（作物遗传育种专业论文）农杆菌介导玉米自交系受体材料筛选及遗传转化体系的建立.pdf

摘要 在农杆菌介导的植物转基因技术应用过程中，由于大多数单子叶植物都不是农 杆菌的天然寄主。因此，禾本科植物尤其是重要的粮食作物如小麦、水稻、玉米长 期以来一直被排斥在农杆菌宿主范围外。直到二十世纪9 0 年代以后由农杆菌介导 转化的这三大粮食作物才逐步取得成功。由于农杆菌是自然界存在的天然基因工程 载体，利用农杆菌转化的理论机理研究最清楚，并且该方法具有操作简单，费用低 廉，能够转入较大的外源d n a 片段，插入拷贝数低，遗传转化频率高等优点，一直 以来是一种较为广泛使用的基因转化方法。玉米转基因研究的大量实践表明，幼胚 离体培养诱导出的胚性愈伤组织可作为理想的受体系统。在农杆菌介导的玉米遗传 转化中，受体基因型是影响农杆菌转化效率的一个重要因素，不同基因型之间转化 效率差异显著。为了扩大能被农杆菌转化且能再生的受体植物种类以及提高转化效 率，在过去l o 年中，不少研究者在改造农杆菌，改变受体的培养条件，优化转化 系统上做了很多努力，但由于受体基因型限制，很多推广品种及自交系仍不能被农 杆菌转化，迄今为止，利用农杆菌介导转化的玉米受体材料仍然很少。 本研究以四川农业大学玉米研究所的7 0 个优良玉米自交系幼胚为材料，在n b 培养基上进行离体培养。结果发现，供试的7 0 个白交系的胚性愈伤组织诱导率存 在明显差异，其中有1 3 个自交系( 6 0 0 2 、6 0 0 5 、6 0 2 2 、6 0 2 4 、6 0 2 9 、6 0 4 3 、6 0 4 8 、 6 0 6 1 、6 0 7 0 、6 0 7 1 、6 0 7 4 、6 0 7 8 和6 0 8 1 ) 完全不能诱导出胚性愈伤组织；其它5 8 个自交系中，胚性愈伤组织诱导率最高可达9 6 ( 6 0 1 3 ) ，最低的仅为3 4 8 ( 6 0 7 9 ) 。 通过4 次继代，筛选出了胚性愈伤组织诱导率高、繁殖能力强、耐长期继代并且能 再生成苗的1 0 个自交系，分别是6 0 1 0 、6 0 1 5 、6 0 3 4 、6 0 3 8 、6 0 5 0 、6 0 5 l 、6 0 5 8 、 6 0 6 0 、6 0 6 9 和6 0 7 7 ，其中胚性愈伤组织绿苗分化率最高可达6 1 1 1 ( 6 0 1 0 ) ，最低 仅8 3 3 ( 6 0 6 9 、6 0 7 7 ) 。 为了进一步筛选出适合作为农杆菌介导的遗传转化受体材料，即对农杆菌敏感 的受体材料，本研究将筛选出的这1 0 个自交系的胚性愈伤组织作为受体材料，分 别用农杆菌c 5 8 和g v 3 3 0 l 对其进行转化，利用植物载体中携带的b 一葡萄糖苷酸酶 基因( b g l u c u r o n i d a s e ，g u s 基因) 的瞬时表达和绿色荧光蛋白基因( g r e e n f l u o r e s c e n c ep r o t e i n ，g f p 基因) 的瞬时表达研究不同基因型受体材料对农杆菌的敏 感性。g u s 瞬时表达率的统计分析结果表明，不同基因型受体材料问的g u s 瞬时表 达差异显著，在1 0 个基因型中除6 0 3 4 和6 0 3 8 对农杆菌c 5 8 不敏感外，其他基因 型对农杆菌c 5 8 都比较敏感。因此认为，自交系6 0 5 1 、6 0 1 0 、6 0 1 5 、6 0 6 0 和6 0 5 0 是再生性强且对农杆菌c 5 8 敏感的转基因受体材料。对1 0 个基因型的g f p 瞬时表 达的荧光检测发现，在6 0 3 4 、6 0 3 8 、6 0 5 0 和6 0 1 0 的愈伤组织上没有检测到g f p 瞬时表达，说明这4 个基因型受体对农杆菌g v 3 3 0 l 不敏感，而其它6 种基因型的 愈伤组织是对农杆菌g v 3 3 0 1 敏感的受体材料。最终筛选出的6 0 1 5 、6 0 5 l 和6 0 6 0 这3 个对农杆菌g v 3 3 0 1 敏感且具有高再生性的自交系材料。将有g f p 瞬时表达的 阳性愈伤转入共培养基，继代2 3 w 后在荧光显微镜下仍能检测到绿色荧光。 很多个因素都会对农杆菌的转化效率产生不同程度的影响，成功转化往往需要 针对特定植物和组织进行多因素优化。本研究在进行农杆菌敏感受体材料筛选前， 分别对影响转化效率的一些转化条件进行了优化，如对材料的高渗处理，侵染时的 真空渗透，乙酰丁香酮的添加，最佳侵染时间和共培养天数的确定。统计分析结果 表明，对受体进行甘露醇高渗处理可提高转化效率，但高渗处理过度会严重影响绿 苗再生能力，因此，应根据受体基因型确定最佳高渗处理浓度。在侵染时进行真空 渗透1 0 m i n 能较大幅度的提高转化效率。在未真空减压渗透时，加1 0 0 9 m a s 与不 加a s 的转化效率间差异不显著；而在真空减压渗透时，加1 0 0 9 m a s 与不加a s 的 转化效率的差异达到极显著。上述结果说明在真空渗透时添加1 0 0 9 m a s 更能发挥 a s 提高转化率的作用。考虑到转化效率以及农杆菌对愈伤的毒害，在侵染时真空渗 透1 0 m i n 的情况下，共培养3 天最适宜。 