益气血、滋 养肝肾、舒通筋络的功效。方中以熟地、牛膝、杜仲、寄生补肝益肾，壮骨强筋。 当归、芍药川芎和营养血，所谓治风先治血，血行风自灭。人参、茯苓、甘草益 气扶脾，又所谓祛邪先补正，正旺则邪自除也。独活、细辛入肾经，能搜伏风， 使之外出，桂心能入肝肾血分而祛寒，秦、防风为风药卒徒，周行肌表，且又风3 、 i 能胜湿。现代研究表明该方具有明显的抗炎、镇痛、消肿作用，并且具有调节机 体免疫平衡，抑制非特异性炎症的作用。本实验采用不同的方法对其早期干预的 效果进行检测，从不同角度验证中药在预防和治疗o a 方面的作用。i 2 研究目的、 本实验通过采用豚鼠自发性o a 的模型，动态观察不同时间点各组豚鼠早期 o a 胫骨平台软骨的形态学变化及血中蛋白多糖含量的变化，探讨独活寄生汤对 豚鼠早期o a 的干预作用。 3 研究方法、 选用雌性1 月龄h a r t l e y 豚鼠1 0 4 只，随机分为正常组、模型组、中药组( 独 活寄生汤) 、西药组( 盐酸氨基葡萄糖) 4 组。其中正常组8 只，其余3 组每组 3 2 只，分1 5 月、2 月、2 5 月、3 月4 个时间亚组，每组8 只。各组动物分别于 达到分组月龄后处死取胫骨平台软骨进行h e 及阿利辛蓝染色，观察软骨的形态 学变化、检测各组标本血清中蛋白多糖含量的变化、并采用显微红外检测软骨中 蛋白多糖的结构及含量的变化。 4 结果 h e 染色结果显示模型组2 月龄时开始出现软骨的轻度损伤，阿利辛蓝染色结 果显示2 月龄时软骨中蛋白多糖的含量开始下降，到3 月龄时豚鼠的胫骨关节面 软骨均有不同程度的破坏、软骨中的蛋白多糖含量下降。中药组和西药组软骨破 坏程度较轻，尤以中药组改变轻微。血清蛋白多糖e l i s a 检测结果显示模型组血 清蛋白多糖含量自1 5 月开始下降，而且随年龄的增长而逐渐降低，且不同月龄组 间差异显著。中药组和西药组血清蛋白多糖下降程较模型组轻，尤以中药组血清 蛋白多糖含量下降程度最轻。显微红外检测结果显示，模型组自1 5 月龄时豚鼠 2 的胫骨关节面软骨蛋白多糖结构和含量就已有改变，到3 月时与其它两治疗组比 较改变明显，但中药组和西药组较模型组改变轻微，尤以中药组改变最轻。 5 结论 o a 早期关节软骨的破坏过程中，蛋白多糖的降解是重要的原因，经不同方 法检测显示中药独活寄生汤可以抑制关节软骨中蛋白多糖的降解从而防止或延 缓了关节软骨的退变。血清e l i s a 检测与显微红外检测方法为o a 的早期检测提 供了新的思路和方法学参考。 3 t h er e s e a r c ho fd e t e c t i o nf o re a r l yi n t e r v e n t i o nt oa n g e l i c a e p u b e s c e n t i sa n dl o r a n t h id e c o c t i o no no s t e o a r t h r i t i so fg u i n e a p l g 1 r e s e a r c hb a c k g r o u n d a b s t r a c t o s t e o a r t h r i t i si sac h r o n i c p r o g r e s s i v i t y d i s e a s e t h e m a j o r p a t h o l o g i c m a n i f e s t a t i o n si sa r t h r o d i a l c a r t i l a g ed e g e n e r a t i o n ， d e s t r u c t i o n ， c a r t il a g e s e n d i n g d o w nf i s h b o n e s c l e r o s i s ， r e a c t i v e h y p e r p l a s i ao fa r t i c u l a t i o nc o n f i n ea n dc a r t i l a g es e n d i n gd o w nf i s h b o n e ， o s t e o p h y m af o r m a t i o n t h ei n c i d e n c eo fo ai n c r e a s ef o l l o wa e t a t i sg r e w a n di ti sr i s i n gy e a rb yy e a re s p e c i a l l yw o r l da g i n g w eh a v en o tc o m p l e t e l yi l l u m i n a t eo ab e c a u s eo ft h ec o m p l i cp r o c e d u r e o fe t i o p a t h o g e n i s i sa n dn o s o g e n e s i s s o ，h o wt oc a r r yo u te a r l yd i a g n o s i s a n dt r e a t m e nb e c o m ep u