（作物遗传育种专业论文）Pima9053细菌人工染色体（BAC）文库构建及抗黄萎病相关基因筛选.pdf

摘要 棉花是当今人类栽培的主要作物之一和天然纤维的首要来源。目前，四倍体的 陆地棉( g d j 胪f “m 砌百“m ml ) 和海岛棉( g d s s 糟f “聊6 口，6 口如n s pl ) 是世界各国的主 要栽培种，它们分别占世界棉花总产量的9 0 和8 。海岛棉纤维细长、强力高、 抗病性较强，是品质最优的栽培种。因此构建海岛棉品种的b a c 文库，利用国内 外已有分子标记探针钓取和分析含有重要性状的b a c 克隆，是发掘分子标记、克 隆纤维发育相关基因和抗病基因、深入开展棉花功能和比较基因组学研究的基础和 关键。对于显著提高我国棉花遗传育种研究水平具有重要意义和应用前景。 本研究以优质抗病海岛棉品种p i m a 9 0 5 3 为材料，在本课题组b a c 文库构建方 法的基础上，进行了一些改进，补充构建了该品种的b a c 文库，获得了7 7 ，5 6 8 个 克隆，使得该文库的克隆总数达到1 6 7 ，4 2 4 个。 随机挑取2 2 4 个克隆进行插入片段大小检测，其平均片段大小介于5 0 k b 2 6 0 k b 之间，平均插入片段为1 3 0 k b ，9 4 的插入片段在l o o k b 以上，空载率小于4 ；该 基因组文库中叶绿体基因的污染率低于o 2 ；该文库覆盖海岛棉基因组的7 2 倍； s o u t h e m 杂交结果表明所构建的p i m a 9 0 5 3b a c 文库具有较高的忠实度；随机挑取 7 个克隆进行继代培养1 0 0 代，提取质粒酶切检测表明不存在片段丢失现象，表明 该文库的克隆在大肠杆菌中能够稳定保存；用单拷贝的分子标记乃3 8 和多拷贝的 分子标记m 凇作为探针对该文库进行了部分筛选，分别得到2 个和4 0 个阳性克隆。 这些结果表明该文库具有较高的质量，为开展棉花重要性状基因的图位克隆、棉花 物理作图、基因组测序和s s r 引物开发等应用提供了重要基因组资源。 以黄萎病菌诱导下差异表达的棉花抗病相关基因片段p r 8 为探针，利用杂交方 法，对所构建的优质、抗病海岛棉品种p i m a 9 0 5 3b a c 文库进行了筛选。从3 0 ，3 3 6 个b a c 克隆中筛选到含有p r 8 基因片段的4 个阳性克隆，分别为1 2 7 k 1 3 、1 2 8 d 1 4 、 1 6 9 j 3 和1 7 8 c 5 。用“3 ai 对其中的1 6 9 j 3 克隆进行酶切，回收2 k b 4 k b 的d n a 片段并连接到载体p u c “8 肋聊hi b a p 上，构建了含有该基因片段的亚克隆文库， 该文库共含有4 ，2 2 4 个克隆，平均插入片段为2 k b 。通过对亚克隆的测序分析初步得 到了一条与转运蛋白相关的基因片段，该片段长2 3 k b ，含有五个开放阅读框。通过 比对分析发现该基因片段与水、冷害、茎点霉属胁迫下表达的基因有较高的同源性， 该片段可能在棉花抗病反应的信号传导中起作用。该基因片段的获得为得到抗黄萎 病相关基因片段p r 8 的完整序列、开发与抗黄萎病相关的s s r 标记提供了重要的基 础。 关键词：棉花；p i m a 9 0 5 3 ；b a c 文库：纤维品质；黄萎病 c o n s t r u c t i o no fab a c t e r i a la r t i f i c i a ic h m m o s o m e ( b a c ) l i b r a r yo fp i m a 9 0 - 5 3a n d i d e n t i n c a t i o no fb a cc l o e sr e l a t e dw i t hv b n i c i n i u mw i i tr e s i s t a n c eg e n e a u t h o r ：w 锄gw e n - s h e n g m a j o r ：c r o pg e n e t i c sa n dbr e l 。d i n g s u p e r v j s o r ：p r o m az h i y i n g p m z h gg u i y i n p r o w 抽gx i n f e n a b s t r a c t c 0 t t o ni so n eo ft l l em a i nc r o p sa n ds o l l r c eo fm en a t u r a l 舳e r s a tp r e s e n t ，u p i a n d c o t t o na n ds e ai s l a n dc o t t o no ft l l et 唧l o i d ya r em a i nc u l t i v a t a b l es p e d e sa l lo v e rt h e w o r l d t h e ya c c o l l l l tf o r9 0 锄d8 o f t l l ec o t t o nt o t a ly i e l di nt h ew o r l d ，r e s p e c t i v e l