关键词：玉米自交系，胚性愈伤组织，农杆菌，g u s 瞬时表达，g f p 瞬时表达 s e l e c t i o no fr e c i p i e n t sa n de s t a b l i s h i n go fm a i z ei n b r e dl i n e s t r a n s f o r m a t i o nb ya g r o b a c t e r i u m m e d i a t e d w a n gy u ( m a j o r ：c r o pg e n e t i c sa n db r e e d i n g ) d i r e c t e db yp r o f e s s o rp a ng u a n g t a n g t h eg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o no fp l a n t s b y t h e g r a m n e g a t i v e s o i lb a c t e r i u m a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n si st h eo n l yk n o w ne x a m p l eo fi n t e r - k i n g d o mg e n e t i c s e x c h a n g e t h i sp r o c e s si sc o n s i d e r e dp r e f e r a b l et og e n e t i ct r a n s f o r m a t i o nb ya r t i f i c i a l a p p r o a c h e s ( e g ，e l e c t r o p o r a t i o n ，m i c r o i n j e c t i o n ，o rb i o l i s t i cb o m b a r d m e n to fc e l l s 、v i t l l h i 曲l ya c c e l e r a t e dn a k e dd n am o l e c u l e s ) b e c a u s eo ft h ee a s ea n dl o wc o s to ft h e p r o c e d u r ea n db e c a u s eo ft h er e l a t i v e l yl o wc o m p l e x i t yo fi n t a c tt r a n s g e n e si n t e g r a t e d i n t ot h ep l a n tg e n o m e s oa g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o ni sam a j o r t e c h n i q u e f o rg e n e t i ce n g i n e e r i n go fp l a n t s t h ea b u n d a n ts t u d yo nt h eg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o no f m a i z ep r o v e dt h a te m b r y o n i cc a l l u si n d u c e df r o mi m m a t u r ee m b r y oi sp e r f e c tr e c i p i e n t g e n o t y p e i sc o n s i d e r e da sa n i m p o r t a n t f a c t o rt h a ta f f e c t st r a n s f o r m a t i o nv i a a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c t i o n sa l t h o u g hg r e a ta d v a n c e sh a v eb e e nm a d eo v e rt h ep a s t d e c a d et oi n c r e a s et h en u m b e ro fp l a n ts p e c i e st h a tc a nb et r a n s f o r m e da n dr e g e n e r a t e d u s i n ga g r o b a c t e r i u mb ya l t e r i n gt h eb a c t e r i u m ，c h a n g i n gc u l t u r ec o n d i t i o no fr e c i p i e n t ， o p t i m i z i n gs y s t e mo ft r a n s f o r m a t i o na n ds oo n ，m a n yi m p o r t a n ts p e c i e so ri n b r e dl i n e s r e m