（作物遗传育种专业论文）野生大豆耐盐相关基因的克隆与序列分析.pdf

摘要 盐渍化是影响农作物生长和产量的最主要因素之一。据估计盐渍化影响着4 1 0 。到9 1 0 8 公顷的土地，是目前农业生产用地的三倍多。培育耐盐作物品种是改良和利用盐碱地的 有效措施。野生大豆是栽培大豆的近缘野生种，它具有极强的抗逆性，是大豆育种极为重要 的种质资源。因此研究野生大豆的耐盐性及分离其耐盐基因，对利用野生大豆优异基因资源 改良栽培大豆具有重要意义。 脯氨酸是分布最广泛的一种重要的有机渗透调节物质。在盐溃条件下时，不论是低等植 物，还是高等植物都可以积累游离的脯氨酸来缓解盐胁迫。脯氨酸合成酶( p 5 c s ) 是脯氨酸生 物合成途径中的限速酶，研究其功能对提高植物耐盐性有重要意义。 本研究通过同源序列法根据已经在g e n b a n k 登录的野生大豆同科植物的脯氨酸合成酶 ( 嘲基因的保守序列，分别设计两对引物以野生大豆耐盐材料z y d 0 0 6 5 9 做为试材通 过对其幼苗进行2 0 0 m mn a c l 处理，提取总r n a ，采用盯一p c r 方法，得到了长度为1 5 6 9 b p 的c d n a 片段，推断编码5 2 3 个氨基酸，分子重量为5 6 。5 1 4 k d a ，等电点p i 为6 z 5 。含有n a d p i i 结合位点和谷氨酸激酶、谷氨酸脱氢酶保守域，脯氨酸反馈抑制作用位点。使用n c b ic d d 数据库分析，该基因有完整的p 5 c s ( p r o a ) 的保守域，被命名为6 s p 5 c s l 。 采用同样方法，得到了长度为5 6 0 b p 的c d n a 片段，推断其编码1 8 6 氨基酸的多肽，分子 重量为2 0 ，1 8 6 k d a ，等电点p i 为4 7 3 。使用n c b ic d d 数据库分析，发现该基因有部分的p s c s ( p r o a ) 的保守域，被命名为白彤礴己 根据分离的g s p s c s 2 基因的保守序列设计一对引物，从野生大豆基因组d n aj - 获得了长 度为1 3 7 4 b p 的片段，含有5 个外显子和4 个内含子，并且外显子和内含子交界处有典型的 g t a g 结构，被命名为g g s p 5 c s 2 0 在n c b i 网站上，用推导的氨基酸序列，通过b l a s t p 和其它植物比对，发现6 s p s c s l 和 5 s p 5 c s 2 - 与其它植物历岱基因的同源性非常高，但是出翮和白尼破i 磅& 基酸一致性只有7 1 ，却都有p r o a 保守结构域，所以推断g s p 5 c s l ，白彤啦该是野生大豆p s c s 基因的两种不 同类型。 关键词：野生大豆；耐盐性；g s p s c s l ；g s p s c s 2 ；克隆； i s o l a t i o na n d s e q u e n c ea n a l y s i so f s a l t t o l e r a n c er e l a t e dg e n ei nw i l ds o y b e a n a b s t r a c t s a l ts u e s si so n eo ft h em a i nf a c t o r sw h i c ha f f e c tt h eg r o w t ha n do u t p u to fc r o p s i ti s e s t i m a t e dt h a tu pt o4 x 1 0 5 - - 9 x 1 0 8 h e c t a r el a n dw a ss a l i n i z e a l ，w h i c hi sm o r et h a nt h r e et i m e st o p r e s e n ta g r i c u l t u r a ll a n d ，s oh o wt oi m p r o v ec r o p ss a l tt a l e r a n c ei sb e c o m i n gm o l ea n dm o r e i m p o r t a n t c u l t i v a t e ds o y b e a no a o n sf r o mw i l ds o y