z z l et om e d i c i n e m o d e r nm e d i c i n ep r e s u m et h e d a m n i f i c a t i o no fc a r t i l a g oa r t i c u l a r i si si n i t i a t i n ga g e n ta n dc e n t e r e l e m e n to fo a ，a l s oak e yp o i n t t h ei m p o r t a n to c c u r r e n c et od a m n i f i c a t i o n o fc a r t i l a g oa r t i c u l a r i si sp r o t e o g l y c a nd e g r a d a t i o na n dr u no f fi n c a r t i l a g e n o wn o n s t e r o i d a la n t i i n f l a m m a t o r yd r u g ( n s a i d ) 、s y s a d o aa n d a r t i c u l a rc a v i t yi n j e c t i o ni s c o m m o n l yu s e dd r u gf o ro a i nt r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n e ，o rb e l o n gt oa r t h r o m y o d y n i a t h e c l i n i cc h a r a c t e r i s t i ci n c l u d e l i v e ra n dk i d n e yl o s e 、i n s u f f i c i e n c yo f v it a le n e r g ya n db l o o d ，a n dc o l da n dd a m p n e s s t h ep r i m a r yt r e a t m e n ti n c h i n e s ec r u d ed r u ga r et o n i f i c a t i o nl i v e ra n dk i d n e y 、e x p e i i i n gw i n da n d r e m o v i n gc o l da n dd i s s i p a t ep h l e g m a n g e i i c a ep u b e s c e n t i sa n dl o r a n t h id e c o c t i o nc a nr e i n f o r c e l i v e ra n d k i n d e y ，s t r o n gb o n e sa n dm u s c l e s ，p r o m o t i n gb l o o df l o w ，a c t i v a t i n g m e r i d i a n st o s t o pp a i n m o d e n r e s e a r c hi n d i c a t e dt h i sp r e s c r e p t i o n o b v i o u s l yp o s s e s sa n t i i n f l a m m a t o r y 、r e l i e v ep a i n 、d e t u m e s c e n c e ，f u r t h e r ， 4 c a na c c o m m o d a t eb a l a n c ei m m u n o l o g i co fo r g a n i s m ，i n h i b i tn o n s p e c i f i c i t y i n f l a m m a t o r y w ed e t e c t e f f e c t o fe a r l yi n t e r v e n t i o nw i t hd i f f e r e n t m e t h o d si nt h ise x p e r i m e n t v a lid a t et h ee f f e c to fc h i n e s ec r u d ed r u gi n p r e c a u t i o na n dt r e a t m e n tt oo af r o md i f f e r e n tp o i n t 2 r e s e a r c ho b j e c t i v e w ek i n e s i so b s e r v et h ev a r i a t i o no fm o r p h o l o g yt ot i b i a lp l a t e a ui n g u i n e ap i gt h r o u g h a d o p tg u i n e ap i gs p o n t a n e o u so s t e a r t h r i t i