（临床检验诊断学专业论文）应用肝细胞移植介导胰岛移植中的免疫耐受.pdf

i h 墓塞缉堕逦丛坠! 皇! i 垒! i q 塑 a b b r e v i a t i o n英文 a h a g t a v l 【； u s a ： ；i ) d w d m i ) i 7 i 、1 3 ( ； f c f l c i s l 。1 、x c t x i i b s s i 。 s l 。- c s a s i 川c 1 x s l ，1 l x lk 、 | i 川1 6 4 ( 圳【) e v s 1 1 中文 a n t j b o d y抗体 a n t i g e n抗原 a n i m ajt r i a l 动物实验 a v e r a g e平均值 b l o o d ( ；lu c o s o血糖 c y c l o s p o r i t i ea环孢素a ：jl i m o sd is t i1 1e dw a t e r 3 d 蒸馏水 d i a b e t e sm e l lit u s 糖尿病 1 ) it h iz o n e 舣硫腙 f a s tin gb l o o d g lu c o s o空腹血糖 i t e p a t o c y t e i t e p a t o c y t e t r a n s p i a n t a t i o n 1 0 11 0 w e d b y i s l e t t r a n s p l a n t a t i o n t l e p a t o e y t e l r a n s p l a n t a ti o i l t t e p e s i t a n k s b u l 、f e r i n g s o l u t i o n 【s l e t i s l e t t r a n s p l a n t a ti o n w it hc s at f e a t m e f l t is 1e t h e p a t o c y t e c o t r a l l s p l a n t a t i o n ls l e t t r a n s p l a l l t a t i o n ln s u l in ln t c r n a ti o i l a i ls le t f r a n s p i a n tr e g is t r y s a l i i l es ) lu ti 0 1 1 c u lt u f em e d i u m s t a n d a r dd e v i a t i o n s t r e p t o z o t o c in s t r e p tr ) z f ) c j d 7 f r a n s p i a n t a t i o i l 肝细胞 先行肝细胞移植 后行胰岛细胞移 植 肝细胞移植 i e p e s t t a n k s 缓 冲液 胰岛细胞 胰岛绌胞移植发 免疫抑制剂应j j 胰岛细胞肝细胞 叫时移植 胰岛细胞移植 胰岛素 闰际胰岛移植记 习之 尘理盐水 培养液 标准等 链脲壤素链脲 五：旃素 移植 、 应用肝细胞移植介导胰岛移植中的免疫耐受 ( 摘要) 目前1 型糖尿病治疗主要是以注射胰岛素来控制血糖但疗 效欠佬。现已证实胰岛细胞移植较为理想。但亦存在移植胰岛细 胞存活时间短及病人需要长期使用免疫抑制剂等问题。| j 前临床 f ：已发现肝组织胰岛细胞联合移植能成功的延长胰岛细胞存活时 问。但从细胞水平研究卅细胞胰岛细胞联合移植对治疗糖尿病的 作用未见任何报道。本文通过观察不i 司条件f 的叶、胰岛细胞联 合移植对糖尿病模型大鼠的治疗效果，以期探索最佳的联合移植 ， 方案为临床联合肝、胰岛细胞移植提供实验依据。