（临床检验诊断学专业论文）pcrsbt法研究浙江汉族人群hla基因多态性.pdf

浙江大学硕士学位论文 b p m q t p h l a m w g l a - t a q m h c p c r r - t a q s b t s n p 缩略词 b a s ep a i r碱基对 d e o x y r i b o n u c l e o t i d et r i p h o s p h a s e 三磷酸脱氧核糖核苷 人类白细胞抗原 i n t e r n a t i o n a lh i s t o c o m p a t i b i l i t y国际主要组织相容性小组 w o r k i n gg r o u p l a r g ea n da c c u r a t et a qd n ap o l y m e r a s e l a - t a qd n a 聚合酶 m a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e x 主要组织相容性复合物 p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n聚合酶链式反应 r o u t i n et a qd n a p o l y m e r a s e r - t a qd n a 聚合酶 s e q u e n c eb a s e dt y p i n g 测序分型技术 s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m 单核苷酸多态性 浙江大学硕士学位论文 p c r - s b t 法研究浙江汉族人群h l a 基因多态性 浙江大学医学院临床检验诊断学 硕士研究生戴卫健 导 师严力行教授 摘要 研究背景 人类主要组织相容性复合物( m i - i c ) 又称为h l a ，是迄今为止发现的最复 杂的显性多态性遗传系统，它在组织器官移植配型、疾病的关联和人类遗传学等 方面意义重大。h l a 在不同地域和种族人群的分布存在高度多态性，早期国内 使用血清学方法进行研究，获得了低分辨的数据。随着分子诊断技术的发展，近 几年来国外开始报道人群高分辨的遗传数据，但是目前有关中国人群各基因座位 高分辨数据甚少。本研究论文的目的主要在于建立h l a 高分辨的测序分型方法， 探讨浙江汉族人群h l a 基因座位的遗传多态性。 实验方法 l 、d n a 提取：标本来自本中心的随机献血人群，d n a 抽提采用i n v i t r o g e nd n a 抽提试剂盒。 2 、p c r 扩增：引物参照h l a - a 、b 、c 、d r b l 、d p a l 、d p b i 基因序列， 扩增反应体系总体积为2 5 “l 。 3 、p c r 产物纯化：每孑l 中加入外切酶i1 l l l ( 2 u ) ，碱性磷酸酶2 i i l ( 1 0 u ) ， a b i 公司的9 7 0 0 型p c r 自动扩增仪上酶切，3 7 3 0 m i n ，8 0 1 5 m i n 。 4 、测序反应：h l a - i 类基因采用基因组全长扩增，然后分别针对外显子2 、3 、 4 设计测序引物进行双向测序。h l a i i 类基因采用扩增和双向测定外显子2 序列，其中d r b l 采用单链特异性引物扩增的方法。以纯化p c r 产物为模板 按b i g d y es e q u e n c i n gk i t ( a b i 公司) 试剂盒操作进行测序反应，a b i 公司的 9 7 0 0 型p c r 自动扩增仪扩增，扩增条件为9 5 c 预变性5 m i n ，9 5 c3 0 s ，4 7 2 浙江大学硕士学位论文 4 5 s ，6 0 4 m i n ，3 5 个循环，冷却至4 c 。 5 、测序产物纯化和上胶操作：采用乙醇醋酸钠( 终浓度分别为6 6 和o 0 8 3 m o l ，l ) 法纯化测序p c r 产物。 6 、结果分析和判断：a s s i g n3 5 分析软件和m t n a v i g a t o r 软件进行数据分析， 由a s s i g n3 5 软件指定最终结果。 7 、统计学分析：基因频率( g o n ef r c q u c n c y , g f ) 采用直接计数法计算，单倍型频 率( h a p l o t y p ef r e q u e n c y , h f ) 、h a r d y - w e i n b e r g 平衡检验及x2 检验均采用 a r l e q u i n2 0 软件分析 结果 1 、在浙江汉族人群中发现的h l a - a ，- b ，- c w ，d r b i ，d p a l ，d p b i 的等 位基因数分别为2 2 、4 2 、2 4 、2 5 、8 和1 9 个。