y t h es e ai s l a l l dc o 扎o n1 1 a sg o o d 助e rq u a l 蚵锄dh j 庐v e r t i c i l l i 啪w i l tr e s i s t a i l c e s ow e c o n s 咖c t e dal i b 删了o f 吐l ec l l l t i v a rp i m a 9 0 一5 3w h i c hb e l o n g e dt os e ai s l a n dc o 肋n i ti s i m p o r t 卸tf o ru st oc o n s t m c ts e ai s l a i l dc o t c o nb a cl i b r a r yw i 也g o o d 丘b e rq u a l i t ya n d h i g hv e n i c i l l i 啪埘l tr e s i s t a i l c e b a cc l o n c sw h i c hh a v ei m p o r t a mc h a r a c t e r sc a nb e f l s h e da n da n a l y z e du t i l i z i n gm 0 1 e c u l a rm a r k c rp r o b e s ，a i l d 也e nn n dn e wm 0 1 e c u l a r m a r k e r s ，i s o l a t e 也ei m p o n a m tg e n e s 锄dl a u n c hf u n c t i o n a la n dc o m p a r a t i v eg e n o m e r e s e a r c ht h o r o u 曲ly it h i s 】i b 蹦吖w i l lp l a ya i li m p o r t a l l tr o l ei ni m p r o v i n gt h el e v e lo f b r e e d i n gj nc o 拄o n t h er e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： u s i n gt h er e s i s t a n ts e ai s l 衄dc o t t o nv a r 主e t yp i m a 9 0 5 3a sm em a t e r i a l ，i nm e f o u n d a t i o n0 fo i i r 彤o u po fc o n s 讯l c t i n gb a c1 i b r a r y ，也ef e s e a r c hm a d es o m e i m p r o v e m e m s ，c o n s m l c t e db a cl i b r a r yo ft h i sv a r i e t yc o m p l e m e n t 撕l y 姐dg o t7 7 ，5 6 8 c l o n e s f i n a 【l y 也ec l o n e so f 吐屹l i b m r yw e r c1 6 7 ，4 2 4 1 1 1 s e r ts i z e so f2 2 4c i o n e s 眦c h e c k e d 1 1 1 e yv 撕e db e t w e e n5 0a n d2 6 0 k b ，、v i t l la c o m b i n e da v e m g eo f1 3 0 k b a b o u t9 4 0 o ft 王l ec l o n e sh a di n s e r t so v e r1 0 0 k ba i l dt 1 1 e e m p t yc l o n e sa c c o u n t e df o rk s sm a n4 o c o n t 锄i n a t i o no fm eg e n o m i c1 i b r a r y 、i 1 c m o r o p i a s tc l o n e s w a sv e r yl o w ( 0 2 ) t h e l i b r a r yr e p r e s e n t s 7 2 - f o l d g e n o m e e q u i v a l e n t s r a n d o m l ys e l o c t e db a cc l o n e sw e r eb l o t t e da n dh y b r i d i z e dw i t hap r o b e f 如mm et o t a lg e n o m i cd n ao fp i m a 9 0 5 3 r e s u l t so fs o u t h e mb l o t t i n gi n d i c a t e dm a ta l l o ft h eb a ci n s e r t s 舶mm eb a cc l o n e sg a v eh y b r i d i z a l i o ns i g n a l s t 0d e t