溶实验首先建 - 、，大鼠糖尿病模型，及制备肝和胰岛细胞移植悬液。实验分糖尿 病模犁未行移植手术( d m ，d i a b e t e sm e l l i t u s ) 及卒自悬液移植 ( r p m i 1 6 4 0 ，培养液) 两个对照组和单纯胰岛细胞移植( i s l ， l s l e t s ) 、先行肝细胞移植后行胰岛细胞移植( n c i s l ，i l e p a tc ，c y t e tr a n s p ia n i a t i ( ) n1 o l1 ( ) w e d b y is lc t t r a n s p l a n t a t i o i l ) 、l 、f 纯腴岛细 胞移植加用免疫抑制剂环孢素a ( i s l c s a ， ls l e t t r a n s p l a n t a t i o nw i t hc y c l o s p o r i na ( c s a ) t r e a t m e n t ) 及胰岛 细胞卧细胞混合联合移植( i s l h c ，l s l e th e p a t o c y t e c o t r a n s t p l a n t a t i o n ) p u 个实验组。观察手术前后i n l 耥和胰岛素 ， 水平的变化，并仵| 叫一时问处夕e 受体行病理细胞学检查。结果发 现i 司时胰岛细胞肝细胞联合移植( i s l h c t x ) 及单纯胰岛细胞移植 加用免疫抑制剂( i s l c s a t x ) 组在未加外源胰岛素治疗卜- 一周内 控制血l 糖于正常水平( 1 6 8 m m o l l ) 。该结果较单纯胰岛细胞移 植( i s l t x ) 、先行_ i 细胞移植后再行胰岛细胞移植( h c i s l t x ) 组有 娃著差异( p 1 6 8 m m o l l ( 1 m m o l l - 1 8 0 2 m g d 1 ) 模型建成。( 本实验当 中所测血糖均为率腹【f 皿糖，所有大鼠禁食46 小时后测血 糖。) 1 3 如在注射链脲霉素后2 大未出现血糖变化可继续 冉注射2 s t z 一次。如3 天后仍未达模型血糖要求，大鼠 模型形成失败。 2 大鼠肝细胞制备： 2 1 正常供体大鼠给予1 ( 1 0 9 l ) 戊巴比妥钠4 0 0 u l l o o g 腹 腔注射麻醉。 2 2 将大鼠同定存手术台上，备皮，常规碘j 了肖毒， 铺l 儿 2 3腹中线开腹。 2 4如有m ，用棉签轻轻点胝。 2 5 用棉签将川脏暴露。 2 6 先将小m 符套管针用预冷却i x h a n k s 液冲洗1 次。 2 7 门静脉肝外5 n m l 处松放结扎线环，小i f l l 管套管捅入j 静脉 1r 虿肝脏，退出套管针导针+ ，结扎线环固定套管针。 2 8门静脉灌注l o m l 含肝素2 u m l 的冷却h a n k s 液，缓慢推 入直到肝脏颜色完全变灰白色。 2 9肝脏颜色完全变灰白色后，肝脏略肿大，用眼科剪快速切 卜取f 肝脏。 2 1 0冷却h a n k s 液冲洗肝脏后放入1 5 m 1 冷却的胶原酶溶液 巾。 2 11切开肝纤维囊在胶原酶溶液中剪碎至直径5 m m 大小碎块。 2 1 2 将肝脏及小玻璃烧杯放入3 7 。c 水浴中，并固定烧杯避免倒 翻。 2 1 33 7 。c 水浴中胶原酶消化约3 0 m i n ，期间每隔5 - l o m i n 观察 消化情况。 2 1 4消化液混浊及肝组织用镊。- = ：轻甩时可见肝组织碎开时，消 化已完成。 2 1 5 将装有肝组织及皎原酶溶液的烧杯耳义出来，加冷却h a n k s 液l o m 停止消化过程。 2 1 6 将烧杯所有内容转至已硅化处理的5 0 m 1 离心管。 