该人群中最常见的各个位点的 等位基因为a * 1 1 0 1 0 1 ( 2 5 5 ) 、a * 0 2 0 1 0 1 ( 1 3 5 ) 、a + 2 4 0 2 0 1 ( 1 3 o ) 、b 4 0 0 1 0 1 ( 1 2 5 坳、b + 4 6 0 1 0 1 ( 1 0 o 呦、b + 5 8 0 1 ( 8 5 呦、c 0 7 0 2 0 1 ( 1 6 5 ) 、c + 0 1 0 2 0 1 ( 1 5 0 呦、c + 0 3 0 2 0 1 ( 8 5 呦、d r b l + 0 9 0 1 0 2 ( 1 7 5 哟、d r b l + 1 2 0 2 0 1 ( 1 2 5 脚、d r b l + 1 5 0 1 0 1 ( 8 5 呦、d p a l + 0 2 0 2 0 2 ( 4 7 o ) 、d p a l 0 1 0 3 0 1 ( 3 8 5 呦、 d p a l + 0 2 0 1 0 1 ( 1 0 5 ) 、d p b l + 0 5 0 1 ( 3 9 5 ) 、d p b l + 0 2 0 1 0 2 ( 1 3 5 ) 、d p b l + 0 4 0 1 0 1 ( 1 3 0 、。 2 、该人群中常见的单倍体型有a 3 3 0 3 0 1 一b 5 8 0 1 ( 7 5 ) ，a + 1 1 0 1 0 1 - b + 4 0 0 1 0 1 ( 5 o ) ，a + 2 4 0 2 0 1 - b + 4 0 0 1 0 1 ( 2 5 ) ，a + 1 1 0 1 0 1 - c + 0 8 0 1 0 1 ( 4 o ) ，a + 0 2 0 7 - c + 0 1 0 2 0 1 ( 3 5 呦，a + 1 1 0 1 0 1 一c + 0 7 0 2 0 1 ( 3 o 哟，b + 4 6 0 1 0 1 - c + 0 7 0 2 0 1 ( 3 0 蜘， b + 4 6 0 1 0 1 - c + 0 1 0 2 0 1 ( 2 5 ) ，b + 1 3 0 2 0 1 c + 0 6 0 2 0 1 ( 2 5 ) ，d r b l + 0 9 0 1 0 1 2 d p b l + 0 5 0 1 ( 9 0 ) ，d r b l + 1 2 0 2 0 1 - d p b l 0 5 0 1 ( 6 5 ) ，d r b l + 1 5 0 1 0 1 一d p b i + 0 5 0 1 ( 3 5 ) , d p a l + 0 2 0 2 0 2 一d p b 0 5 0 1 ( 2 9 5 ) ，d p a l + 0 1 0 3 0 1 - d p b + 0 4 0 1 0 1 ( 1 0 5 ) ，d p a l 0 1 0 3 0 1 一d p b l + 0 2 0 1 0 2 ( 9 5 ) ，a + 1 1 0 1 0 1 - b + 4 0 0 1 0 1 c + 0 7 0 2 0 1 ( 4 ) ，a + 1 1 0 1 0 1 - b + 1 3 0 1 - c 0 3 0 4 0 1 ( 2 ) ，a + 1 1 0 1 0 1 - b + 1 5 0 2 一c + 0 8 0 1 0 1 ( 1 5 ) ，d r b l + 0 9 0 1 0 2 - d p a l + 0 2 0 2 0 2 一d p b l + 0 5 0 1 ( 6 ) d r b i + 1 2 0 2 0 1 一d p a l + 0 2 0 2 0 2 - d p b l + 0 5 0 1 ( 4 5 ) ，d r b l + 1 5 0 1 0 1 - d p a l + 0 2 0 2 0 2 - d p b l 0 5 0 1 ( 3 5 ) 。 3 、数据经过检验符合h a r d y - w e i n b e r g 平衡。 结论 3 浙江大学硕士学位论文 l 、本研究建立的p c r - s b t 方法是可行的。 2 、本研究获取了浙江汉族人群h l a - a ，b ，- c ，d r b i ，d p a l ，- d p b l 基因高分辨遗传数据。 3 、获取了h l a a ，一b ，- c ，d r b i ，- d p a i ，d p b l 基因单倍体型的遗传 数据，为疾病连锁分析和遗传制图等的应用提供了基础数据。 【关键词】人类白细胞抗原复合物( h l a ) ；测序分型( s b t ) ；单核苷酸多态性 ( s n p ) ；单倍体型 4 浙江大学硕士学位论文 r e s e a r c hf o rt h eh l ap o l y m o r p h i s mi nz h e ji a n gh a n p o p u l a t i o nw i t hp c rs e q u e n c i n g b a s e dt y p i n g s c h o o lo fm e d i c i n e ，z h e j i a n gu n i v e r s i t y m sc a n d i d a t ed a iw e i ji a n s u p e r v i s o r p r o f y a nl i x i n g a b s t r a c t b a c k g r o u n d t h eh u m a nm