e m i n et h e s t a b i l i t yo fb a cc l o n e si nh o s te 矗s 住西n ，d h l 0 b ，7r a n d o m l ys e l e c t e db a cc l o n e s w e r ea 1 1 a l y z e da tg e n e 删0 n0t o1 0 0 n 0v i s i b l ec h a n g c sw e r eo b s e r v e d t w op r o b e s ， i n c l u d i n g 乃3 8 ( ap u t a t i v eg 6 加日如珊p 舶e rp r o t e mg e n e ) a n d 吖糟t r a n s c 邱t i o nf 缸t o r ( i n v o l v e di nc o t t o nf i b e ri m 矗a t i o n ) ，w e r ec h o s e n 够p r o b e sf o rt l l e1 i b r a r ys c r e e n i n g t w o p o s i t j v eb a cc l o n c sw e r ei s o l a t c df o r 乃3 8a n df o n yf o r 坳谬行嘞4 3 ，7 7 6b a cc l o n e s s c r e e n e d t h ea b o v er c s u l 乜s h o w e dt h a tt h i sb a cl i b r a r yi so fh j g hq u a l i t ya n di s i m p o n a i l tg e n o m er e s o u r c ef o rm a p b a s e dc l o n i n go fi m p o n 。咀tg e n e s ，c o t t o np h y s i c a l m 印p i n 舀g e n o m es e q u e n c i n ga n dd e v e l o p m e n to fs s rp r i m e l t h ef r a g m e mp r 8r e l 砷甜w i mv c r t i c i l l i u mw i l tr e s i s t a l l c ew a su s e da sap m b et 0 s c r e e nb a c t e r i a la r t i f i c i a jc h m m o s o m e ( b a c ) l i 呐o fas e ai s l a n dc o t t o n ，p i m a 9 0 5 3 f o u rp o s i t i v eb a cc l o n e s ，1 2 7 k 1 3 ，1 2 8 d 1 4 ，1 6 9 j 3a n dl7 8 c 5 ，w e r cd e t e c t e d 肋m 3 0 ，3 3 6b a cc l o n e s t h eb a cc l o n c ，1 6 9 j 3 ，w a sd i g e s t e dw i t h 砌甜3 ai a f i e rd i g e s t i o n ， 2 k b 4 k bf h g m e n t sw e r ec o l l e c t e da n d1 i g a t e dw i t hp u c l18 上k m hi b a pt oc o n s t m c ta s u b c l o n el i b r a r y n l el i b r a r yc o n t a i n e d4 ，2 2 4c l o n e s ，a n di n s e r t sd n a m g e d 厅o m1k bt o 3 k b ，a v c r a g e d2 k b t w e n t y f b l l rp o s i t i v es u b c l o n e sw e r ei s o l a t e da n ds e q u e n c e d ，w e o b t a i n e daf a g m e n tr e l a t e d 、i t l lp r o t e i nt r 趾s p o r t e r t l l i s 丹a g m e n th a s2 317b a s ep a i r s w i t hf i v eo p e nr e a d 泣g 丹锄e s b l a s t a l l a l y s i ss h o w e d 出a tm i s 丘鼍g m e n th 豁h i 曲 h o m o l o g o u sw i mg e n e si n d u c e db y 、t e r ，c o l da r l dp h o m a t h i s 矗嘲g m e n tm a yw o r ki n m es j g n a lc o n d u c t i o ni nc o 扎o nr e s i s t a n c er e s p