2 1 7 离心筒振荡涡旋仪振匀后，用低速低温离心法清洗细胞去 除胶原酶、破坏了的细胞和非盯实质来源的细胞。 2 1 8低温离心条件渊为4 。c 、r o t o rn o ：4 0 、0 3 5 9x1 3 9 0 1 ，p m ， 1 9 离心漂洗3 m i n 。 2 1 9 离心后肝组织混合液将分层，将上清( 含有胶原酶溶液及 h a n k s 液) 倒f 。 2 2 0再加1 0 m l 冷却h a n k s 液，振荡涡旋仪振匀后再次离心， 共重复3 次离心漂洗步骤。 2 2 1 最后一次离心漂洗后，用1 5 0 b m 双层尼龙筛滤过细胞悬液， 静置，如有未消化者蕈复胶原酶消化、冲洗、离心漂洗步 骤。 2 2 2将所滤出细胞悬液再次离心。离心将悬液分层，e 清为漂 洗液，沉淀物为所需要的肝细胞。 2 2 3离心后将卜清倒出，留所要的沉淀物，混入1 0 m l 含2 0 胎牛廊清及双抗( 青霉素g + 链霉素) 的r p m i1 6 4 0 培养液， 该悬液中含肝细胞。 2 2 4滤过悬液收集肿细胞，加入含2 0 d 、牛f f l 清的r p m i1 6 4 0 培养液中，制成大约6 x 1 0 “m l 的_ l ； f 细胞( h c ) 悬液。 2 2 5 取少许h c 悬液予t r y p a nb l u e 染色检测h c 活性。 2 2 6其余装入培养瓶，常规5 c 0 2 、9 5 0 2 、3 7 。cc o j 孵箱内培 养。 3 大鼠胰岛细胞制各： 3 1 供体大鼠1 戊巴比妥钠( 剂晕同l 二) 腹腔注射麻阱。 ) n 川q 协和段科大学毕啦论丈 3 2 将大鼠固定在手术台上，备皮，常规碘叮消毒，铺巾。 3 3 腹中线切口开腹，如有小血，应用棉签轻轻点压。 3 4用棉签露出胰腺及胰管。 3 5 将胰腺十：指肠叶暴露出，并摆好位置，( 见照片1 ) 。 3 6 找胰管和进入卜二指肠乳头处。 二指肠乳头处，小针细 线缝合结扎，扎闭进十二指肠胰管，避免灌注胶原酶时，胶 原酶灌入肠内。 3 7 好t 门处找h r 总管分叉处。斟大鼠无胆囊，胆总管商接入胰腺 形成胰管。将胆总管轻轻分离出来，穿线结扎。此时胰管两 段已结扎，可见胰管略肿起，( 见照片2 ) 。 3 8插管前先行f 腔静脉或腹主动脉捅管抽净约5 m l 血( 见照片 3 ) 。此步骤为避免出血性坏死忭胰腺炎发生( 见照片4 ) 。 3 9 将l m l 注射器针头“l ”型，针管抽出所需要晕的冰镇胶原 酶溶液。腴管内1 m 1 注射器针头逆行插管，手同定位置，确 定针头存胰管内时，腆管内灌注冷却胶原酶溶液约5 m l ( 胶 原酶v 犁1 5 m g m l ，0 0 2 m l 每克大鼠体晕) 使腴腺扩张膨 胀后取 胰腺( 她照片5 ，6 ) 。 3 11 为避免快速消化将离体胰腺放入冰浴的5 m l 胶原酶溶液( 小 烧杯装置) ( 见照片7 ) 。 3 1 2 放k f 负, 热：3 7 。c 水浴箱内，问定烧杯避免倒翻。 ，l 3 1 3开始计时消化时问，约1 52 0 m i n 。需要每5 m i n 观 察消化情况避免消化过度。 3 1 4当胶原酶溶液颜色变深及混浊，胰腺提起时稀疏，轻 甩时能看见胰腺组织类似“溶化”样滴f 来，烧 杯中胰腺组织较碎，此时消化已完成。 3 1 5 快速取出烧杯，加入冷却h a n k s 液l o m l 终止消化。 3 1 6 将烧杯所有内容转到已硅化处理的5 0 m l 离心管。 3 1 7 离心管振荡涡旋仪振匀后低速度低温离心法清洗细胞去除 胶原酶。 3 1 8 低温离心条件调至4 。c 、r o t o rn o ：4 0 、0 3 5 9x1 3 9 0 r p m ， 离心漂洗3 m i n 3 1 9离心后胰腺组织混合液将分层，倒出上清( 含有胶原酶及 h a n k s 液) 。 