a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e x ( m h c ) i sa l s oc a l l e da sh l a ，w h i c hi st h em o s tc o m p l e xa n dp o l y m o r p h i c g e n e t i cs y s t e mi nh u m a ng e n o m es of a r i th a sp r e d o m i n a n c e s i g n i f i c a n c ei no r g a nt r a n s p l a n t a t i o n ，t h ea s s o c i a t i o nw i t h d i s e a s e sa n dh u m a ng e n e t i c s i ne a r l yt i m e s ，t h e r ea r es o m e l o w - r e s o l u t i o nd a t ab y s e r o l o g ym e t h o d r e c e n t l yh i g h r e s o l u t i o nd a t ai ns e v e r a lo t h e rp o p u l a t i o n sh a v e b e e n r e p o r t e d ，b u tl i t t l ei s k n o w no nt h eh l ap o l y m o r p h i s mi n c h i n e s ep o p u l a t i o n i nt h ea r t i c l e ，w ew a n tt oe s t a b l i s ht h e h i g h r e s o l u t i o nd n at y p i n gf o rh l al o c u sa n di n v e s t i g a t et h e h l ap o l y m o r p h i s mo fh a np o p u l a t i o ni nz h e ji a n go fc h i n a m e t h o d sg e n o m i cd n af r o mi 0 0i n d i v i d u a l sw e r ee x t r a c t e df r o m 0 2m lo f f r o z e nb l o o dc o l l e c t e du s i n gt h ec o m m e r c i a l l y a v a i l a b l ei n v i t r o g e nb l o o dk i ta c c o r d i n gt om a n u f a c t u r e r 7s p r o t o c 0 1 w ea m p l i f i e df u l lg e n o m i cs e q u e n c e so fh l a a ，h l a b ， a n dh l a - ca n d t h e p u r i f i e d p c rp r o d u c tw e r ed i r e c t l y s e q u e n c i n gf o re x o n s2 ，3 a n d4o fh l ac l a s si g e n e s w e a m p l i f i e de x o n2o fh l ac l a s s i ia n dt h ep u r i f i e dp c rp r o d u c t w a ss e q u e n c e df o rw h o l ee x o n2 5 浙江大学硕士学位论文 r e s u l ti ni 0 0u n r e l a t e di n d i v i d u a l so fz h e ji a n gh a ng r o u p 2 2 | 4 2 1 2 4 1 2 5 l8 1 1 9a l l e l e sw e r ef o u n di nh l a a | h l a b ih l a 。c l h l a - d r b i ，h l a - d p a i ，a n dh l a - d p b ir e s p e c t i v e l y t h e m o s t f r e q u e n ta l l e l e sa tt h e s el o c u sa r ea + 1 1 0 i 0 1 ( 2 5 5 引，a + 0 2 0 1 0 1 ( 1 3 5 ) ，a 2 4 0 2 0 1 ( 1 3 o ) ，b + 4 0 0 1 0 1 ( 1 2 5 ) ，b + 4 6 0 1 0 1 ( 1 0 0 ) ，b + 5 8 0 1 ( 8 5 ) ，c * 0 7 0 2 0 1 ( 1 6 5 ) ，c + 0 1 0 2 0 1 ( 1 5 o ) ，c + 0 3 0 2 0 1 ( 8 5 ) ，d r b i 0 9 0 1 0 2 ( 1 7 5 ) ，d r b i + 1 2 0 2 0 1 ( 1 2 5 ) ，d r b i + 1 5 0 1 0 1 ( 8 5 ) ，d p a i + 0 2 0 2 0 2 ( 4 7 0 ) ，d p a i + 0 1 0 3 0 1 ( 3 8 5 ) ，d p a i + 0 2 0 1 0 1 ( 1 0 5 ) ，d p b i + 0 5 0 1 ( 3 9 5 ) ，d p b i + 0 2 0 1 0 2 ( 1 3 5 ) ，d p b i + 0 4 0 1 0 1 ( 1 3 o ) t h em o s tf r e q u e n th a p l o t y p e si nt h i ss t u d yarea + 3 3 0 3 0 1 - b * 5 8 0 1 ( 7 5 ) ，a + 1 1 0 1 0 i - b + 4 0 0 1 0 1 ( 5 o ) ，a + 2 4 0 2 0 1 一b + 4 0 0 1 0 1 ( 2 5 ) ，a + 1 1 0 1 0 1 - c * 0 8 0 1 0 1 ( 4 0 ) ，a + 0 2 0 7 一c + 0 1 0 2 0 1 ( 3 5 ) ，a + 1 1 0 1 0 1 - c 0 7 0 2 0 1 ( 3 0 ) ，b + 4 6 0 1 0 i - c * 0 7 0 2 0 1 ( 3 0 ) ，b + 4 6 0 1 0 1 一c + 0 1 0 2 0 1 ( 2 5 ) ，b + 1 3 0 2 0 l - c * 0 6 0 2 0 1 ( 2 5 ) ，d r b i + 0 9 0 1 0 1 2 一d p b i + 0 5 0 1 ( 9 o ) ，d r b i + 1 2 0 2 0 1 - d p b i + 0 5 0 1 ( 6 5 ) ，d r b i + 1 5 0 1 0 1 一d p b i + 0 5 0 1 ( 3 5 ) ，d p a i + 0 2 0 2 0 2 一d p b i + 0 5 0 1 ( 2 9 5 ) ，d p a i + 0 1 0 3 0 1 一d p b i + 0 4 0 i 0 1 ( 1 0 5 ) ，d p a i + 0 1 0 3 0 i - d p b i + 0 2 0 1 0 2 ( 9 5 ) ，a + 1 1 0 1 0 i - b + 4 0 0 i 0 1 一c + 0 7 0 2 0 1 ( 4 ) ，a + 1 1 0 1 0 1 - b * 1 3 0 1 - c + 0 3 0 4 0 1 ( 2 ) ，a + 1 1 0 1 0 1 一b + 1 5 0 2 一c + 0 8 0 1 0 1 ( 1 5 ) ，d r b i + 0 9 0 1 0 2 一d p a i + 0 2 0 2 0 2 一d p b i + 0 5 0 1 ( 6 ) ，d r b i + 1 2 0 2 0 i - d p a i + 0 2 0 2 0 2 - d p b i + 0 5 0 1 ( 4 5 ) ，d r b i + 1 5 0 1 0 1 一d p a i + 0 2 0 2 0 2 - d p b i + 0 5 0 1 ( 3 5 ) c o n c l u s i o nt h eh i g h r e s o l u t i o nd n at y p i n gf o rh l al o c u si n t h i sr e s e a r c hi sa v a i l a b l e ；w eh a v eo b t a i n e dt h ed a t at h eh l a p o l y m o r p h i s ma n dh a p l o t y p eo fh a np o p u l a t i o ni nz h e ji a n go f c h i n aa n dp r o v i d e ds c i e n t i f i cs i g n i f i c a n ta n dg r o u n d w o r ki n l i n k a g ea n a l y s i s ，g e n em a p p i n ga n df o r e n s i ca p p l i c a t i o n 【k e yw o r d s h l a ；s e q u e n c eb a s e dt y p i n g ( s b t ) ；s n p j 6 浙江大学硕士学位论文 前言 人类的m h c 复合物又被称为人类白细胞抗原( h u m a nl e u k o c y t ea n t i g e n ，h l a ) 系统，它是一组紧密连锁、迄今为止人类基因组中所发现的最复杂的显性遗传系 统，具有高度的多态性，也是迄今为止人类基因组中基因密度最高的区域“。 