o n s e nl a i e daf o u n 妇i o no fo b t a i n i n gm e c o m p l e t es e q u c n c eo fp r 8l i n k e dw i t 量lt h eg e n eo fv e n i c i l l i 哪、v i l tr e s i s t a n c ea 1 1 d d e v e l o p i n gs s r m a r k e r sl i n k e dw i t h 也er e s i s t a l l tg e n c k e yw o r d s ：c o t t o n ；p i m a 9 0 - 5 3 ；b a c t e r i a ia r t i f i c i a lc h r o m o s o m e ( b a c ) ；f i b e rq u a l i t y ； v e r t i c i l l i 啪w i l l 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑韭盎些盘堂或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 圣交耋 签字日期：沙缉f 月切日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑皇垦盔些盘堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权塑丝盛些盘茔可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名； 五文蕾 签字日期：珈锌，月p 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 翩魏聊 签字日期：三一年占月二矿日 电话： 邮编： p i m a 9 0 5 3 细菌人工染色体( b a c ) 文库构建及抗黄萎病相关基因筛选 1 引言 随着基因组学时代的到来，克隆并利用各种生物的重要基因、研究这些基因的 结构、功能和进化己成为遗传学领域的热点之一。图位克隆( m a p - b a s e dc l o n i n g ) 已逐 渐成为分离表达产物和调控均未知基因的重要方法之一。用这一方法分离基因有两 个重要环节：一是寻找与目标基因紧密连锁的分子标记；二是构建高质量、容易操 作的大片段基因组文库，如c 、b a c 文库。自从1 9 9 2 年图位克隆技术首先在 拟南芥上成功分离了a b j 3 基因【2 j 和同d s 基因i j 】以来，随着各种植物分子标记图谱 的相继建立，目前通过该技术已经成功克隆了二十多个植物体基因1 4 1 ”。d n a 克隆 技术是分予生物学研究中重要的技术手段之一。由于真核生物基因组十分庞大，因 此对于真核基因组的研究，必须有一系列能容纳大片段基因组d n a 的载体【i ”。大 片段基因组文库如c o s 觚d 文库【1 3 、y a c 文库h 】、b a c 文库等的发展和脉冲场电 泳技术的发展【16 】为复杂基因组的分化组成、基因的表达与调控、染色体区段的分子 物理作图( p h y s i c a lm 印p i n g ) 等领域的研究和重要基因的克隆提供了技术平台。 将外源d n a 克隆到细菌人工染色体( b a c t e r i a la 币f i c i a lc h r o m o s o m e 简称b a c ) 中为高等生物的基因组分析等现代遗传学研究提供了新的方法。含有大片段基因组 d n a 的b a c 文库是基因图位克隆( p o s i t i o n a lc l o n i n g ) 、物理图谱构建( p h y s i c a l m 印p i n g ) 和基因组测序( g e n o m es e q u e n c i n g ) 的重要工具。利用b a c 文库可以促进基 因组学的研究 】。如：利用b a c 进行d n a 测序和作为p c r 扩增的模板己经导 致产生了b a c 末端测序技术( b a c e n ds e q u e n c i n 曲、基于s t s 的作图技术( s t s _ b a s e d m a p p i n g ) ，并为快速寻找和准确定位表型重要基因的基因组区域提供了有效工具； 利用b a c 作为大片段d n a 克隆的载体，与高效的d n a 指纹技术、跨叠群集结 技术( c o n t i ga s s e m b l y ) 、b a c 末端测序技术、s t s 作图技术结合，已经使得研究者们 在位于大基因组中的d n a 分子标记之间架起了桥梁，从而使得许多有用的基因被 克隆和分离出来；许多进行遗传作图的d n a 探针均可被定位于b a c 克隆中，为 将遗传图直接叠印到物理图上提供了工具，从而能够加速对控制特殊表现型基因的 克隆；b a c 克隆片段已被成功地作为标记探针，用于荧光原位杂交( f i s h ) ，使得 分子或物理图谱直接叠印到染色体框架上，为染色体结构、d n a 序列、基因重组提 供重要信息。