b e a n ，w i l ds o y b e a nh a sg r e a tr e s i s t a n c ea n di s a l li m p o r t a n tg e r m p l a s mr e s o l l r e o sf o rc u l t i v a t e ds o y b e a nb r e e d i n g t h e r e f o r e ，i ti sv e r yu r g e n tt o s t u d ys a l t - t o l e r a n c em e c h a n i s ma n di s o l a t ee x c e l l e n tg e n e sf r o m w i l ds o y b e a nf o rc u l t i v a t e d s o y b e a ni m p r o v e m e n t t h ep r o l i n ei sa ni m p o r t a n to s m o l y t e n o to n l yl o w e rp l a n t sb u ta l s oh i g h e l p l a n t sc a n a c c u m u l a t ef r e ep r o l i n ei nr e s p o n s et 0o s m o t i cs t r e s s e s t h ep r o l i n es y n t h e s i se n z y m ef p 5 c s ) i sa k e ye n z y m ei nt h ep r o l i n eb i o s y n t h e s i sw h i c hl i m i t st h es y n t h e s i sr a t eo fp r o l i n e i th a si m p o r t a n t s i g n i f i c a n c et or e s e a r c ho np 5 c s w i l ds o y b e a nz y d 0 0 6 5 9w a su s e di nt h i ss t u d y t w op a i r so fp r i m e r sw e r ed e s i g n e d a c c o r d i n gt ot h ec o n s e r v e dr e g i o mo ft h ep s c s f r o mo t h e rp l a n ti ng e n h a n k , t h eg e n ew a s a m p l i f i e db yr t - p c rf r o mt h et o t a lr n aw h i c hw a s e x t r a c t e df r o mw i l ds o y b e a nu n d e rs a l ts t r e s s i n2 0 0 m mn a c i b yh o m o l o g o u sb a s e dc l o n i n g w ei s o l a t e dac d n as e q u e n c ei nw i l d y b e a r l w i t h1 5 6 9b pi nl e n g t h i te n c o d e s5 2 3a m i n oa c i d s p r e d i c t e db ys o f t w a r e , t h em o l e c u l a rw e i g h to f t h i sp o p t i d ei s5 6 51 4 k d a , i t si s o e l e e t r i ep o i n ti s6 7 5 t h ed e d u c e dp r o t e i nc o n t a i n s n a d p h - b i n d i n gd o m a i n , g l u k i n a s ed o m a i n , g s a - d e h y d m g e n a s od o m a i n a n d f e e d b a c k i n h i b i t i o