h l a 系统具有极其重要的功能，如抗原的加工、呈递，控制免疫应答，调节免疫 细胞问相互作用，对异体移植物的排斥，肿瘤监视，参与大量自身免疫疾病的发 生等，表明h l a 涉及生命活动的各个水平与多个方面；同时，h l a 是第一个被 发现与疾病有明确相关联( a s s o c i a t i o n ) 的遗传系统；h l a 多态性的研究及分型技 术的发展使器官移植成为一种极有价值的挽救生命的治疗手段。 h l a 抗原系统主要分为三类9 1 ，h l a i 类抗原，是不同r n a 剪拼后的蛋白产 物，有不同的抗原决定簇“”，主要的抗原为a ，b ，c 等，它们的多态性主要位于 al * oq2 结构域。h l a i 类a ，b ，c 抗原主要分布在所有有核细胞表面。h l a - 类抗原，是一种蛋白异聚体，它们的多态性主要表现在1 31 结构域，在d q 抗原 ql 结构域也表现有多态性，h l a i i 类抗原仅表达在特定的某些细胞上。经常表 达h l a - i i 类抗原的有成熟b 细胞和抗原递呈细胞( 巨噬细胞、树突状细胞) ”1 。 在b 细胞h l a - i i 类抗原表达分化阶段不同而呈现差异。另外，h l a - i i 类抗原中 d r ，d q ，d p 的表达水平也彼此不同，d r 分子的表达最多，其次为d p 分子，再 次为d q 分子。h l a - i i i 类抗原，主要为补体特异性成份。 编码h l a 抗原的基因位于人类第6 号染色体短臂上，全长为4 0 0 0 k b ，约占人 类基因组碱基数的0 1 ，目前已检出的1 0 0 多个基因座位，1 9 9 5 年被命名的h l a 座位共3 7 个“3 “1 。h l a 基因主要分为三类，h l a i 类基因靠近染色体顶端，长为 1 5 0 0 k b ，编码移植抗原“”1 ，主要包括a ，b ，c ，e ，f ，g 等基因，h l a i i 类基 因长为1 0 0 0 k b ，主要包括d r ，3 0 ，d p 三个亚区。h l a - i i i 类基因主要位于i 类基因 与i i 类基因之间，长为1 0 0 0 k b ，主要为补体成分基因。在三类h l a 基因中， h l a - a ，h l a b ，h l a - d r b l ，h l a - d q a i ，h l a - d q b l ，h l a - d p b l 基因具有 很高的多态性。 h l a 抗原的多态性是由基因多态性决定的“。所谓基因水平的多态性就是 在同一个群体的某一个基因座位上，存在两种或者两种以上的等位基因，每一种 等位基因均占有一定的频率。一般认为，d n a 序列中特定位点的变异频率高于 7 浙江大学硕士学位论文 l 为多态性，低于l 为突变。但在不同群体中，某些等位基因对某一个群体是 突变，而对另一个群体就可能表现为多态性，因此在一些情况下，可以将突变看 作低频率的等位基因。h l a 在抗原和基因型水平高度的多态性主要是由于h l a 基因d n a 序列中单个核苷酸变异包括替代、插入或缺失所形成以及基因重组所 引起的；h l a 多基因组合形成单倍体型( h a p l o t y p e ) “”。 早期h l a 的分型技术主要为血清学方法检测抗原，通过一系列的特异性抗体 来指定h l a 的多态性，该方法误差较大。目前h l a 的d n a 分型常见的方法为 p c r - s s p 、p c r s s o 、流式细胞术等删，由于这些方法均基于已知的d n a 序列 进行设计，存在一定的不足，可能错误判断某些位点，而且，结果大多为低分辨 结果。h l a 的测序分型方法( p c r - s b t ) 是目前最准确确认h l a 基因型的方法，本 方法通过扩增目的d n a 片段，采用引物直接检测h l a 基因多态性位点的核苷酸 序列，再与已知的等位基因的序列进行比较，从而指定h l a 等位基因型别，是目 前发现h l a 新的等位基因的主要手段啪”。 本实验利用直接测序方法研究浙江汉族人群中的h l a 基因多态性，由于 h l a 基因及其区域内单核昔酸多态性位点在不同地域和种族的人群的分布存在 着高度的差异，中国人群的h l a 在基因水平的多态性分布、等位基因频率、变异 特征、单倍体型( h a p l o t y p e ) 等知之较少。调查我国不同人群中h l a 等位基因和单 倍体型分布的差异，研究不同民族h l a 区域序列多态性特征，分析不同民族之间 的h l a 基因变化规律，探索h l ad n a 多态形成的可能分子机制，为非血缘关系 器官移植配型、疫苗研制、法医鉴定、个体识别等研究提供有价值的资料，同时， 对保护我国不同民族的遗传资源也具有重要的意义。 浙江大学硕士学位论文 实验材料 一、研究对象 浙江地区健康、无关的无偿献血者1 0 0 名， 抗凝血保存备用。 