b a c 载体系统不仅保持了y a c 系统能容纳较大片段的优点，而且操 作相对简单，因此它在基因组学研究中具有重要的价值。虽然b a c 系统可以容纳 的最大插入片段可达5 0 0 k b 左右，但其片段大小多在8 0 3 0 0 k b 之间i i “”。b a c 系 统具有y a c 系统无法比拟的优点，如嵌合体比例低并很少发生插入重排口。”j 、插 入片段易于分离和快速繁殖等【2 s _ 3 ”。因此，它已逐步取代了y a c 系统，在物理作 图、基因图位克隆、基因结构和调控等研究中发挥着重要作用【3 ”。经过近十年的 发展，目前己经在几十种植物、动物【3 8 】及线粒体等细胞器【3 9 l 中构建了b a c 文库。 总之，含有大片段d n a 的细菌人工染色体( b a c ) 文库是开展基因图位克隆【l j 、物理 作图【4 0 m 】、基因组测序【4 3 1 和s s r 引物开发的重要基因组资源。利用国内外已有 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 分子标记探针钓取和分析含有重要性状的b a c 克隆，是发掘分子标记、克隆重要 基因、深入开展棉花功能和比较基因组学研究的基础和关键f 4 ”。 棉花是当今人类栽培的主要作物之一和天然纤维的首要来源，也是世界第二大 食用油来源植物，丰富的种、品种类别，使得育种家有潜力搡作和开拓利用棉花数 以千计的基因，进而使其为人类生活发挥更为重要的作用。我国是世界上棉花生产 大国，棉花对国民经济、人民生活和国防建设至关重要。常年种植面积在8 0 0 0 万亩 左右，是我国3 亿棉农和l 千多万纺织工人及相关行业人员的主要经济来源。目前， 四倍体的陆地棉和海岛棉是世界各国的主要栽培种，它们分别占世界棉花总产量的 9 0 和8 。本研究以海岛棉品种p i m 9 0 5 3 为材料构建b a c 文库，是因为海岛棉 品种棉纤维细长、强力高、抗病性较强、是品质最优的栽培种【4 6 】。 目前，纤维品质差和黄萎瘸是制约我国棉花生产的主要因素【4 7 】。随着纺织工业 快速发展和人民生活水平的不断提高，对棉纤维品质的要求愈来愈高。我国棉花的 高产抗病育种在世界产棉国中位于先进行列。近2 0 年来育成的品种产量略高于美国 但不显著，纤维内在品质则明显不及美国等其它产棉国。据统计，目前我国生产上 种植的棉花品种比强度平均为2 1 也2 趴e x ( 1 c c 校准) ，与美国同期品种纤维强度相 比相差l 2 9 t e x l 4 ”。我国棉花纤维品质偏差，比强度也比较低，棉纤维品质问题已 成为制约我国棉花产业可持续发展的主要障碍。此外我国棉花生产一直受到棉花黄 萎病的制约。据1 9 9 3 年调查估测，全国黄萎病发病面积达2 7 0 余万公顷，损失皮棉 l 亿公斤一j ；1 9 9 5 年我国北方棉田黄萎病大发生，损失皮棉7 ，5 0 0 万公斤左右【5 0 】； 2 0 0 2 年发病面积已超过3 0 0 万公耐5 1 l ，2 0 0 3 年北方棉区普遍减产，其中主要原因 之一是黄萎病严重危害。如何防治棉花黄萎病是我国棉花生产上亟待解决的问题。 因此构建海岛棉品种的b a c 文库，利用国内外已有分子标记探针钓取和分析含有 重要性状的b a c 克隆，是发掘分子标记、克隆纤维发育相关基因和抗病基因、深 入开展棉花功能基因组学和比较基因组学研究的基础和关键1 52 1 。对于显著提高我国 棉花遗传育种研究水平具有重要意义和应用前景。 自2 0 世纪8 0 年代以来，科学家们通过各种分子生物学手段分离了大量的基因， 以期了解生物的生命本质，进而可以更好地使生物为人类所利用。拟南芥、水稻及 人类等一些生物基因组测序的初步完成极大的推进了基因的分离，使人类对生命现 象有了进一步的认识。在基因组测序以及基因的克隆中，基因组文库提供了一个技 术的平台，在结构基因组学、功能基因组学、比较基因组学的研究中基因组文库为 其提供了基础资源。与此同时，对非模式生物来说，分离一些控制重要性状的特异 基因已成为当前科学家们研究的热点。尤其近十年来，随着基因分离技术的不断发 展，许多重要基因已被分离，如一系列的抗病基因、亚油酸去饱和基因和脱落酸不 敏感基因等，这些基因的分离极大地推动了植物分子生物学领域中的基因调控、蛋 白质结构及信息传导等研究的迅速发展。早期分离的基因主要集中在产物已知的基 因上，如植物储藏蛋白基因等。分离的基因依赖于基因产生的可以大量分离的产物。 然而对绝大多数基因来说，由于不能事先了解其最终产物，故无法用这种方法分离 基因。但随着各种生物高密度遗传图谱的构建，大片段d n a 克隆系统的建立以及 p i r n a 9 0 - 5 3 细菌人工染色体( b a c ) 文库构建及抗黄萎病相关基因筛选 物理图谱的发展，克隆任何一个基因都是有可能的。 国内外对棉花的遗传学研究已有不少基础积累，在一些重要形态性状和经济性 状的遗传和定位、分子标记、遗传图谱构建等方面取得了显著研究进展。