a i nh i g h l yr e c a l c i t r a n tt oa g r o b a c t e r i u m m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n i no u rr e s e a r c h ? t e nm a i z ei n b r e dl i n e s ( 6 0 1 0 、6 0 1 5 j6 0 3 4 、6 0 3 8 、6 0 5 0 、6 0 5 1 ， 6 0 5 8 、6 0 6 0 、6 0 6 9a n d6 0 7 7 ) h a v eb e e ns e l e c t e df r o ms e v e n t ym a i z ei n b r e dl i n e sb y i m m a t u r ee m b r y oc u l t u r i n g ，w h i c hh a dh i 出i n d u c t i o nf r e q u e n c ya n dc l o n ea b i l i t yo f e m b r y o n i cc a l l u s ，c o u l db es u b c u l t u r e di nal o n gt i m ea n dc o u l do b t a i np l a n tr e g e n e r a t i o n t h ef r e q u e n c yo f d i f f e r e n t i a t i o no f i n b r e dl i n e s6 0 1 0 、6 0 6 0 、6 0 3 8 、6 0 5 1a n d6 0 1 5w a s h i g h e rt h a nt h a to f t h eo t h e r s 。t h e r ew e r et h i r t e e ni n b r e dl i n e s ( 6 0 0 2 、6 0 0 5 、6 0 2 2 ，6 0 2 4 7 6 0 2 9 、6 0 4 3 、6 0 4 8 、6 0 6 1 、6 0 7 0 、6 0 7 1 、6 0 7 4 、6 0 7 8a n d6 0 8 1 、t h a tc o u l d n t i n d u c e d e m b r y o n i cc a l l u si ns e v e n t yi n b r e dl i n e s s oi tc o u l db ep r o v e dt h a tg e n o t y p ei sak e y f a c t o rt h a td e t e r m i n e sp r o d u c t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o no f e m b r y o n i cc a l l u s i no r d e rt os e l e c ts u s c e p t i b l e - i n b r e dl i n e st oa g r o b a c t e r i u mt u m e f a c t i o na n ds t u d y t h es u s c e p t i b i l i t yo fd i f f e r e n tg e n o t y p e si nm a i z et oa g r o b a c t e r i u mt u m e f a c t i o n ，t h i s e x p e r i m e n tu s e da g r o b a c t e r i u mt u m e f a c t i o n sc 5 8c o n t a i n i n gg u sr e p o r t e rg e n ea n d g v 3 3 0 1c o n t a i n i n gg f pr e p o r t e rg e n et ot r a n s f o r me m b r y o n i cc a l l u so ft h et e nm a i z e i n b r e dl i n e s t h er e s u l t so fg u st r a n s i e n te x p r e s s i o ns h o w e dt h a tt h e r es i g n i f i c a n t l y d i f f e r e di nt h e s u s c e p t i b i l i t y o fd i f f e r e n t g e n o t y p e s i nm a i z et o a g r o b a c t e r i u m t u m e f a c t i o n s ，t e ng e n o t y p e se x c e p ti n b r e dl i n e s6 0 3 4a n d6 0 3 8 w e r es u s c e p t i b l et o