3 2 0阿加l o m l 冷却h a n k s 液，振荡涡旋仪振匀后再次离心， 其重复3 次离心漂洗步骤。此时如怨f i c o l1 梯度离心可见 步骤3 0 ，如不梯度离心可继续步骤2 1 。 3 2 1 最后一次离心漂洗后1 5 0 9 m 双层艟龙筛滤过细胞悬液、过 滤可用滴管辎微的给：f 负胝吸引，静置。如有未充令消化 的胰腺组织，需霞复胶原酶消化、冲洗、离心漂洗步骤。 承复消化时，可将朱完伞消化的余胰腺组织剪碎成商径5 n m l 碎块进行消化。 3 2 2 将所滤m 细胞悬液阿次离心，卜清为漂洗液，沉淀物为所 需要的胰岛细胞部分。 3 2 3 离心后将j 二清倒出，留所要的沉淀物，混入l o m l 含有2 0 胎牛血清的r p m i1 6 4 0 培养液，但此时该悬液中除所需的 胰岛细胞( 内分泌部分) 外还存在胰腺外分泌细胞，需要 进行手挑选( h a n d p i c k i n g ) ，挑出想要的胰岛细胞。 3 2 4闪胰岛细胞较脆弱，为保证存活率，避免胰岛细胞在培养 液中沉淀，必须时时保证胰岛细胞悬浮。 3 2 5 将胰岛细胞悬液分批进行双硫腙( d t z ) 染色，进行挑选。其 余等待染色的膜岛细胞悬液放入冰浴中保存，也可暂时放 入5 c 0 2 、9 5 0 2 、3 7 。cc o ? 孵箱内。 3 2 6 培养肌巾d t z 染色。按l ：3 ( d t z ：标本) 的比例染色。加 d t z 后需要孵浴5 - l o m i n ，让染料完伞被胰岛细胞吸收，肖 肉眼可见培养m 内有细小红色颗粒，表明染色l 三完成( 弛 照片8 ，9 ) 。 3 2 7 倒置解剖镜卜观察l 二被d t z 染色的胰岛细胞。如谥培养皿 巾标本密集，可rr p m i1 6 4 0 培养液稀释分装，j ：及秃头 针进行手【：挑选。将挑选f l 来的胰岛细胞手 入已准备好的 冰浴i o m l r p m i1 6 4 0 培养液巾。挑选时计数。 ) ： ，【司协和医科大学毕业论文 照片2 ：胰管入f 一：指肠乳头处及肝门i x i e n _ 总管结扎 卜旧协和医科大学毕业论文 照片4 ：出血性坏死性胰腺炎 叶i 词协桕l 睦科大学毕业论文 照片6 ：胶原酶v 型灌注后 川q 协和跃利久学牛业论文 照片8 ：胰岛细胞( d t z 染色，x i o ) 2 7 q 协和睡科大学毕业论文 照片1 0 ：脾包膜下注射移植悬液 3 2 8取少许胰岛细胞悬液予t r y p a nb l u e 染色检测胰岛细胞活 。阽。 3 2 9 将挑选出的胰岛( i s l ) 细胞加入r p m i1 6 4 0 培养液中制成 i s l 细胞悬液。 3 3 0f i c o l 梯度离心： 3 3 0 1静置卜准备f i c o l l 不同浓度梯度分层管。先往试管底 层加入5 m 1 2 5 f i c o ll ，沿试管壁在2 5 f i c o l1 卜i 轻轻、缓 慢的滴入2 3 f i c o l l ，此时应见两层f i c o l l 梯度柱。r 。f 司 样按 述方法加入2 0 5 和1 1 f i c o l l 。4 层f i c o l l 形成 梯度离心柱。 3 3 0 2将离心过胰岛细胞沉淀物混入5 m l r p m i1 6 4 0 培养液， 将胰岛细胞悬液按上述f i c o 1 分层加样法缓慢加入梯度离 心柱最卜层。 3 3 0 34 。c 、r o t o rn o ：4 0 、0 3 5 9x1 3 9 0 r p m ，进行梯度离心， 离心3 m i n 。 3 3 0 4 离心后发现胰岛细胞层已降至2 5 一2 3 、2 3 2 0 5 5 层 问。 3 3 0 5玻璃滴管插入胰岛细胞层，吸取胰岛细胞悬液。 