如南京农 业大学利用我国培育的高强纤维种质系7 2 3 5 ，筛选出与高强纤维基因紧密连锁的 s s r 标记口”j ；还筛选出与棉花雄性不育恢复基因r 厂紧密连锁的r a p d 和s s r 标 记| 5 “；华中农业大学利用鄂荆1 和泗棉3 号抗虫棉的f 2 群体构建了r f l p 连锁图谱 p ；河北农业大学、华中农业大学、河南省农业科学院、中国农业科学院植保所还 开展了棉花抗黄萎病基因的分子标记研究【5 9 】。美国r e i j l i s c h 、s h a r p l e y 利用不同群 体分别构建了棉花的r f l p 连锁图谱【5 1 1 。因此利用现有的分子标记从棉花基因组 文库中钓取一些控制重要性状的特异基因是可行的。 选育具有优良纤维品质的抗病棉花品种无疑是一种经济、有效、环保的措施， 而培育具优良纤维品质的抗病品种首先要寻找到优良纤维品质的基因和高抗黄萎病 的基因。最近人们已认识到分子图谱对育种和基因克隆的意义，采用各种标记定位 这些与优良纤维品质相关和与抗病相关的基因，利用这些标记作为探针从基因组文 库中钓取这些候选基因，以期能早曰克隆到这些基因。海岛棉对黄萎瘸的抗性较强， 其抗性受显性单基因或主效基因控制【6 2 ，6 3 1 。研究表明，海岛棉品种p i m a 9 0 5 3 对强 致病力和中等致病力菌系表现为高抗1 6 2 1 。基于此，本课题组利用c d n a a f l p 技术 研究了p i m a 9 0 - 5 3 在黄萎病菌胁迫下抗性基因的差异表达，得到了一些棉花抗黄萎 病相关基因片段，可利用这些差异片段作为探针从基因组文库中钓取并克隆到这些 与抗黄萎病相关的基因。 海岛棉纤维细长、强力高、抗病性强，是品质最优的栽培种。因此构建海岛棉 品种的b a c 文库，利用国内外已有分子标记探针钓取和分析含有重要性状的b a c 克隆，是发掘分子标记、克隆纤维发育相关基因和抗病基因、深入开展棉花功能和 比较基因组学研究的基础和关键。本研究以优质抗病海岛棉品种p i m a 9 0 5 3 为材料 构建了细菌人工染色体文库，为克隆纤维发育相关基因和抗黄萎病基因奠定了基础。 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 2 1 材料 2 材料和方法 2 1 1 供试材料 供试海岛棉品种p i m a 9 0 5 3 和棉花抗黄萎病相关基因片段p r 8 来自于本课题 组。 2 1 2 试剂 大肠杆菌d h l o b 感受态细胞为i n v i t m g e n ( u s a ) 公司产品。克隆载体 p i n d i g o b a c 5 ( 土池胡i i - c l o n i n gr e a d y ) 为e p i c e n t r et e c h n o l o g i e s ( u s a ) 公司产品。大肠 杆菌d h 5a 感受态细胞和克隆载体p u c l l 8 加脚hi b a p 分别为天为时代公司和 t a k a r a 公司产品，h y b o n d 耵杂交膜为a m e r s h 蛐公司产品，d i g 杂交试剂盒( d i g h i 曲p r i m ed n al a b e l i n g 髓dd e t e c t i o ns t a r t e rk i ti ) 为罗氏公司产品。 叶绿体舯6 a 基因探针和海岛棉纤维蛋白基因乃3 8 探针及与棉纤维起始相关的 删8 转录因子探针均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 2 2 试验方法 2 2 1 高分子量基因组d n a 的提取 j ) 取在人工培养室弱光培养一周左右的棉花幼苗子叶2 5 9 ，于液氮中研磨l h 。 2 ) 将粉末转入预冷的2 5 0 m l l h b ( 含t r i t o n x 1 0 0 ，含o 1 5 8 疏基乙醇) 缓冲液中， 冰上搅拌1 5 m i n ，然后过滤到预冷的5 0 m l 离心管中。4 ，4 5 0 0 r p m ，离心2 0 m i n 。 3 ) 弃上清，加l m l 预冷的l h b ( 不含啊t o n x 。l o o ，含o 1 5 b 疏基乙醇) 悬浮沉淀， 然后加满l h b 缓冲液，4 ，4 5 0 0 r d m ，离心1 5 m i n 。 4 ) 重复步骤3 ) 3 次。 5 ) 弃上清，用l h b ( 不含t 打t o n x 1 0 0 和p 巯萋乙醇) 缓冲液悬浮细胞核，4 ， 4 5 0 0 i p m ，离心1 5 m i n 。 6 ) 弃上清，加入适量预冷的1 x h b 缓冲液( 不含t r i t o n x 1 0 0 和b 一疏基乙醇) 调整细 胞核的浓度至溶液呈透明状。将p l u gm o l d 置于冰上预冷，细胞核悬浮液置于4 5 水浴5 m i n 。 7 ) 向细胞核悬浮液中加入等体积的1 5 低熔点琼腊糖，混匀后，迅速加入预冷的 p l u gm o l d 中，置于冰上冷却3 0 m i n 。 8 ) 将胶块转移到含有蛋白酶k 的裂解缓冲液中。在杂交炉中5 0 裂解1 8 h 。更换 一次裂解缓冲液，在杂交炉中5 0 裂解2 1 h 。 9 ) 去除裂解缓冲液，加入含有l m m o l lp m s f 的t 1 0 e 1 0 中，冰上振荡l h ，重复l p i m a 9 0 5 3 细菌人工染色体( b a c ) 文库构建及抗黄萎病相关基因筛选 次。