a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c t i o n s c 5 8 t h ed e t e c t i o no fg f pt r a n s i e n t e x p r e s s i o nb y f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p es h o w e dt h a tt h et e ng e n o t y p e se x c e p ti n b r e dl i n e s6 0 3 4 、 6 0 3 8 、6 0 5 0a n d6 0 1 0c o u l dd e t e c tg f pt r a n s i e n te x p r e s s i o n s oi n b r e dl i n e s6 0 5 1 、6 0 1 5 、 6 0 6 9 、6 0 5 8 和6 0 7 7w e r es u s c e p t i b l et oa g r o b a c t e r i u mt u m e f a c t i o n sg v 3 3 0 1 s o m ef a c t o r s i n f l u e n c i n g m a i z et r a n s f o r m a t i o nm e d i a t e db ya g r o b a c t e r i u m t u m e f a c t i o n sh a v eb e e no p t i m i z e db yg u st r a n s i e n te x p r e s s i o n ，i n c l u d i n gh i g h o s m o t i c t r e a t m e n t ，v a c u u mi n f i l t r a t i o n ，a s ，l e n g t ho f t i m eo fi n f e c t i o na n dc o c u l t u r e i ti sf o u n d i no u re x p e r i m e n t st h a to s m o t i ct r e a t m e n tf o rt a r g e tt i s s u ec o u l de n h a n c eg u sg e n e t r a n s i e n te x p r e s s i o ns i g n i f i c a n t l y , b u te x c e s st r e a t m e n tw o u l da f f e c to nf r e q u e n c yo f d i f f e r e n t i a t i o n ，s ow em u s tf i n do u tp r i m ec o n c e n t r a t i o no fm a n n i t o lt r e a t m e n t a c c o r d i n g t og e n o t y p eo f r e c i p i e n t f u r t h e r m o r e ，i nt h ep r o c e s so f a g r o b a c t e r i u mi n f e c t i o n ，v a c u u m i n f i l t r a t i o na t6 0 m p af o r1 0 m i nm a d eg u sg e n et r a n s i e n te x p r e s s i o no f i n b r e dl i n e6 0 5 1 i n c r e a s e df r o m4 0 8 t o7 5 7 a n da d d i n gl o o p ma sb yv a c u u mi n f i l t r a t i o nw a s m o r e e f f i c i e n to ni m p r o v i n gg u s g e n et r a n s i e n te x p r e s s i o nt h a nw i t h o u tv a c u u mi n f i l t r a t i o n c o n s i d e r i n ga t u m e f a c t i o n sc o n t a m i n a t i o nf o rr e c i p i e n ta n dt r a n s f o r m a t i o ne f f i c i e n c y , 3 d a y so fc o c u l t i v a t i o ni so p t i m a lf o rt r a n s f o r m a t i o n k e y w o r d s ：m a i z ei n b r e dl i n e s ，a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ，e m b r y o n i cc a l l u s ，g f p t r a n s i