二、主要实验仪器 l 、p c r 扩增仪 9 7 0 0 2 、恒温恒压电泳仪p a c l 0 0 0 3 、凝胶成像系统g e n eg e n i u s 4 、测序仪a b l 3 7 3 0 5 、低温冰箱 6 、移液器 7 、超净工作台 8 、真空干燥机 s p e e dv a cp l u s 9 、纯水器m i l i q 5 0 l o 、电子天平a t 2 6 1 三、主要实验试剂 l 、d n a 抽提试剂 2 、d n a l a t a q 酶 3 、d n a m a r k e r 4 、外切酶i 5 、碱性磷酸酶 6 、测序分析试剂盒 7 、引物 9 所有样本经其知情同意后采集5 m l a p p l i e db i o s y s t e m s 公司，美国 b i o r a d ，美国 s y n g e n e 公司，英国 a p p l i e db i o s y s t e m s 公司，美国 t h e r m of o r m a 公司，美国 e p p e n d o r f 公司，美国 北京半导体设备一厂 s c ii o as a v a n t ，美国 m i l l i p o r e ，美i 雪 m e t t l e r ，美国 i n v i t r o g e n ，美国 t a k a r a ，美国 t a k a r a ，美国 t a k a r a ，美国 t a k a r a ，美国 a p p l i e db i o s y s t e m s 公司，美国 上海英骏生物技术有限公司 浙江大学硕士学位论文 实验方法 一、样本d n a 提取方法 l 、1 5 m l e p 管内加8 0 0 ul 冷的( o 一5 ) 红细胞裂解液； 2 、在e p 管中加入4 0 0 i x l 全血，混匀3 0 s ； 3 、离心1 3 0 0 0r p mx 1 分钟； 4 、小心倒掉上清( 溶血的红细胞) ，用干净的纸巾沾去e p 管中流出的液体； 5 、加入8 0 0l ll 冷的( o 一5 ) 红细胞裂解液，混匀5 s 溶解沉淀物； 6 、离心1 3 0 0 0r p m x l 分钟； 7 、重复步骤( 4 ) ，e p 管中加入1 0 0 i tl 含蛋白酶的核裂解液( 4 m g m 1 ) ，混匀5 s ； 8 、将样本放入6 5 干浴至少4 5 分钟( 到2 小时1 ； 9 、加2 2 0 p l 蛋白清除液混匀5 s ； 1 0 、0 c - - 5 孵育1 0 分钟( 放入冰盒或冰箱) ； l l 、离心1 3 0 0 0r p m x l 0 分钟 1 2 、小心地将上清液( 含d n a ) 转移至清洁、标记的e p 管； 1 3 、慢慢地加入l m l 冷的( o - - 5 c ) 9 0 乙醇； 1 4 、颠倒混匀6 1 0 次使d n a 沉淀；如果未见白色纤维状或半透明物质( d n a ) ， 可将e p 管放入- - 2 0 冰箱l o 分钟； 1 5 、离心1 3 0 0 0r p m x l 0 分钟 1 6 、小心将上清液倒掉； 1 7 、加入l m l7 0 乙醇，混匀5 s ，离心1 3 0 0 0r p m x l 一2 分钟； 1 8 、倒掉乙醇，打开e p 管，放置挥干乙醇； 1 9 、加入1 0 0pld n a 溶解缓冲液或无菌蒸馏水，将e p 管放入6 5 c 孵育1 5 分 钟，溶解d n a 。 2 0 、离心片刻，放4 c 或2 0 保存备用。 二、流式细胞术 1 m a t r i x 的配制 1 1 取洁净的3 - 7 m l 灭菌试管，分别标上d r g 、d r 5 2 ， 1 2 在d r g 、d r 5 2 相应的试管中加入如下扩增反应体系： 1 0 浙江大学硕士学位论文 无菌蒸馏水 1 4 2 5 i i l h l a d r gm a s t e rm i x 7 5 01 1l taq酶025it l 参照以上体系，按照标本数量的1 1 倍配制，混匀并离心，分装于八联管中，每 管2 2 “l 。 2 标本准备将已抽提好的d n a 逐个在震荡仪上混匀2 - 5 秒钟( 如冰冻的应先 融化后再进行) ，然后以3 0 0 0 转，分的速度离心1 5 秒钟。 3 加模板d n a 3 1 用八联可调间距加样枪每个标本管加入3ul 的模板，加样时应有一人加样， 一人开装有d n a 的管盖，并核对编号。 3 2 盖上盖子，做好标记，离心混匀。 4 p c r 扩增 4 1 打开p c r 仪，预热5 m i n ( 以a b l 9 7 0 0 为例，其它扩增仪参照设备说明) 。 4 2p c r 扩增程序： 热启动9 5 。c ，5 分钟 循环1 ：9 5 c ，3 0 s6 0 c ，4 5 s ；7 24 c ，4 5 s ：8c y c l e s 循环2 ：9 5 。c ，3 0 s ：6 3 c ，4 5 s ；7 2 c ，4 5 s ；3 2c y c l e s 7 2 c ，1 5 分钟 5 杂交 5 1 将探针在5 5 - 6 0 c 在于浴槽上预温1 0 分钟， 5 2 震荡探针1 5 s ，使珠子完全悬浮； 5 3 分别取h l a d r g 、d r 5 2p c r 产物3 8 u l 、3 5 u l ，加到相应的9 6 孔反应板 中，每次杂交按需剪反应板孔数； 5 4 每孔加入相应的探针l oul ，每加1 2 孔混匀一次探针。 