ns i t e n c b id a l a b a s ec o n s e r v e dd o m a i ns e a r c h , i th a st h ew h o l ep r o ad o m a i n , n a m e d g s p s c s l u s et h e & a n l em e t h o d ，w ea l s oi s o l a t e da n o t h e re d n as e q u e n c ei nw i l ds o y b e a nw i t h5 6 0 b pi n l e n g t h i te n c o d e sa b o u t1 8 6a m i n oa c i d s 。p r e d i c t e db ys o f t w a r e , t h em o l e c u l a rw e i g h to ft h i s p e p t i d ej s2 0 ，1 8 6 k d a , i t si s o e l e c t r i cp o i n ti s4 7 3 n c b id a t a b a s ec o n s e r v e dd o m a i ns e a r c h , i th a s t h ep a r t i a lp r o ad o m a i n n a m e dg s p 3 c s 2 w el 螂g s p s c s 2e d n as e q u e n c ed e s i g n e dap a i ro fp r i m e r a m p l i f i e dad n as e q u e n c eb y p c ri ng e n o m i ed n a t h el e n g t ho ft h es e q u e n c ei s 1 3 7 4 b p ，c o n t a i n sf o u ri n t r o n sa n df i v e e x t t o n s a n db e t 、v c e ni n t r o n sa n de x t r o nw h i c hh a v et y p i c a lg t a gs t r u c t u r e n a m e dg g s p s c s 2 w eb l a s tt h es e q u e n c ew i t ho t h e rp l a n t so nn c b lw e bs i t e ，w ef m dt h e ya r eh a v eh i g h h o m o l o g o u s t o o t h e r p l a n t s t h e i d e n t i t yo t g s p 5 c s la n d g s p s c s 2o n l y7 1 b u t t h e ya r e a l l h a v e 东北农业大学农学硕士学位论文 p r o a d o m a i n w es u g g e s t t h a t t h e y a r ed i f f e r e n t t y p e so f p 5 c s g e n e i n w i l ds o y b e a n k e y w o r d s ：w i l ds o y b e a n ；s a l tt o l e r a n c e ：p 5 c s ip 5 c s 2 ；c l o n e c a n d i d a t e ：z h a n gc h u n b a o s p e c i a l i t y ：c r o pg e n e t i c sa n db r e e d i n g s u p e r v i s o r ：p r o l w a n gf e n g y i ；d o n gy i l 骖h 卸 研究生学位论文独创声明和使用授权书 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 注! 垫遗查基丝霞塞挂型童盟数：奎拦里窒! 