e n te x p r e s s i o n ，g u sg e n et r a n s i e n te x p r e s s i o n 6 论文独创性声明 9 5 9 0 0 6 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得 的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其 他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它 教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：王极 矽占年6 月“闩 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可 以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名：王钲 导师签名 os 年6 其z 6b 泗6 年6 窍比r 1 文献综述 1 1 农杆菌介导的遗传转化 植物遗传转化的研究起始于2 0 世纪7 0 年代末期，至1 9 8 3 年首例g m c ( 转基因作 物，g e n e t i c a l l ym o d i f i e dc r o p s ) 问世以来，目前已有3 0 多个国家3 0 0 0 多例转基因 植物已进入或完成田间试验阶段【。2 1 。在众多的转基因植物中，8 0 d a l 是由农杆菌 介导转化的双子叶植物3 ，4 1 。长期以来，禾本科植物尤其是重要的粮食作物如小麦、 水稻、玉米一直被排斥在农杆菌宿主范围外【5 】，直到上世纪9 0 年代以后，由农杆菌 介导转化这三大粮食作物爿逐步取得成功，农杆菌在三大禾本科作物上转化成功的3 个典型实验分别为1 9 9 4 年h i e i 6 1 对水稻、和1 9 9 6 年i s h i d a 7 1 对玉米和1 9 9 7 年c h e n g 8 】 对小麦的转化，1 9 9 9 年黄璐等在国内首次报道农杆菌转化玉米杂交种成功【9 】，2 0 0 1 年张荣等首次将农杆菌转化玉米的基因型拓宽到常规自交系综3 、p9 - 1 0 ，并获得可 育植株1 0 1 。 1 1 1 农杆菌介导的玉米遗传转化发展 玉米作为世界第三大粮食作物和重要的饲料作物，也是现代食品工业、医药工业 和化学工业的重要原料，它的遗传转化研究一直受到各国科学家的重视。1 9 8 7 年 g r i m s l e y 等l | 1 1 通过农杆菌将玉米条纹病毒导入玉米幼苗，第一次证实农杆菌能够侵染 玉米。自1 9 8 8 年r h o d e s 等1 2 1 首次获得玉米转基因完整植株以来，玉米遗传转化技术 得到了不断的发展，转基因玉米业已步入了商品化生产的领域。1 9 9 1 年g o u l d 等”】 用g u s 报告基因和n p t i i 基因通过农杆菌介导法转化玉米的芽尖，得到的再生植株及 其子一代基因组中都带有标记基因，从而为建立高效的玉米遗传转化体系奠定了基 础。1 9 9 6 年，i s h i d a 等1 4 1 建立了一套农杆菌介导的高效转化体系，通过对菌株、菌液 浓度、幼胚基因型等各种因素的优化，使玉米的转化效率达到了3 0 ，这是遗传转化 过程中的一个里程碑。随后，l u p o t t o 和国内的黄璐等也相继成功地实现了农杆菌介 导的玉米遗传转化陋1 6 1 。 1 1 2 农杆菌介导法的优点 植物遗传转化经过2 0 多年的发展，产生了多种多样的外源基因转化技术，包括农 杆菌介导法、基因枪法、聚乙二醇( p e g ) 法、脂质体法、超声波法、激光打孑l 法、 电激法、显微注射法、炭化硅纤维法、花粉管通道法等等。与其它转化方法相比，农 杆菌介导法具有许多明显的优点。 ( 1 ) 该转化系统是利用天然的转化载体系统，转化频率高，且转化效果好。 ( 2 ) 在所有的转化系统中，农杆菌t i 质粒转化系统机理研究的最清楚，方法最成 熟、应用也最广泛。 ( 3 ) t i 质粒的t d n a 区可以容纳相当大的d n a 片段插入，目前己把长达5 0 k b 的异 源d n a 序列通过t d n a 完整地转移到植物细胞中。 ( 4 ) t d n a 上含有引导d n a 转移和整合的序列，以及能够被高等植物细胞转录系 统识别的功能启动子和转录信号，使插入到t d n a 区的外源基因能够随同t d n a 一道 在植物细胞中表达。 ( 5 ) 农杆菌t i 质粒转化系统转化的外源基因以单拷贝为多数，遗传稳定性好，且 多数符合盂德尔遗传规律。 ( 6 ) 农杆菌介导的转化方式和筛选具有明显的简易性。 1 1 3 农杆菌介导的遗传转化原理 目前，在玉米遗传转化中应用的主要是根癌农杆菌，其介导的转化过程主要包括： ( 1 ) 细菌在植物敏感细胞上吸附；( 2 ) 农杆菌中的t i 质粒上的r 区基因被激活； ( 3 ) t - d n a 切割和t - d n a 复合物形成；( 4 ) t - d n a 复合物由农杆菌进入植物细胞： ( 5 ) t - d n a 以单或多拷贝随机整合到植物染色体上并且进行表达7 j 。 