3 3 0 6吸取腆岛细胞悬液装入新试管内，混入1 5 m ll xh a n k s 液进行离心漂洗。再复至f i c o l l 成分已完伞洗净。 ，q 3 3 0 7此时按照步骤2 l 完成对胰岛细胞的处理。 4 移植： 移植悬液按照以卜移植分组而准备( 见表格3 ) 。 1 所有移植悬液容量定量为l m l 。 2 按照所需要移植量( 每只大鼠移植l m l 移植悬液) ，将前序 已计数及准备好的移植物悬液离心成浓缩移植物沉淀。 3 移植物沉淀物混入相应容量的r p m i1 6 4 0 培养液，混均匀， 注射器吸取l m l 移植悬液准备移植。注意标明移植悬液。移 植前可放冰床j ：等待使用。 所有分组内受体大鼠为糖尿病模型鼠，受体根据所接受的移植物 而定组。所有移植悬液容量定量为l m l 。分组移植物所标明为每毫 升细胞数量。 4 1受体大鼠1 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。 4 2将大鼠网定在手术台i ：，备皮，常规碘叮消毒， 铺j 。 4 3行移植术前先取尾静脉血测i 缸糖。 4 4左侧腹旁线小切u 开腹。 4 5如有 m ，j 哑用棉签轻轻点胝。 4 6暴露脾脏。 4 7 棉签轻轻游离脾脏虿表血i 。 1 0 4 8脾包膜下直接穿刺注入按分组而定的相应细胞 悬液( 见照片1 0 ) 。 4 9避免注射区细胞悬液外渗及出血，以棉棒轻轻点压。 4 1 0 关腹。 4 1 1大鼠身，i ：标记分组序号。 4 1 2 术后再次取尾静脉j 缸测血糖及胰岛素。 4 1 3为测m 胰岛素，高速离心分离血清。离心后提取 表格3 ：糖尿病模型大鼠分组分配表 分组分组名称备注大鼠数 特点量( 只) 第l 组 糖尿病模型未行移植术 2 对照组 鹪2 组r p i i i1 6 4 0 移植悬液为培养液 3 空白对照组 第： 组i s l t x 单纯胰岛细胞移植悬液， j i s i = 1 0 0 3 0 0 个胰岛细胞 筇4 纽i s l h e t xl t c 和1 乩混合移植悬液 5 t i c 2 o x1 04 ， i s l 。= 1 0 03 0 0 个 筇5 纽h e i s l t x 先行l c t x ，2 4 4 8 ，j 、时后再j 行i s l f x t i c 2 5 x 1 04 ， i 钆= 1 0 0 3 0 0 个 筇6 组 i s l c s a 单纯胰岛细胞移植后给_ 5 环胞a 免疫抑制剂及抗乍 素 f 霉素+ 甲硝唑 m 清装入e f f e n d o r f 管一2 0 0 c 保存，等待姣岛素 放射免疫检测。 4 1 4目检测血糖前46 小时禁食。平时自由饮食。 4 1 5第1 至第5 组术后未给予任何药物。单纯为每口检测血糖。 4 1 6第6 组i s l c s a 组在手术当天，术后开始给予免疫抑制剂 及抗生素治疗。剂量为：c s a5 m g k g d 、青霉素1 3 3 万 u k g d 、甲硝唑1 7 5 m g k g d 。均为肌肉注射，1 次日。 5 检测指标： 5 1 定时检测：糖尿病模犁形成后、移植术前、移植术后至处 死取病理标本。所有血样标本经尾静脉获取。 5 1 1 榆测mb g ：每日定时检测i f 【l 糖前4 6 小时禁食。平时自由 饮食。 5 1 2i n s u li n ：胰岛素测定采血凼大鼠本身血少，限制于移植手 术当天及大鼠处夕匕当天取血。 5 2 大鼠处死：给受体大鼠较大量1 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。 在大鼠处步e 前迅速将脾脏切除。将离体脾脏浸泡l o 甲醛 内同定。同定后制病理标本石蜡块，以便保存及切片染色。 