sm o d e l d e t e c tt h ec h a n g eo fp r o t e 0 9 1 y c a nt ob l o o d ，i n v e s t i g a t et h ea n t a g o n is t i c e f f e c t o fp r o t e o g l y c a nd e g r a d a t i o na b o u ta n g e l i c a ep u b e s c e n t i sa n d l o r a n t h id e c o c t i o nt og u i n e ap i g 3 r e s e a r c hm e t h o d 1 0 4f e m a l eh a r t l e yg u i n e ap i g sa r eu s e d ，r a n d o md i v i d ec o n t r o l 、m o d e l 、 t r e a t m e n t ( a n g e l i c a ep u b e s c e n t i sa n d l o r a n t h id e c o c t i o n ) 、p o s i t i v e c o n t r o l ( a m i n o g l u c o s e ) b ym o n t ha g e t h e r ea r e8m o u s e sa b o u tc o n t r o l ，3 2 m o u s e sp e rg r o u n da b o u to t h e r3g r o u n d sw h ic hd iv id e d4g r o u n d sa s1 5 m o n t h 、2m o n t h 、2 5m o n t h 、3m o n t h 。8p e rg r o u n d o b t a i nt i b i a lp l a t e a u c a r t i l a g ec a r r yo u th ea n da l c i a nb l u e ，o b s e r v et h ev a r i a t i o no fm o r p h o l o g y t oc a r t i l a g ea n dc o n t e n tt op r o t e o g l y c a n d e t e c tt h ec h a n g eo fc o n t e n t a n dd i s t r i b u t i o nt op r o t e o g l y c a ni nc a r t i l a g ew i t hf t i r 4 r e s u l t h ea n da l c i a n b l u ei n d i c a t et h ec a n n am a j o ra r t i c u l a r i so s s i u m c a r t i l a g ed i s t i n c tl e v e ld e s t r u c t i o ni nm o d e l3m o n t h ，t h ep r o t e o g l y c a n c o n t e n ta l s od e c r e a s e ，w h il et r e a t m e n ta n dp o s i t i v ec o n t r o ld e c r e a s e s l i g h t ，e s p e c i a l l yt h et r e a t m e n tc h a n g el i t t l e e l i s ai l l u s t r a t es e r u m p r o t e o g l y c a nc o n t e n td e c r e a s ef o l l o wt h ei n c r e a s eo fa g ei nm o d e l ，a n d t h e r ei s s i g n i f i c a n td i s c r e p a n c ya m o n gd i f f e r e n tg r o u n d ，t h et r e a t m e n t a n dp o s i t i v ec o n t r o lh a v el i t t l ed e c r e a s e ，f u r t h e r m o r e ，t h et r e a t m e n th a s m o s tp r o t e o g l y c a nc o n t e n t f t i rr e s u l tm a n i f e s t ，t h ep r o t e o g l y c a n c o n t e n td e c r e a s ei nc a n n am a j o ra r t i c u l a r i so s s i u mc a r t i l a g eo fm o d e l3 5 m o n t h ，b u tt r e a t m e n ta n