或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：苏荔盆 日期研年笋月口日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解 密后适用本授权书) 学位论文作者签名：猫季岩日期：劢d 7 年钥加日 导师 签 日期：动。了年华月o 日 前言 1 前言 1 1 研究的目的和意义 目前，影响农作物生长和产量的最主要因素是环境胁迫，其中又以盐胁迫和干早胁迫最 为严重。据估计，盐渍化影响者4 x 1 0 。到9 x t 0 8 公顷的地，是目前农业生产用地的三倍多， 由盐胁迫造成的作物减产约占环境胁迫影响的7 0 ，有4 0 以上的灌溉土地不同程度地受 到盐渍化的影响。而且。由于灌溉用水质量下降，耕地盐渍化的程度还在不断加重( 赵可夫 等，1 9 9 9 ) 。如何减轻盐胁迫对农业生产的影响，使大面积的盐碱地、荒漠化土地和丰富的 盐水资源可以为农业生产所利用，这是未来农业发展所面临的一个重要课题。 开发利用盐碱地最直接、最有效的途径是培育耐盐作物品种。目前，培育耐盐作物品种 的主要途径有：一、野生耐盐植物驯化；二、建立在形态、生理或分子标记选择基础上的传 统育种；三、利用作物与野生亲缘种进行远缘杂交：四、组织培养或诱变筛选耐盐突变株： 五、基因工程育种。其中，基因工程技术可以打破物种间遗传物质横向转移的壁垒。为难度 较大的作物耐盐性改良开辟了更直接、更有效的途径。迄今为止，已有许多与植物耐盐有关 的基因被分别用于转基因研究中，并不同程度地提高了转基因植物的耐盐能力。然而，到目 前为止，仍未获得真正具有实践意义的耐盐作物品种，主要原因在于植物耐盐是一个多基因 决定的数量性状，是多种耐盐生理性状的综合体现。要获得真正的耐盐作物品种，必须制定 有效策略，实现多种耐盐机制的综合作用。 植物的耐盐性无论从生理生化水平、细胞水平、分子水平上来看，是一个植物整体反应 的复杂过程，植物的抗逆性能往往不是由单基因决定的，而是由一系列相关的直接或间接作 用的基因，形成一个复杂的调控网络。目前对全体基因同时进行研究不太可能，所以从某 个或某几个基因着手深入研究，取得一定的突破后，才可能以点带面全面认识了解耐盐性问 题。 野生大豆是栽培大豆的近缘野生种，栽培大豆起源于野生大豆，它是大豆育种极为重要 的种质资源。中国野生大豆遗传资源数量多、类型丰富，受到世界大豆主产国高度重视。野 生大豆的研究利用，对拓宽栽培大豆的遗传基础，提高大豆育种水平有重要价值。野生大豆的 搜集、整理与利用方面，前人己傲了大量研究工作，面长期以来，野生大豆耐盐性相关的理论 研究至今尚未有突破性进展，而其耐盐性相关分子生物学研究几乎无人涉及。因此研究野生 大豆的耐盐性及分离其耐盐基因，对研究栽培大豆耐盐机理及分离相关基因有重要意义。 1 2 本研究的主要内容 本研究主要是通过同源序列法设计引物，以高耐盐的野生大豆植株为研究材料，通过对 东北农业大学农学硕士学位论文 野生大豆幼苗进行盐处理，提取其总r n a 和基因组d n a ，采用r t p c r 和p c r 的方法，分离野 生大豆盐胁迫应答相关基因。 通过生物信息学方法，对分离的基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行功能分析和 同源性分析。 2 1 3 文献综述 1 3 1 植物耐盐机制的研究进展 1 3 1 1 盐胁迫对植物的影响 盐胁迫对植物主要表现为两方面的伤害：渗透胁迫效应和离子胁迫效应。在盐胁迫的逆 境条件下，植物体的光合、呼吸、蒸腾、吸收和代谢等等生命活动都会受到不同程度的干扰。 具体表现为：细胞膜受损，光合作用降低，碳同化减少，而渗透调节物质的合成和积累、渗 透势的维持却要消耗大量的能量( m u r m sr ，1 9 8 6 ) 。 1 膜损伤 在植物受到盐胁迫时，细胞膜是遭受伤害的原初位点，质膜的伤害尤为严重。在盐逆境 中的植物细胞内，自由基代谢平衡遭到破坏，进而产生大量的自由基。这些自由基会对不同 的细胞成分包括膜腊、膜蛋白、核酸发生氧化作用从而使细胞膜的结构和功能完整性受到 破坏，膜的选择性丧失，严重会使植物细胞死亡。丙二醛( m d a ) 是膜质过氧化的产物( 陈少裕， 1 9 8 9 ) ，通常被看成是许多植物伤害的指标( 王宝山，1 9 8 8 1 蒋明义，1 9 9 6 ) 。膜脂过氧化的 中间产物自由基和最终产物h d a 能造成细胞膜系统的损伤，严重时可以导致植物细胞的死亡。 