5 2 1 细胞病瑚学( 脾脏) ：h e 染色 5 2 1 1 观察h c 和i s l 形态及牌内存活情况。 5 2 1 2 观察淋巴细胞浸润情况。 5 3 腴岛豢放射免疫榆测泫： 1 ， 5 3 1 检查试剂盒内容是甭齐全，止确。 5 3 2 准备及标明2 个n s b 管、2 个s 。，至s 。的标准管、2 个总t 管，此均为标准管。 s 管为：s 。，= 标准品oi , i t m l s ，= 标准 5u il m s f 标准 1 0l , i l m l s 、= 标准晶2 0i , t m l s ，= 标准品4 0i z l u m s f 柄i 准d f l8 0“l m l s 。= 标准l i l l l1 6 0uju m l 其余管二f 为标本管，按照白编顺序标明。如标本血清量足 够则可行标本甲行瞥。 5 3 3 按照以卜表格4 加样：所有加样单位为u l 。 表格4 ：标本、抗血清加样量表( u 1 ) 5 3 4 每个试管充分混匀。在3 7 。c 水浴中温浴3 0m i n 。 5 3 5 按照以卜表格j 继续加样。 表格5 ：i 司位素( ”j ii n s ) 加样晕表( u 1 ) 12 5 i i n s n s b1 0 ( ) s 。至s 。 1 0 ( ) 标本 1 ( ) ( ) 总t l ( ) 0 5 3 6 将2 个总t 管r ( c p m ) 加样后取出，分开放。总t 管不 经过任何处理，等待放射免疫计数。 5 3 7 每个试管充分混匀。在3 7 。c 水浴中温浴2h r s 。 5 3 8 按照以下表格6 继续加样。 表格6 ：分离剂加样量表( u 1 ) 5 3 9 所有管子混匀，室温放置1 5 m i n ，离心( r o t o rn o ：4 0 ， 3 0 0 0 r p m ，2 0 。c ) 1 5 m i n ，吸去上清液，测各管沉淀的放射巾生 计数( c p m ) 。 结果 1 胰腺消化所需要时问：提取胰腺分离胰岛细胞过程中，胰腺消 化所需时问平均为1 7 8 2 2 m i n ( n = 5 0 ) 。 表格7 ：动物实验a t 胰岛细胞分离、消化、提取 体重( g )血糖( m m o l l 。)消化时间胰岛细胞获得量 ( m i n )( 个) a v3 2 2 0 8 7 817 8 56 2 9 s t d e v 8 9 0 02 42 2 01 8 l 2 观察及判断胰岛细胞纯度：分离后胰岛细胞经过d t z 染色可明 显分别出内分泌及外分泌细胞。内分泌细胞( 胰岛细胞) 均已 染成鲜红色，外分泌细胞与其培养液背景无特殊显示，为橘色， ( 见照片8 ) 。本实验使用两种纯化方式提取胰岛细胞；第一种 为f i c o l l 梯度离心纯化，第二种为d t z 染色后手1 j 挑选，吸取 腴岛细胞( 见照片9 ) 。比较f i c o l l 梯度离心纯化法和d t z 手 i ：挑选纯化法发现结果相似，但手：f 挑选胰岛细胞形状较 f i c o l l 梯度离心完整及均匀。 3 胰岛细胞手工挑选收获量：在显微镜下可见3 种大小胰岛细 胞，最小商径为7 5 p m ，最大为2 5 0 9 i n 。大部分胰岛细胞商径为 1 0 0 1 2 0 u m 。在倒置解剖显微镜下挑选直径1 2 0 2 0 u m 大小胰 岛细胞，消化，手挑选后每只大鼠的胰岛细胞最少获得疑为每 只大鼠1 0 0 个胰岛细胞，最大量为每只大鼠1 2 0 0 个胰岛细胞， 平均6 2 9 1 8 1 个腴岛细胞( n - 5 0 ) ，( 见表格7 ) 。 3 肝脏消化所需要u , j - f h j ：提取肝脏分离肝细胞过程中，肝脏消化 所需时间平均为3 3 5 9 2 m i n ( n = 5 0