5 5 加完后贴上封条； 5 6 p c r 仪上进行杂交，程序：9 7 ，5 分钟；4 7 ，3 0 分钟；5 6 ，1 0 分钟； 5 6 ，保温。 5 7 配制l ：2 0 0s a p e 的稀释液，每孔应加1 1 0 p l 稀释液( d s ) 和o 5 5 i tls a - p e ； 为有足够的稀释液混合物，每次配制样本n + 4 的量。 5 8 在5 6 、1 0 分钟后，在p c r 仪上每孔加入1 1 0 pld s s a - p e 混合液： 浙江大学硕十学位论文 5 9 加完后，立即放于l u m i n e x 上进行分型，采用自动判读软件进行分析。 三、p c r 扩增 ( 一) h l a - a 、- b 、一c p c r 扩增 引物参照h l a a 、b 、c 基因序列，由上海英骏生物技术有限公司合成( 见 表1 - 表3 ) 。扩增反应体系总体积为2 5pl 。 d w h 2 0 1 5 1 i i l l a l 0 p c r 缓冲液 2 5 u l 1 0 d n t p 2 5 u l m g c l 2 ( 2 5 m m o l 1 ) 4 0pl p 1 0 1i l l p 2 0 1ul l a t a q 0 2 ul 样本d n a2 5 l l l a b i 公司的9 7 0 0 型p c r 自动扩增仪扩增，扩增条件为9 5 c 预变性5 m i n ， 9 5 3 0 s ，6 7 4 5 s ，7 2 3 m i n 3 0 s ，3 5 个循环，7 2 延伸l o m i n 后冷却至4 c 。 表1h l a ap c r 扩增引物和测序引物序列 引物名称5 一3 碱基序列 5 端扩增引物 3 端扩增引物 2 号外显子5 端测序引物 2 号外显子3 端测序引物 3 号外显子5 端测序引物 3 号外显子3 端测序引物 4 号外显子5 端测序引物 4 号外显子3 端测序引物 c c c a g a e g e c g a g g a t g g c e t t g g g g a g g g a g c a c a g g t c a g e g t g g g a a g c c t c c t e c t g c t a e t e t c g g t c t c g g a c c c g g a g a c t g t c a g t t t a g g c c a a a a a t c c c c g g a g a t c t a e a g g c g a t c a 铭 a a g a t g g c e a e a t g e g t g g g c c c t g a c e e t g c t a a a g 表2h l a - bp c r 扩增和测序引物 引物名称5 一3 序列 5 扩增引物 3 扩增引物 2 号外显子5 测序引物 2 号外显子3 测序引物 g g e a g a e a g t g t g a e a a a g a g g c e t g g g g a g g a a a e a c a g g t c a g c a t g g g a a c g 群唔g g a a a t g g c e t c t g a t g g g g a g t c g t g a c c t g 1 2 浙江大学硕士学位论文 3 号外显子5 3 号外显子3 4 号外显子5 4 号外显子3 测序引物 测序引物 测序引物 测序引物 t t c a g t t g a g g c c a a a a t c c c a t m c c t c c t c t o c t c g t g g t c t c a g g c t g g t c a c a t 鹊 c c t c a t c t t c c c c t c c t tt c 表3h l a - cp c r 扩增和测序引物 引物名称5 一3 序列 5 扩增引物 3 扩增引物 2 号外显子5 测序引物 2 号外显子3 测序引物 3 号外显子5 测序引物 3 号外显子3 测序引物 4 号外显子5 测序引物 4 号外显子3 测序引物 t c a g g c a c a c a 暑1 昏晷k c a a a g a t t c g g g g a g g g a a c a c a g g t c a g t g t g g g g a c a g g g t c g g g c g g g t c t c a g g g g c c g t c c g t g g g g g a t g g t t t a g g c c a a a a t c c c c g c c t c c c a c t g c c c c t g g t a c c c c a a a g a c a c a c g t g a c c c a c a t c t c a g g g t g a ( a g ) g g g c t c ( 二) h l a d r bp c r 扩增 引物参照h l a - d r b l 、3 、4 、5 基因序列，由上海英骏生物技术有限公司合 成，见表4 。