dp o s i t i v ec o n t r o lc h a n g el i t t l e ，e s p e c i a l l yt h e t r e a t m e n t 5 c o n c l u s i o n t h ed e g r a d a t i o no fp r o t e o g l y c a ni sv e r ys i g n i f i c a n tt om o r n i n g d e s t r u c ti o np r o c e d u r eo fa r t h r o d i a lc a r til a g ei no a ， c o n s p i c u o u sa n t a g o n i s t i ce f f e c ta b o u tt h ed e g r a d a t i o no fp r o t e o g l y c a n i na r t i c u l a rc a r t i l a g ew i t ha n g e l i c a ep u b e s c e n t i sa n dl o r a n t h id e c o c t i o n i sc o n f i r m e db yd i f f e r e n td e t e c tm e t h o d s 6 综述1 骨关节炎早期细胞外基质的变化及标志物检测的研究进展 摘要 骨关节炎已经成为中老年人的常见病和多发病，其早期阶段软骨细 胞外基质的变化及其标志物的检测己成为近年来研究的热点，这对骨关节炎的早 期诊断、治疗和预后都将产生积极的影响。 关键词 骨关节炎；细胞外基质；标志物 r e s e a r c hp r o g r e s s i o no ft r a n s m u t a t i o no fe x t r a c e l l u l a rm a t r i xa n dm a r k e r d e t e c t i o ni np r i m a r yo s t e o a r t h r i t i s l i u ji a n li n g ，k o n g h u a n y u l a b o r a t o r yo fp h a r m a c o l o g yo ft c m ( o r t h o p a e d i c sa n dt r a u m a t o l o g y ) w a n g j i n gh o s p i t a lo fc h i n aa c a d e m yo f c h i n e s em e d i c a ls c i e n c e s1 0 0 7 0 0 ，b e i j i n g ，c h i n a a b s t r a c to s t e o a r t h r i tisisac o m m o na n df r e q u e n t l y - o c c u r r i n gd is e a s ea m o n g t h eo l dp e o p l ew h i c hr e s e a r c h e so ft r a n s m u t a t i o no fe x t r a c e l l u l a rm a t r i x a n dm a r k e rd e t e c t i o ni np r i m a r ys t a g eh a v eb e e nah o ts p o t i tw i l lb r i n g a b o u t f a r r e a c h i n g i n f l u e n c eo ne a r l y d i a g n o s i s 、t h e r a p e u t i c s a n d p r o g n o s i s k e yw o r d s0 s t e o a r t h r i t i s ； e x t r a c e l l u l a rm a t r i x ； m a r k e r 骨关节炎( o s t e o a r t h r i t i s o a ) ，又称骨关节病，退行性关节病，老年性 关节炎。是最常见的一种慢性、进展性关节疾病。其病理特点为关节软骨变性、 破坏、软骨下骨硬化、关节边缘和软骨下骨反应性增生，骨赘形成“。随着社 会老龄化的发展，该病的发病率呈逐年上升趋势。因此，对o a 早期阶段软骨及 其细胞外基质的变化进行深入研究和探讨对于该病的早期诊断及治疗具有重要 意义。 1 正常关节软骨的组成和生化 正常关节软骨呈浅蓝白色，半透明，光滑而有光泽，具有耐磨、传导关节负 7 荷、吸收震荡和润滑关节等功能。其基本组成成分是细胞外基质( 9 9 ) 和软骨 细胞( 1 ) 。软骨细胞具有合成分泌细胞外基质的功能。细胞外基质是由蛋白多 糖和胶原，组织液等组成，软骨细胞能感受到细胞外基质成分的改变并做出反应， 以维持分解与合成代谢的平衡，保持关节软骨正常的生理功能记。 1 1 蛋白多糖( p g ) 是一类非常复杂的大分子糖复合物，是软骨基质的主要成 分之一，占基质干重的2 5 一3 5 ，带有大量负电荷，吸附大量水分，使软骨具有 弹性、抗压性。