t i 质粒( 包括i 己i 质粒) 上有一段转移d n a ( t r a n f e rd n a ，又称t - d n a ) ，在农杆菌 侵染植物时，这段d n a 可以插入到植物基因组中，使其携带的基因在植物中得以表 达。由于t - d n a 能够进行高频率的转移，而且t i 质粒和m 质粒上可插入大到5 0 k b 的外源基因。因此，t i 质粒和刚质粒就成为植物基因转化的理想载体系统。 t i 质粒( t u m o r i n d u c i n g ) 是约2 0 0 k b 的环状质粒，包括毒性区( v i r 区) 、接合转移区 ( c o n 区) 、复制起始区( o r i 区) 和t - d n a 区4 个部分。t - d n a 区两个边界为2 4 b p 重复 序列，是t - d n a 加工和整合的重要标记。这两个重复序列间的任何基因都可被t - d n a 转入植物基因组中，其中v i r 区与t - d n a 区在转化中尤为重要。v i r 区含有v i r a j 等至少1 0 个操纵子，决定了t - d n a 的加工和转移过程 1 8 l 。v i r a 是一种细胞膜内蛋 白，可作为受体蛋白接受损伤植物细胞分泌物的诱导，自身磷酸化后进一步磷酸化激 活v i r g 蛋白；后者是一种d n a 转录活化因子，被激活后可以特异性结合到其它v i r 基因启动子区上游的v i r b o x ，启动这些基因的转录。所以，农杆菌侵染玉米的能力主 要是由r a 位点决定的，其中，v i r d 基因产物对t - d n a 进行剪切，产生t - d n a 单 链，然后类似于细菌结合转移将t - d n a 与v i r d 2 组成的复合物转入细胞【l 。在那里 与许多v i r e 2 蛋白分子( 为d n a 单链结合蛋白) 相结合，形成t 链复合物( t - c o m p l e x ) 【2 0 引i 。h a n s e n 等证明在v i r e 2 蛋白存在时，能使玉米转化效率提高2 倍2 2 1 。 1 2 植物基因转化受体系统的建立 建立良好的受体系统是玉米转基因技术的一个重要环节，关系到能否提供适宜转 化的受体材料以及转化后的细胞能否再生为正常植株等问题，因而在很大程度上对转 基因的成败及转化效率起决定性作用。良好的基因受体系统应满足以下条件：( 1 ) 高 效稳定的再生能力；( 2 ) 受体材料要有较好的遗传稳定性，尽量不发生体细胞变异； ( 3 ) 具有稳定的外植体来源；( 4 ) 对选择性抗生素敏感；( 5 ) 对农杆菌侵染有敏感性 但无过敏反应。 由于多数的禾本科植物不是农杆菌的天然寄主，因此，早期对禾本科的转化工作 主要是针对原生质体进行的。所采用的转化方法一般有p e g 法、电击法等。但是，原 生质体培养技术复杂、培养周期长、遗传稳定性差，且基因依赖性强，无法在有生产 价值的品种上应用，极大地限制了该转化体系的推广。大量实践表明，通过幼胚培养 诱导出的胚性愈伤组织可作为理想的受体系统 2 3 1 。现有的主要转化受体一般都要经过 产生愈伤组织再生完整植株的过程。愈伤组织容易获得，再生能力比较强，获得转化 体的周期比较短。在玉米上已经获得了稳定的转化体，如王国英等以玉米幼胚培养获 得的愈伤组织为受体导入b t 抗虫基因并获得再生植株【2 4 l ：杜娟等 2 5 】用玉米自交系 4 1 1 2 的未成熟胚诱导出的i i 型胚性愈伤组织为受体，通过基因枪轰击法将b a r 基因 转入玉米细胞，然后用g u s 基因检测，结果为阳性。 玉米胚性愈伤组织分三种类型：i 型、i i 型、型。i 型愈伤呈乳白色或绿色 结构致密，生长缓慢，不易长时间保持胚性；i i 型愈伤呈黄色或淡黄色，结构松散， 呈颗粒状，生长较快，能长时间保持胚性；i i i 型呈白色或灰色透明水渍状，松软无结 构，继代易褐化死亡。这三种愈伤可相互转化。如果用愈伤组织为转化受体，选择i i 型愈伤组织要比i 型愈伤组织更有利于获得转化体。但相对于i 型愈伤，i i 型愈伤对 基因型的依赖性更强。 众多的研究表明，玉米幼胚培养的诱导率和再分化数是受多因素控制的，供体植 株的基因型、生理状态、培养基组成和培养条件等都是重要的影响因素，其中基因型 2 5 1 是限制幼胚培养的主导因素。下面将对各类影响因素分别加以介绍。 1 2 1 基因型对幼胚培养效果的影响 关于基因型对幼胚培养效果的影响，仅少数研究者认为基因型影响不大或没有发 现基因型问的差异【2 6 2 7 1 ，但多数研究认为基因型是一个重要因素阻2 9 1 。郑锡州等曾报 道3 5 种基因型中，愈伤组织诱导率高者可达1 0 0 ( 如美国黄爆裂) ，低者仅为4 2 6 ( 如8 7 0 0 4 8 ) 。王常云 2 8 i 等对3 0 个小麦品种研究发现，基因型对愈伤组织形成的天 数影响较大，3 0 个材料中有1 0 个材料4 天即完成形成愈伤组织的过程，1 6 个材料需 要一周时间，4 个材料需要一周以上时间。k r a v c h e n k o 观察到玉米材料3 4 6 和 p i o n e e r 3 9 7 8 的再生能力较高，分别达到5 7 3 和3 5 2 3 。