扩增反应体系总体积为2 5 p l 。 d w h 2 0 1 5 5 p l l a l o x p c r 缓冲液 2 5 l l l 1 0 d n l l p 2 0 ul m g c l 2 ( 2 5 m m o l 1 ) 2 0ul p 10 1 5 p l p 2 0 1 5 u l l a - t a q 0 2 1 tl 样本d n a2 5 p l a b i 公司的9 7 0 0 型p c r 自动扩增仪扩增，扩增条件为9 4 预变性2 r a i n ， 9 4 c3 0 s ，6 5 c5 0 s ，l o 个循环；9 4 。c3 0 s ，6 2 3 0 s ，7 2 c3 0 s ，2 0 个循 环；7 2 延伸1 0 m i n 后冷却至4 c 。 表4h l a d r bp c r 扩增和测序引物 引物名称 5 一3 序列 5 d r x 2 p c r l 5 d r x 2 p c r 3 t g t a a a a c g a c g g c c a g t g g t t c c c a g t g c c c g c a c c c t t g t a a a a c g a c g g c c a g t g l l c c a g t g c c c g c a c c c c a 1 3 浙江大学硕士学位论文 5 d r x 2 p c r 4 5 d r x 2 p c r 5 5 d r x 2 p c r 6 5 d r x 2 p c r 7 5 d r x 2 p c r 8 5 d r x 2 p c r l 3 3 d r x 2 p c r l 3 d r x 2 p c r 2 3 d r x 2 p c r 3 3 d r x 2 p c r 5 3 d r x 2 p c r 6 3 d r x 2 p c r 7 3 d r x 2 p c r 8 3 d r x 2 p c r 9 5 测序引物 3 测序引物 t g t a a a a c g a c g g c c a g l t c c c c g g a g g c c g c t t c t g t a t g l a a a a c g a c g g c c a g t g g l v r c c c a g i g c c c g c a c c c g t g t a a a a c g a c g g c c a g t c g g l l a a g g 下i c c a g t g c c t t g t a a a a c g a c g g c c a g t t c g g g g r r a t g g t t g g g a t c a t g t a a a a c g a c g g c c a g t g g t g g t g g g c g l l c g g c g t g t a a a a c g a c g g c c a g t g c c t c a g g a a g a c t g a g g a c c a g g a a a c a g c m u o a c c a c a c a c a c a c t c a g a l l t c c c a g g a a a c a g c l ： t g a c c a c a c a c a c a c t c a g 兀c c a c a g g a a a c a g c t a t g a c c a c a a c c a c a c t c a g ：兀c c a c a g g a a a c a g c 玑u g a c c a c a c a c a c t c a g a t t c c c a g t c a g g a a a c a g c t a t g a c c c a c a c a c a c a c a c a c a c a g a g c a g g a a a c a g c l ：a t g a c c a c a c a c i c i c t c t c a g 1 1 t c a g g a a a c a g c t a t g a c c c a c a c a t a c a c a g n r t c c c c c a g g a a a c a g c l a t g a c c c t c a ga = i r f c c c a g c t c a c a a t g l - a a a a c g a c g g c c a g t c a g g a a a c a g c l - a t g a c c ( - - - ) h l a - d p a 、- d p b ip c r 扩增 引物参照文献，由上海英骏生物技术有限公司合成，见表5 、表6 。扩增反 应总体积为2 5 u l 。 d w h 2 01 5 9 p l l a l 0 p c r 缓冲液 2 5 l l l 1 0 d n t p2 o i il m g c l 2 ( 2 5 m m o l 1 )