p g 单体由核心蛋白和糖胺聚糖链( g a g ) 组成，g a g 包括透明质 酸( h a ) 、硫酸软骨素( c s ) 和硫酸角质素( k s ) 等。关节软骨中主要含有两类 p g ，一类是大的p g 聚集体，也称聚合素；另一类是小的p g 3 。软骨基质中9 0 以上的p g 是以聚合素的形式存在，聚合素是在连接蛋白的辅助作用下使p g 与透 明质酸发生非共价连接，一个透明质酸分子可与数十至数百条p g 连接，形成关 节软骨特有的巨分子一聚合素。聚合素填充于胶原网中，有助于将p g 锚固在基 质中，阻止其在组织变形时移位，也有助于构成和稳定p g 与胶原网间的相互作 用，更可保护p g 免遭蛋白裂解酶的破坏。如果p g 不能形成聚合素则很难保留在 基质中，一旦裂解就会迅速从组织中丢失“。 1 2 胶原纤维是软骨基质中的另一主要成分，占成人关节软骨干重的2 3 ，现 已知成人关节软骨中含有型、型、型、x 型、型胶原。每型胶原均有相 似的分子结构，即由3 条( g l y x - y ) n 氨基酸重复序列组成的q 链构成螺旋结构， 其中x 常为脯氨酸，y 常为羟脯氨酸。由i i 型、型和型胶原组成的异聚体构 成软骨纤维网架结构。i i 型胶原占胶原总数的8 0 - - - 9 0 ，由3 条相同的al ( i i ) 链以螺旋方式构成软骨基本结构。它均匀分布于整个软骨，具有周期性横纹。 胶原在软骨内的分布也有一定规律：在软骨的表层，胶原纤维细小、密集，第一 层由平行排列的细小胶原纤维覆盖在关节表面，给组织提供机械保护，第二层胶 原纤维与关节表面垂直。中间层胶原纤维是无序排列的，受压时沿着张力线方向 改排成最适于对抗裂缝延伸的方式。深层胶原纤维粗大、稀疏，方向与关节表面 垂直。钙化层胶原纤维直径最大，以关节表面垂直方向锁定于钙化层基质中2 。 主要胶原成分( i i 型、型、型胶原) 在不同层面中所占比例基本相同。 2 骨关节炎软骨及其细胞外基质的病理和生化改变 2 1 病理变化o a 最早的病理变化发生于关节软骨，表现为表层软骨出现纤维 化，并伴有与关节面平行的软骨表层劈裂。随着病变的发展劈裂逐渐向软骨深层 发展，直至最后侵及软骨下骨。早期还可观察到软骨表层变薄，粗糙不平，以后 关节软骨逐渐失去其原来的蓝白色和光滑的色泽而变成暗黄色和颗粒状。晚期， 磨损最大的关节面上的软骨被擦去，使软骨下骨显露，由于不断摩擦，骨面呈象 牙样骨。磨损较小的外围软骨面出现增殖和肥厚，通过软骨内化骨，形成骨刺伯。 2 2 生化改变o a 时关节软骨中的p g 在机械应力、各种酶类的降解及一系列 细胞因子等的共同作用下发生改变。p g 的变化包扩两个方面，一方面是它在关 节软骨中的含量减少，另一方面是它的组成和分布也发生明显的变化。首先p g 聚合程度明显降低，聚集体的比例亦减少，其完整性遭到破坏，可裂解为不同大 小的片断。p g 的解聚，最初的裂解是在核心蛋白连接区和主要的c s 、k s 连接区， 这是限制p g 在细胞外基质中生存的关键一步，因为它分隔了p g 的可聚部分和提 供主要生理功能的g a g 连接区失去大分子的屏障和保护作用，单体在诸多酶的 作用下，破坏和丢失将明显加速。g a g 链的变化为硫酸角质素含量减少，硫酸软 骨素含量相对增多，并且结构也发生变化，硫酸化程度下降，透明质酸进行性耗 竭，聚集体形成能力下降。o a 时关节各部位的p g 变化也不一致，最早、最典型 的变化在负重区( 如胫骨内侧平台) ，在同一部位则最早变化于软骨表层，正常 时软骨表层有较多平行排列的胶原，p g 减少和水合增加改变了基质的离子组成 使胶原松散，并且p g 与胶原的交联也减少。胶原结构的破坏使位于其间的p g 暴 露，易于裂解并引起免疫反应“。 o a 时关节软骨中的胶原也会发生许多方面的变化。一方面是胶原分子结构 的改变，研究发现，软骨内胶原可发生点突变、基因缺失突变，从而产生异常的 一级结构。胶原分子是胶原网架结构的基本单位，其改变必然会影响胶原网架结 构的稳定，改变软骨的力学特性，导致关节病变。另一方面，胶原的表达也发生 改变。o a 时软骨内总胶原的分泌增加，而胶原m r n a 表达却不均一，如一些细胞 高度地表达i i 型胶原，而另一些细胞则不表达，两者表达的失平衡可能是0 a 的 一个发病原因。其次，o a 时软骨内胶原的表型也发生改变，基质中出现了i i a 型、 型胶原等异常胶原。o a 关节软骨内正常胶原量的增加，或者表达增加，可能 是对破坏的修复反应，而异常胶原的出现，可能是软骨细胞受o a 病理刺激后失 分化的表现。最后，是胶原纤维的破坏，它是o a 的一个重要表现，在o a 的早期 就有胶原的破坏，o a 时，胶原纤维发生紊乱和丧失，其程度与o a 的病变程度相 9 致，并且发现在o a 时软骨的损害从表层开始。胶原网架结构的破坏是o a 病变 发展中不可逆转的阶段“。在胶原破坏的机制方面，基质金属蛋白酶( m m p s ) 起 着主要作用，o a 早期主要发生依赖m m p s 的胶原纤维破坏，后期才出现胶原纤维 不依赖m m p s 的退行性变门。 