t o d o r o v a 等对不同基因型 玉米幼胚进行培养，发现a 6 1 9 表现出良好的再生能力，而a 3 4 4 的幼胚不能再生出完 整植株。黄璐等观察到普甜1 号和苏玉1 号的愈伤组织形成芽苗的频率高达7 8 3 3 和7 5 8 3 ，而糯玉米和掖单9 号仅为1 0 和8 3 3 。付凤玲 3 0 1 报道，玉米基因型间 愈伤组织诱导率差异大致呈“杂交种 自交系 远缘杂交后代”的趋势。这些结果均表 明了基因型对幼胚培养愈伤组织诱导率、愈伤组织形成的天数、再生能力、成芽率等 多个性状都起着关键性的作用，说明的确可能存在有基因在控制玉米幼胚培养这些性 状的形成阢3 2 + 3 3 1 。 国内外许多研究者对控制组培能力的基因进行了研究，普遍认为，胚性愈伤组织 的形成是受多基因控制的数量性状盼3 4 1 ，遗传效应复杂。夏燕莉【3 5 1 用2 1 个自交系及 其配制的杂交组合进行幼胚培养并利用数量遗传方法分析，结果表明，基因型是影响 玉米幼胚性状的重要因素，控制该性状的基因可能为核基因，且高诱导率和高绿苗再 分化数是可以通过杂交进行转移的。宋芸【3 6 1 用幼胚培养表现特别优良的骨干自交系 r 1 8 5 9 9 ( 红) 为亲本与另一个幼胚培养能力极差的自交系r 1 5 杂交，组配p l 、p 2 、 f l 、b l 、b 2 、r 等6 个世代并用数量遗传方法分析，结果表明，玉米幼胚培养性状中 胚愈率、克隆能力及再分化数的最适遗传模型为主基因+ 多基因混合遗传或主基因遗 传。因此，要组配优良玉米幼胚培养性状的杂交种必须要有优良玉米幼胚培养性状的 亲本；同时玉米幼胚培养性状的遗传变异受多基因修饰，应在充分考虑主基因效应的 基础上，应重视对多基因效应的利用，以培育具有最优玉米幼胚培养性状的种质材料。 1 2 2 培养基组成对幼胚培养过程的影响 玉米幼胚培养愈伤组织的诱导和植株再生还受到多种培养条件的影响。经过多年 的研究，人们已经初步筛选或改良形成了一些常用的培养基，适合玉米组织培养的基 本培养基主要有m 6 、n 6 、改良m s 、l s 、y u p e i 等。目前常用的基本培养基主要是 n 。和改良m s 3 7 3 9 1 ，二者的主要区别在于氮源的形式不同。母秋华等以甜玉米的幼 胚为外植体，接种在z h a n 9 1 4 、c j 7 、8 1 1 4 、m s 、n 6 培养基上，以q 、8 1 1 4 、z h a n 9 1 4 培养基上胚性愈伤组织的形成频率较高，分别为6 1 9 、5 9 2 、4 3 7 。a r m s t r o n g 等h o i 的实验结果还表明，在培养基中添加高浓度的脯氨酸有利于维持玉米愈伤组织的 胚性。 长期以来，人们对培养基中激素种类和浓度方面的研究较多。其中，2 , 4 一d ( 2 ，4 二氯苯氧乙酸) 是玉米中起主导作用的植物生长调节物质，是影响组织再分化的关键 因素。高浓度的2 , 4 一d ( 2 4 m g 1 ) 诱导外植体脱分化出愈伤组织，降低其浓度或不加 2 ，4 一d ，愈伤组织就能再分化成完整的胚结构，进而再分化成小植株。 1 2 3 幼胚大小对幼胚培养的影响 众多研究均证明，玉米幼胚的大小对幼胚培养效率影响巨大。曾有人认为取授粉 后1 5 天左右胚龄的未成熟胚效果较好，然而不同生长季节，胚发育时期差异较大， 如秋季玉米即使在3 0 天胚龄时胚也可能小到无法接种；同一生长季节、同一材料的 不同果穗间、同一果穗的不同部位之间，即使胚龄相同，但因授粉过程中人为因素、 外界自然因素以及基因型之间的差异等都可能导致个体差异的产生，胚的大小差异较 大，幼胚培养能力也就不同。因此，仅仅根据胚龄大小来决定接种时期，技术上很难 把握好准确尺度。有报道 2 6 】认为，最适接种期随基因型变化较大，每个材料都有其最 适宜接种的一天，过早则利于非胚性愈伤组织形成，过迟则容易导致直接成苗而不形 成愈伤组织。 不少研究者赞成以胚龄大小来确定幼胚接种的时间，也有报道【4 1 ，4 2 1 建议以胚的大 小为标准来判别最适接种期。胚过小难以脱分化出愈伤组织或脱分化所需时间较长， 胚过大则容易在形成愈伤组织前发生早熟萌发，一般认为直径为1 0 2 5 n u n 的胚可以 诱导出愈伤组织。 1 3 影响农杆菌转化玉米效率的因素 1 3 1 菌株和载体类型 由于农杆菌染色体基因的作用直接影响转移的效率，不同的农杆菌菌株有不同的 宿主范围，并有其特异侵染的最适宿主，不同类型的农杆菌菌株的毒力( 侵染力) 不 同。三类农杆菌菌株侵染力的排列顺序为：农杆菌琥珀碱型菌株( a 2 8 1 ) 胭脂碱型菌 株( c 5 8 ) 章鱼碱型菌株( l b a 4 4 0 4 ) 。目前已分离出大量的根癌农杆菌菌株，但是能有 效转化玉米的并不多。常用的菌株为l b a 4 4 0 4 ，常用的载体是p s b l 3 i 和p t o k 2 3 3 ，均 为超双元载体( s u p e rb i n a r yv e c t o r ) ，这些载体都带有a 2 8 1 中的v i r b 、v i c 基因。a 2 8 l 是对高等植物侵染力很强的菌株。这些超双元载体对转化玉米是非常有效的，h a n s e n 等【5 i 】用v i r g n 5 4 d 代替野生型v i r g 提高了玉米的转化效率。 