z 离子毒害 盐逆境下植物地上部积累高浓度的盐离子或n a + k + 比例太高会使植物受至h 伤害。高浓度 的n a + ，一方面置换质膜的钙，另一方面削弱质膜上的膜保护酶系统，致使膜脂过氧化作用 加剧，膜透性增加，k + 、c a + 离子外渗导致离子不平衡及矿质营养的失调( 赵可夫1 9 9 3 ) 。另 外由n a c l 引起的盐胁迫也影响了k 和c a “的胞内分布，使k 、c a 2 + ，5 l g ”等阳离子的结合位点 遭到破坏( s e r r a a n or 1 9 9 9 ) 。 3 活性氧伤害 在盐胁迫下植物体内活性氧的代谢系统平衡也受到影响，表现在活性氧如旷， 如的产 生量增加，活性氧清除剂s o d ，c a t ，p o d 等遭到破坏。体内活性氧含量的增高会启动膜脂过 氧化或膜脂脱脂作用。自由基的大量产生若不能及时被超氧化物酶分解，将会形成破坏力 更人的羟自由基( a l l e n1 9 9 5 ) 。这些自由基会对不同的细胞成分包括膜脂、膜蛋自、核酸发 生氧化作用，从而使细胞膜的结构和功能完整性受到破坏，膜的选择性丧失，严重会使植物 细胞死亡，进而导致一系列生理生化代谢紊乱，使植物受到伤害。 4 光合下降、耗能增加 植物在高盐的外界环境中。往往会发生光抑制现象，光抑制现象的主要发生部位为p s i i 。关于盐胁迫对p s i i 的光能利用率的影响报道较多，但尚未得到统一认识。e m a r o 等认 为。盐胁迫可以改善p s i i 的功能( a r oe ，1 9 9 3 ) ：e v e r a dj 等则认为，盐胁迫可以抑制 p si i 的功能( e v e r a dj ，1 9 9 4 ) ：朱新广等认为，在低盐浓度胁迫下，小麦的p s 活性变化 不大但当盐离子达一定浓度后p s i i 活性显著下降( 朱新广，1 9 9 9 ) 。另外，盐分通过蒸 3 东北农业大学农学硕士学位论文 腾作用与水分和营养物质一起运输到地上器官中这时地上部分的离子浓度上升，植株产生 应急反应，暂时关闭气孔以阻止盐分向上运输( m u n n sr ，1 9 8 6 ) 气孔的关闭严重阻碍了 c 0 2 进入叶肉细胞内从而降低了植物的光合作用。 5 离子吸收不平衡 受到盐胁迫时，盐离子在植物吸收矿物元素过程中与各种营养元素相互竞争，从而造成 矿质营养吸收减少打破了植物体内的离子平衡，严重影响植物正常生长。具体表现在n g 影响着k 和c a 2 。的胞内分布，c 1 + 则抑制了植物对n 矿一及 1 2 p 0 。的吸收。 1 3 1 2 植物耐盐机理的研究 盐生植物可分为吸盐型和拒盐型两类。吸盐型植物将盐作为渗透溶质可以减少耗能，但 容易破坏细胞内的离子平衡引起离子毒害和必需元素的缺乏。拒盐型植物可以避免离子效 应，但容易导致渗透胁迫对细胞的伤害。许多盐生植物是吸盐型的，进入植物体内的盐分通 过细胞层次的区隔化分配，积累于液泡中，细胞中的主要一些小分子的有机溶质如甜菜碱和 脯氨酸，以及k 等维持渗透平衡。因此，液泡膜必须具有高效的运输机制，以保持液泡内的 盐分梯度。一些中等抗盐植物和甜土植物，主要依靠拒盐、泌盐和稀盐三种方式抗盐。淡土 植物多数为拒盐型植物，主要策略包括对盐分吸收的适度控制、盐分在不同器官组织和细胞 层次上不均一分配的协同作用、以及地上部盐分通过韧皮部向地下部的运输来维持地上部， 特别是光合细胞中相对较低的盐分浓度。通常，每种植物都不同程度地同时存在着上述两种 机制。 1 调节离子平衡 盐对植物的一个主要伤害是离子胁迫。较高的盐浓度( o 4 m m o l l ) 会破坏保持蛋白 稳定的疏水一静电平衡，因此抑制了大部分的酶活性。n a + 还破坏k + 、m g z 等阳离子的结合位 点( s e r r a n or ，1 9 9 4 ) 。植物消除n a 毒害的策略包括：降低的n a 吸收、n a 的外排和n a + 的区隔化。n a + 的外排和+ 的区隔化是间接的主动运输过程，主要由n a + h 逆向转运蛋白来 调节。n a + r 逆向转运蛋白是生物界普遍存在的负责n a h + 交换的一种跨膜运输蛋白，在植物 中扮演着重要的角色它通过n a 的外排和的区隔化来保持植物细胞内的低n a 冰平，是 植物耐盐的关键因子。