转入t l o e l 中，冰上振荡清洗4 次，每次1 h 。将胶块转至t l o e l 中于4 保 存。 1 0 ) 取1 ，2 、1 4 、1 8 胶块进行脉冲电泳检测，条件如下：o 5 x t b e 配制的1 琼脂糖 凝胶，温度1 i ，起始脉冲5 0 s ，终止脉冲5 0 s ，脉冲时间1 8 h ，电压6 v c m ，角 度1 2 0 。，泵8 0 。电泳结束后，溴化乙锭染色，估计胶块中d n a 的浓度。 2 2 2 部分酶切最佳酶量的确定和片段选择 1 ) 用不同用量( 0 、o - 4 、l 、2 、3 、4 、6 、8 、1 0 、1 8 u ) 的限制性内切酶胁n d i i i 对包 埋于琼脂糖凝胶块中的高分子量d n a 进行部分酶切，确定能产生所需范围片段 ( 1 0 0 k b 4 0 0 k b ) 的内切酶用量。 2 ) 用筛选出的最适内切酶用量对6 块胶块进行大量酶切，采用两次片段选择的方法 进行酶切片段的选择。 3 ) 经第一次脉冲场凝胶电泳分离后，分别切下含1 0 0 k b 2 0 0 k b 、2 0 0 k b 3 0 0 k b 、 3 0 0 k b 4 0 0 k b 间的d n a 大片段凝胶块进行第二次脉冲场凝胶电泳分离。第一次 分离时的脉冲电泳条件为：1 琼脂糖凝胶，l l ，起始脉冲5 0 s ，终止脉冲5 0 s ， 脉冲时间1 8 h ，电压6 v c m ，角度1 2 0 。，泵8 0 。第二次分离时的脉冲电泳条件 为：1 琼脂糖凝胶，1 1 ，起始脉冲3 s ，终止脉冲5 s ，脉冲时间1 6 h ，电压6 v ，c m ， 角度1 2 0 。，泵8 0 。 4 ) 经第二次分离后，切下含有目的片段的凝胶，用电洗脱仪洗脱大片段d n a ，洗 脱时间为2 h 。 5 ) 用o 8 琼脂糖凝胶检测大片段d n a 的浓度，若浓度太小，则用1 0 p e g 8 0 0 0 透析9 0 m i n ，以提高d n a 的浓度。 2 2 3 连接、转化及保存 1 ) 按载体与插入片段5 ：l 、1 0 ：1 、1 5 ：l 的摩尔比进行连接( 1 6 ，1 6 h ) 。 2 ) 连接产物用d d h 2 0 透析2 h ，再用3 0 p e g 8 0 0 0 透析3 0 m i n ，以达到脱盐和浓缩 的目的。 3 ) 采用g i b c ob r l 公司的c e l l p o m t o re l e c 昀p o r a t i o ns y s t e m 将2 1 连接产物转化 到2 0 山的大肠杆菌d h l 0 b 感受态细胞中，转化条件为3 6 0 v 、4 k n 、f a s t 、3 3 0 心。 将转化产物转移到l m ls o c 培养基中，3 7 ，2 2 5 r d m 培养1 h 。 4 ) 培养液涂于x g a l ，i p t 0 ，c m l b 固体选择培养基上，3 7 ，培养1 6 2 4 h 。 5 ) 在无菌的3 8 4 孔板的每个孔中加入6 0 斗if r e e z i n gm e d i u m ，并在每个板的侧面和 盖上写上日期、板号和所用的酶。 6 ) 挑取x 嗜a l i p t g c ml b 固体选择培养基上的白色克隆，把带有克隆的一端放入 3 8 4 孔板的一个孔中，轻轻搅动一下，然后拿掉牙签，重新拿一个灭菌的牙签挑 取另一个克隆，直到把3 8 4 孔板挑满。 7 ) 把3 8 4 孔板挑满后盖上盖子，用p a r 面l m 封好，放到3 7 培养1 6 h 。 8 ) 用3 8 4 p i nr e p l i c a t o r 进行复制，即用它在已经培养了1 6 h 的3 8 4 孔板上蘸一下， 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 再在加有f r e e z i n g m e d i 姗的新3 8 4 孔板中蘸一下，盖上盖子，用p 黝f i l m 封好， 放到3 7 培养1 6 h ，称复制i 。 9 ) 复制i 再复制一份放到3 7 培养1 6 h ，称复制i i 。 1 0 ) 把原板和复制板按号排好放到超低温冰箱中( 一8 0 ) 可长期保存。 2 2 4b a c 克隆插入片段大小的检测 1 ) 从保存的b a c 文库中随机挑取2 2 4 个单克隆，于5 m l 加有氯霉素的l b 选择培 养基中( 1 5 m l 离心管) ，3 7 ，2 5 0 r p m ，培养1 6 2 4 h 。 2 ) 菌液倒入1 5 m l 离心管中，7 0 0 0 i p m ，离心2 m i n 收集细菌。把上清倒掉再倒菌 液，再离心2 次，1 5 m l 试管中所剩的菌液经高压灭菌后再扔掉。 3 ) 加已预冷的s o l u t i o ni2 0 0 “l ，漩涡混匀，冰上放置5 m i n 。 4 ) 加入s o l u t i o n i i ( 现用现配) 4 0 0 山，轻轻混匀后室温放置5 r n i n 。 5 ) 加已预冷的s o i u t i o n i 3 0 0 u l ，轻轻混匀后冰上放置4 5 n l i n 。 