将目的基因导入植物细胞中并使之稳定地整合和表达，需借助植物表达载体来实 现。为了提高表达载体的表达效率，人们对基因调控序列的研究不断深入。对表达载体 的研究主要集中于以下一些方面：( 1 ) 利用单子植物启动子。目前，在双子叶植物遗 传转化中广泛采用的高强度c a m v 3 5 s 启动子则对禾谷类作物并不适合。选用单子植物 启动子可在一定程度上克服表达效率低的问题。l a s t 在1 9 1 1 年构建了一种谷类细胞基 因表达的改进的启动子p e m u 。用单子叶植物小麦、玉米、水稻检测发现最高表达结构 p e m u g n 在所有的单子叶植物中比c a m v 3 5 s 启动子提高1 0 5 0 倍【4 3 】。已分离出几个适 合单子植物中外源基因高效表达的启动子，如水稻a c t l 基因启动子、玉米u b i l 基因启 动子m 4 6 1 等，它们在谷类作物转基因表达调控强度上远远高于c a m v 3 5 s 启动子。( 2 ) 启动子区加倍。一些研究表明，c a m v 3 5 s 启动区加倍可明显提高基因表达水平【4 ”，有 研究以小麦为材料检测了在不同启动元件调控下的g u s 基因瞬间表达情况，初步结果表 明，不同启动子串联后，也可促进外源基因的表达。( 3 ) 利用内含子( i n b o n ) 增加启动 子的表达效率。有研究证明，在启动子和报告基因之间插入单子叶植物基因的内含子可 提高基因在单子叶植物中的表达效率【4 ”。如c h e n g 等( 1 9 9 7 ) 幂1 j 用3 5 s 启动子和h s p 7 0 内 含子构建的农杆菌表达载体在小麦上得到了高达4 3 的转化频率【4 6 1 。t a n a k a 在水稻转 化中发现，加有菜豆催化内含子比未加内含子的g u s 基因活性高9 0 倍。 1 3 2 受体的基因型和生理状态 基因型是影响农杆菌转化效率的一个重要因素。不同植物对农杆菌的敏感程度不 同，同一种植物的不同品种对农杆菌的敏感性也不尽相同。通常认为，基因型的特异 性与细胞的生理状态如细胞受伤后的生理反映、细胞内源激素水平、细胞壁的结构等 有关。i s h i d a 等【4 8 1 发现不同基因型之间转化效率差异显著，最低为0 ，最高为3 0 。 基因型影响农杆菌对玉米的附着，许多试验证明大多数玉米基因型细胞表面缺乏可供 农杆菌识别并与之附着的位点，从而影响农杆菌对玉米的亲合性及转化效率【4 。 s c h l a p p i 等【5 0 】通过农杆菌对玉米幼胚亲和性的研究，证明感受态的细胞是农杆菌转化 所必需的，只有那些再生和整合能力强的感受态细胞才能得到转化植株。但大多数玉 米基因型缺乏感受态的细胞。许多实验h 8 5 0 1 表明，基因型a 1 8 8 是农杆菌转化的理想 受体。 不同来源、不同部位、不同发育状态的受体都会对农杆菌的侵染产生很大影响。 1 9 9 7 年v i l l e m o n t 研究指出，转化只发生在细胞分裂的一个较短时间内，即只有处于 细胞分裂s 期( d n a 合成期) 才具有被外源基因转化的能力。因此，细胞具有分裂 能力是转化的基本条件。一般发育早期的组织如分生组织、薄壁组织、维管束形成层 组织、胚等这些组织具有很强的分裂能力。当这些组织发生创伤或诱导时，则加速分 裂，即处于转化的敏感时期。因此，保持旺盛分生状态的细胞是农杆菌侵染玉米所必 需的，幼胚、茎尖分生组织等被证明是转化效率较高的受体。s c h l a p p i 和g o h a h u 等【5 。1 研究发现不同基因型、不同发育时期的玉米幼胚对农杆菌侵染的感受性存在着差别， 幼胚中分生组织尚未分化时，农杆菌不能侵染；当幼胚开始分化第1 2 小叶时，侵染 率为7 3 2 ；授粉后1 4 1 6 d 的幼胚，侵染率为3 2 7 3 。i s h i d a 等5 2 1 用农杆菌 转染玉米的幼胚和幼胚诱导的愈伤组织，发现幼胚的转化率更高。h i e 研究用农杆菌 侵染水稻的茎尖、幼胚、悬浮培养细胞、成熟胚诱导的愈伤组织，发现愈伤组织转化 率最高。所有的这些差异表明植物细胞对农杆菌的侵染存在一个感受态，它与转化频 率直接相关。 1 3 3 侵染液浓度和侵染时间 表1 不同的作物的侵染时间和菌液浓度 t a b l e1l e n g t ho ft i m ef o ri n f e c t i o na n dc o n c e n t r m i o no f a t u m e f a c i e n s 侵染时间和菌液浓度因转化的物种和外植体的不同而不同。侵染时间过短、侵染 浓度过低，则转化率较低；若侵染时间过长、菌液浓度过高则又会引起后期培养中的 农杆菌污染。一般侵染时间为5 3 0 m i n ，菌液浓度o d 6 0 0 为0 3 1 5 。 13 4 共培养的条件 共培养的时间、温度、培养基成分、光照等共培养条件也是影响转化效率的因素。 共培养时间对高效转化很重要，培养时间过短，t - d n a 转移过程不能完成；培养时 间过长，生长旺盛的农杆菌会对受体材料造成毒害。单子叶的共培养时间一般为2 3 天。共培养时的温度一般以2 8 c 暗培养居多，r a i n i e r 5 3 1 报道弱光更有利于水