3 骨关节炎生化标志物检测 3 1 p g 降解产物的检测o a 时关节软骨中的p g 在机械应力、各种酶类的降 解及一系列细胞因子等的共同作用下发生改变。p g 的变化包扩两个方面，一方 面是它在关节软骨中的含量减少，另一方面是它的组成和分布也发生明显的变 化，因此检测关节滑液中p g 的降解产物及其变化就成为很有希望的o a 早期诊断 的方法。到目前为止，已有多种检测p g 降解产物的单克隆抗体研制成功，例如 抗a s n 3 4 1 一p h e 3 4 2 裂解产生的c 末端序列为f v d i p e n 的g l 片断的b c 一4 抗体、抗 n 末端序列为f f g v g 的g 2 片断a f - 2 8 抗体以及抗g 1 u 3 7 3 一a l a 3 7 4 裂解产生的n 端序列为a r g s v i 的g 2 片断的b c - 3 抗体，使用5 - d - 4 单克隆抗体定量a g k s ，这 些抗体的研制成功不仅对于软骨蛋白多糖降解机制的研究有重要意义，而且o a 的早期诊断方面也有很大的潜在应用价值。一。 3 2 胶原合成与降解的标志物反映胶原合成的标志物有c p i i ( 羧基端i i 型 原胶原前肽) ，c p i i 来源于i i 型前胶原分子，可以在血清和其它体液中检测到( i d 。 在正常关节软骨中c p i i 可以被免疫化学染色，在o a 关节软骨中，特别是在胶原 降解的细胞周围区域染色明显增加( 1 2 ) o关节液中的c pi i 浓度在早、中期升高， 晚期下降。检测o a 关节液c pi i 水平可反映软骨细胞在o a 时合成胶原的能力， 间接反映o a 进展及治疗后的效果。pi ia n p 也用于反映机体软骨胶原的合成状况， 有研究表明“3 o a 患者血清pi ia n p 浓度比正常人降低，提示i i 型胶原合成缺乏， 因而导致软骨修复的障碍，使得0 a 迅速发展。反映胶原分解的标志物为c t x - ( i i 型胶原羧基末端交链) c t x i i 是i i 型胶原被胶原酶降解得到的，而且只有i i 型胶原降解才能得到，因而具有特异性。c t x - i i 可同时在血、尿和滑液中检测到， 具有较长时间的稳定性( 2 4 h ) 及良好的可靠性“”，能反映出0 a 关节软骨破坏 的程度及速度，对o a 的病情评估具有重要意义。c 0 1 2 - 3 4 c ( i i 型胶原羧基末端 3 4 片断) ，是m m p s 裂解的i i 型胶原3 4 长度片断的羧基端。它可反映早期0 a 关节软骨的代谢改变，同时也揭示m m p s 在关节软骨降解中所起的重要作用。 3 3 其它标志物的检测还有一些非直接标志物，如关节液或血液中的透明质 1 0 酸、软骨寡聚基质蛋白( c o m p ) 、基质金属蛋白酶( 删p s ) 及其抑制物等也可以 反映o a 的病情变化，尤其是m m p s 对胶原和p g 的降解起着重要的作用。其中m m p 一3 对蛋白聚糖有高度的裂解活性，并可降解型胶原、纤维结合素、x 型胶原、弹 性蛋白等。还可去除i 、i i 、i 型胶原的n 、c 末端肽，起原胶原肽酶的作用( 1 f i ) 。 i i 型胶原上有m m p 一1 的列解位点，删p l 与之结合，使之降解为片段，丧失原有功能 “6 1 7 ，删p 一1 除能够降解i i 型胶原外，还能够降解型胶原，对p g 也有降解作用。 有研究表明，在中度退变的关节软骨中心p 一1 和m m p - 3 表达明显增高，而在重度退 变的软骨中表达降低，这可能与软骨细胞的死亡和减少有关。 4 结语 综上所述，o a 时最早发生改变的是关节软骨，而关节软骨的改变则以软骨 细胞外基质的变化为主。目前，o a 的诊断主要依靠临床表现( 疼痛、关节活动 受限等) 和影像学分析( 软骨缺损、骨赘和硬化、关节腔狭窄等) 。这些诊断手 段对于o a 早期的病变均缺乏敏感性，往往是病变已经发展到不可逆转的晚期， 软骨已大部分破坏时才能诊断，而此时已经失去了早期预防和治疗的黄金时机。 随着对o a 研究的不断深入和生化检测技术的不断发展，针对o a 生化标志物的研 究将更加深入，这对o a 的早期诊断、治疗和预后以及新药的研发将产生深远的 影响。 参考文献 1 陈百成，张静骨关节炎 m 北京：人民卫生出版社，2 0 0 4 2h u b e rm ，t r a t t n i gs ，l i n t n e rf a n a t o m y ，b i o c h e m i s t r y ，a n dp h y s i o l o g y o fa r t i c u l a rc a r t i l a g e i n v e s tr a d i o l ，2 0 0 0 ，3 5 ( 1 0 ) ：5 7 3 5 8 0 3 r o u g h l e ym j ，l e ee r m ic r o s cr e st e c h ，c a r til a g ep r o t e o g l y c a n s ： s t r u c t u r ea n dp o t e n t i a lf u n c t i o n s m i c r o s cr e st e c h ，1 9 9 4 ，2 8 ( 5 ) ：3 8 5 - 3 9 7 4 卫晓恩，杨庆铭骨关节炎软骨基质蛋白聚糖研究进展国外医学：创伤与外 科基本问题分册1 9 9 9 ，2 0 ( 4 ) ：1 9 3 1 9 5 5e y r ed r ，wuj j c o l l a g e ns t r u c t u r ea n dc a r t i l a g em a t r i xi n t e g r i t y 3 r h e u m a t o ls u p p l 1 9 9 5 ，4 3 ：8 2 ，- - - 8 5 6 刘淑芳，李莹辉，徐团才骨性关节炎的生化及病理变化中国临床康复，2 0 0 4 ， 8 ( 5 ) ：9 3 8 - 9 3 9 8s t o o pr ，b u m ap ，p e t e rm ，e ta 1 d i f f e r e n 7 陈崇伟，卫小春关节软骨胶原变 化与骨关节炎的关系中华风湿病学杂志，2 0 0 3 ，7 ( 1 ) ：4 3 4 5 c e si nt y p ei ic o ll a g e nd e g r a d a ti o nb e t w e e np e r i p h e r a la n d c e n t r a l c a r t i l a g eo fr a ts t i f l ej o i n t sa f t e r c r a n i a l c r u c i a t el i g a m e n t t r a n s e c t i o n a r t h r i t i sr h e u m ，2 0 0 0 ，4 3 ：2 1 2 1 2 1 3 1 9c a t e r s o nb ，h u g h e sc e a n a b o li ca n dc a t a b o li cm a r k e r so fp r o t e o g l y c a n m e t a b o l i s mi no s t e o a r t h r i t i s a c t ao r t h o ps c a n ds u p p l ，1 9 9 5 ，2 6 6 ：1 2 1 1 2 4 1 0f o s a n ga j ，l a s tk ，g a r d i n e rp ，d e v e l o p m e n to fac l e a v a g e s i t e s p e c i f i c m o n o c l o n a la n t i b o d yf o rd e t e c t i n gm e t a l l o p r o t e i n a s e d e r i v e da g g r e c a n f r a g m e n t s ：d e t e c t i o no ff r a g m e n t si nh u m a ns y n o v i a lf l u i d s b i o c h e m ， 1 9 9 5 ，3 1 0 ( 1 ) ：3 3 7 - 3 4 3 1 1f r a n ka ，w o l l h e i mm d s e r u mo fm a r k e r so fa r t i c u l a rc a r t i l a g ed a m a g ea n d r e p a i r r h e u m a t i cd i s e a s e sc l i n i c s n o r t ha m e r i c a ，1 9 9 9 ，2 5 ( 2 ) ：4 1 7 4 3 2 1 2p o o l ea r ，n e l s o nf ，h o l l a n d e ra ，e ta l ，c o l l a g e ni it u r n o v e ri nj o i n t d i s e a s e s a c t ao r t h o ps c a n ds u p p l ，1 9 9 5 ，2 6 6 ：8 8 9 1 1 3g a r n e r op ，a y r a lx ，r o u s s e a uj c ，e ta 1 u n c o u p li n go ft y p ei i c o ll a g e n s y n t h e s i sa n dd e g r a d a t i o np r e d i c t sp r o g r e s s i o no fj o i n td a m a g ei n p a t i e n t s w i t h k n e eo s t e o a r t h r i t i s a r t h r i t i s r h e u m ，2 0 0 2 ， 4 6 ( 1 0 ) ：2 6 1 3 - 2 6 2 4 1 4 c h r i s t g a us ，g a r n e r op ，f l e d e l i u sc ，e t a 1 c o l l a g e nt y p e i i c t e l o p e p t i d ef r a g m e n t sa s a ni n d e x o