6 ) 1 2 0 0 0 r p m ，离心1 0 l i l i n ，用去尖枪头将上清( 约7 5 0 “1 ) 转移到另一个1 5 m l 离心 管中，弃去沉淀。 7 ) 加入4 5 0 山异丙醇( o 6 倍上清液体积) ，轻轻混匀，放入一8 0 ，2 0 m i n 后可看到 絮状沉淀。 8 ) 1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，弃上清，加入1 m l 7 0 乙醇轻轻摇动使沉淀悬浮，1 2 0 0 0 r p m 离心5 m i n 。 9 ) 弃上清，用枪尖吸去残留的乙醇，放置在超净台上用风吹干。 1 0 ) 吹干后加入4 0 p lt 1 0 e l ( p h 8 o ) 溶解d n a ，然后置于一2 0 可长期保存。 1 1 ) 取1 0 肚1 质粒d n a 进行 ，d r i 酶切，酶切体系如下： d ( 1 h 2 0 6 7 m 质粒d n a1 0 u l 1 0 hb u 腩r 2 p l 4 0 m m s p e n i d i n el p i 研i ( 1 0 u ，m )o 3 山 1 2 ) 加2 i l l 的l o a d i n gb u 船r ，6 5 水浴1 0 m i n ，迅速放在冰上。 1 3 ) 进行脉冲电泳，条件为：o 5 t b e 配制的1 琼脂糖凝胶，温度1 1 ，起始脉冲 5 s ，终止脉冲1 5 s ，脉冲时间1 6 h ，电压6 v c m ，角度1 2 0 0 ，泵8 0 。 1 4 ) 电泳结束后将整块胶用溴化乙锭染色o 5 h ，后用蒸馏水冲洗o 5 h ，在紫外灯下观 察插入片段大小和空载情况。 2 2 5b a c 克隆稳定性分析 1 ) 从保存的b a c 文库中随机挑取7 个b a c 克隆置于加有氯霉素的l b 选择培养基 中( 1 5 m l 离心管) ，3 7 。2 5 0 r p m ，培养1 6 2 4 h 。 2 ) 分别从过夜培养的菌液中吸取5 山接种于5 m ll b 液体培养基中，3 7 ，2 5 0 r p m ， 培养1 6 2 4 h 。 6 p i m a 9 0 5 3 细菌人工染色体( b a c ) 文库构建及抗黄萎痛相关基因筛选 3 ) 重复步骤2 ) 培养至第5 天。 4 ) 按照碱裂解法少量提取第一天( o 代) 、第三天( 5 0 代) 和第五天( 1 0 0 代) 的细菌培养 物质粒d n a ，经酊i 酶切后( 酶切体系同2 2 4 ) 进行脉冲电泳检测b a c 克隆稳 定性。脉冲条件为：1 琼脂糖凝胶，11 ，起始脉冲5 s ，终止脉冲1 5 s ，脉冲时 间1 6 h ，电压6 v ，c m ，角度1 2 0 。，泵7 0 。电泳结束后，用溴化乙锭染色3 0 m i n ， 再用水冲洗3 0 m i n 。紫外观胶仪下观察结果。 5 ) 按照碱裂解法少量提取两个片段较大的第一天( o 代) 、第五天( 1 0 0 代) 的细菌培养 物质粒d n a ，经如ri 完全酶切后进行脉冲电泳检测b a c 克隆稳定性，脉冲条 件为：1 琼脂糖凝胶，l l ，起始脉冲5 s ，终止脉冲1 5 s ，脉冲时间1 l h ，电压 6 v ，c m ，角度1 2 0 。，泵7 0 。电泳结束后，用溴化乙锭染色3 0 m i n ，再用水冲洗3 0 m i n 。 紫外观胶仪下观察结果。 酶切体系如下： d d h 2 0 质粒d n a 1 0 hb u 越圩 髓d ri ( 1 0 u “1 ) 2 2 - 6b a c 克隆的鉴定 2 2 6 1 杂交膜的制备 7 “1 l o u l 2 l l l 1 u l 1 ) 从保存的b a c 文库中随机挑取2 8 个b a c 克隆置于加有氯霉素的l b 选择培养 基中( 1 5 m l 离心管) ，3 7 ，2 5 0 r p m ，培养1 6 2 4 h 。 2 ) 按照碱裂解法少量提取质粒d n a ，经 白，i 酶切后( 酶切体系同2 2 4 ) 进行脉冲电 泳分离，脉冲条件为：1 琼脂糖凝胶，l l ，起始脉冲5 s ，终止脉冲1 5 s ，脉冲 时间1 6 h ，电压6 v c m ，角度1 2 0 。，泵7 0 。 3 ) 将凝胶浸入o 2 5 m 盐酸溶液中处理1 5 m i n ，使d n a 脱嘌呤。 4 ) 用蒸馏水短暂冲洗凝胶两次。 5 ) 将凝胶浸入变性液i 中，变性3 0 m i n ，使d n a 变性。 6 ) 将凝胶浸入足量的中和液i 中，中和1 5 m i n ，两次。 7 ) 准备转膜用的平台。 8 ) 利用真空转膜仪按照真空转膜仪的使用说明进行转膜。 9 ) 转膜结束后，将尼龙膜置于2 s s c 中洗5 m i n 自然晾干。 lo ) 将尼龙膜置于8 0 烤箱烘烤2 h ，以固定d n a 。 2 2 6 2 探针的制备 1 ) 提取海岛棉品种p i n l a 9 0 一5 3 的基因组d n a 。 2 ) 取l 嵋p i m a 9 0 - 5 3 的基因组d n a ，沸水浴变性5 m i n 。 3 ) 加入4 山d i g h i 曲p