耐盐植物与敏盐植物的差异在于耐盐植物中的n a 和c l - 向叶子中的运 输速率低，而且能够将这此离子运输到液泡中防止它们在细胞质或细胞壁中聚集从而避免盐 害( m u n n sr ，1 9 9 3 ) 。 ( 1 ) n a 的吸收 由于质膜上的负电化学势及胞内n a + 浓度较低，因此+ 内流是一个被动过程，尽管n a 通过植物细胞膜内流的机制还未建立起来，但有证据表明n a 进入胞内大部分通过k 。通道。 植物细胞膜上至少存在两种不同的k 吸收系统低亲和k 吸收系统和高亲和k 吸收系统n a + 和l i 可以与k + 竞争并通过k 吸收系统进入细胞，高亲和k + 吸收系统在对k + 的选择性上比低 亲和k 吸收系统高( c r a m e rgr ，1 9 9 4 ) 。 ( 2 ) n a 的外排 4 n a + 从细胞内排出需要逆其电化学势转运，是一个主动运输的过程。海藻质膜上存在 n a 。呐t p a s e ，水解的a t p 驱动n 8 向跑外运输( c l i p s o nnj 吼1 9 8 7 ) ，目前在高等植物中还 没有发现n a - a t p a s e 的存在。高等植物的排n a t 机制主要与质膜n a h 逆向转运蛋白有关， 质膜h - a t p a s e 水解a t p 的能量把h 1 从细胞质中泵出细胞，产生跨质膜的电化学势梯度，提 供能量，驱动质膜上的n a h 逆向转运蛋白，使h 顺其电化学势进入细胞，同时n a + 逆其电化 学势排出细胞( r o d r i g u e zhg ，1 9 9 7 ) 。质膜上的n a + h 逆向转运蛋白基因最初是由酵母克 隆得到的。现在，n a h + 逆向转运蛋白活性已在许多高等植物和藻类中检测到。 ( 3 ) 盐的区隔化 植物受到盐胁迫时，往往把盐从细胞质和细胞器中清除出去，使其集中于液泡中，这种 现象称之为盐的区隔化。液泡是植物成熟细胞最大的细胞器，能储存营养和代谢产物，避免 有毒物质对细胞质的伤害，有利于细胞和环境间的物质交换，在细胞化学能利用、信号转导、 膨压调节和耐盐性中起重要作用。区隔化作用，一方面使渗透压保持一定梯度，让水分进入 细胞：另一方面维持细胞质中正常的盐浓度，避免高浓度盐对质膜的伤害，保持生物酶的活 性维持细胞内的离子平衡。离子的选择性吸收、质膜的k + ，n a + 交换和液泡膜的- k + 交换， 在调节植物体内的离子平衡，盐分运输和细胞区隔化过程中起重要作用。由于从耐盐植物中 分离出的酶，并不具有特殊的耐盐性，因此，盐分在细胞中的区隔化分配是决定植物细胞耐 盐性的关键因素。盐胁迫下植物细胞减少胞质内n a 积累的一个重要方式是通过液泡膜n a 。h + 反向转运蛋白把胞质中的n a + 排入液泡，这是一种胞内区隔化效应。这一效应不仅降低了胞 质内的n a 浓度，而且还可以使细胞能利用积累在液泡中的大量离了进行渗透调节、保持液 泡膨压( m i c h e l e tb ，1 9 9 5 ) 。液泡膜上的n a h 。a n t i p o r t e r 运转是靠跨液泡膜的h 梯度来 驱动的。液泡膜上的两种初级质子泵：v - a t p a s e 和液泡h - a t p a s e 参与运输系统的能量供应 ( v o l l ( 田a rkm ，1 9 9 8 ) h + - a t p a s e 由多基因家族编码各等位基因的表达在时间和空问上 受化学和环境因素的诱导。区隔化作用是由基因控制的，同时也受细胞质中有机渗透溶质和 a b a 的影响| 【o u ofq ，1 9 9 9 ) 。不同的植物区隔化作用不同，双子叶盐生植物近9 5 的n a ， c l 积累在叶肉细胞的液泡中。淡土植物的离子区隔化能力较弱。 2 渗透调节物质 植物在受到盐胁迫时往往会在细胞质中合成并积累一些有机溶质，这些有机溶质极易溶 于水，能调节渗透势。但又不能进入蛋白质的水化膜内，不仅不会破坏蛋白质的卷曲结构， 反而由于被排斥在膜的外表而有益于保护和稳定细胞蛋白质结构，防止酶变性失活。这些渗 透调节剂有如下几类：氨基酸及其衍生物，如脯氨酸、甘氨酸、甜菜碱等：糖类，如蔗 糖、海藻塘等；多元醇类，如甘油、山梨醇、甘露醇等。它们能够维持细胞的膨压，稳定 细胞质中酶活性构象，保护其不璺盐离子伤害( s m i r n o f fc ，e ta 1 1 9 9 0 ) 。 ( 1 ) 氨基酸及其衍生物 脯氨酸是植物中主要的渗透调节物质之一，它不仅是生物大分子的保护剂或羟基的清除 剂，还是植物从胁迫条件回复正常过程中迅速，有效的氮源、碳源和还原剂。许多物种，包 括细菌、真菌和植物等，在渗透胁迫条件下常通过积累脯氨酸来达到渗透调节的作用 ( m a n s o u rm 1 9 9 8 ) 。尽管对脯氨酸的积累究竟是由于盐胁迫日f 起植物损伤的征兆，还是 耐盐的原因目前尚存有争议，但脯氨酸合成酶基因的克隆、分离和遗传转化却取得了很大成 功( d e l a u n e y ，1 9 9 3 ) 。由于细胞质酸度增加可能有利于脯氨酸形成( k i s h o r 1 9 9 5 ) 也可 能活化膜质子泵。因此，推测烟草细胞耐盐性诱导的顺序可能是：盐胁迫一a b a 一基因表达 一2 6 l ( d 蛋白质一脯氨酸积累一膜质子泵一酎盐性。除此之外，脯氨酸还能稳定细胞蛋白质结 构，作为细胞的氮源和能量的代谢储存库。目前有人认为，盐胁迫下脯氨酸的积累是由于脯 氨酸合成的增加和其氧化代谢速率降低造成的( j i p i n gl i u ，1 9 9 7 ) 。 甜菜碱是生物界广泛存在的细胞相容性物质，也是公认的在微生物和植物细胞中起着无 毒渗透保护剂作用的主要次生代谢积累物之一，其积累使许多代谢过程中的重要酶类在渗透 胁迫下能继续保持活性( l i l i u s ，1 9 9 6 ) 。s t o r e y 和w y nj o n e s 首先观察到盐或水分胁迫引 起甜菜碱在植物中积累，以后在许多植物中看到同样的现象。许多种生物如细菌、藻类、高 等植物等，在盐碱、水分和低温胁迫下，能诱导甜菜碱醛脱氢酶基因表达积累甜菜碱类物 质来维持细胞的正常膨压。由于甜菜碱的合成途径比较简单，目前己证明甜菜碱合成后几乎 不再被迸一步代谢。属于永久性或半永久性渗透调节莉，因此甜菜碱被认为是最有希望的渗 透保护剂之一，在植物抗盐研究中己越来越受到重视( h i d e n o r ih ，1 9 9 7 ) 。 ( 2 ) 糖类物质 糖类物质也是植物受到盐胁迫时常常积累的小分子有机物如海藻糖、果聚糖、蔗糖等。 它们既是一种贮藏性碳水化合物，又能作为渗透调节剂保护生物细胞和生物活性物质在不良 环境条件下免遭破坏。其中，海藻糖是一种国际上新近开发的主要低聚糖之一，广泛存在于 海藻、昆虫及高等植物体内，保护生物细胞在脱水、干旱、高温、冷冻、高渗透压等环境下 免遭破坏；海藻糖还能在干燥状态下保持细胞组织的脂类、蛋白质、碳水化合物和核酸等不 受破坏。在许多微生物中相继克隆了海藻糖代谢途径的各种酶基因，如酵母中海藻糖合成酶 基因t s p l ，a s p 2 及两种海藻糖酶的基因n t h l 和a t h l ；大肠杆菌中海藻糖合成酶基因o s t a ， o s t b 及海藻糖酶基因t r e b c 等。 ( 3 ) 多元醇 多元醇含有多个羟基亲水性强，能够有效地维持细胞内水活度，从而有效地抵抗盐胁 迫下的渗透脱水。多元醇的积累与植物对干早和盐胁迫的耐受性有关。多元醇除了对细胞起 到渗透保护作用外，还能清除活性氧，在这方面甲基肌醇比甘氨酸甜菜碱更为有效，尤其在 高毒性羟基存在下，甲基肌醇及肌醇能保护对活性氧敏感的酶和细胞膜( b os h e n ，1 9 9 7 ) 。 甘露醇和山梨醇都屈于多元醇。含有多个羟基，亲水性强，能有效的维持细胞的膨压，从而 起到抗盐的作用。 3 调节水通道的活性 人们很早就推测在膜上存在着一种水通道蛋白这种蛋白可以在膜上形成选择性的水运 输通道，与离子通道不同的是它只允许水分子通过，而将离子或其它有机物拒之门外。现在 这种推测已经得到了证实，这种水通道蛋白已被命名为a q u a p o r i n oa q u a p o r i n 包括m i p 和 p i p 两类，在植物中存在一个a q u a p o r i n 基因家族，不同的a q u a p o r i n 基因分别在不同的组 织与细胞中表达，表明a q u a p o r i n 可能具有重要的生理功能。a q u a p o r i n 的活力对植物耐盐 可能尤其重要，有证据表明：在受到盐胁迫时，植物可能需要控制a 口u a p o r i n 的活性 ( y a m a g u c h is h i n o z a k i ，e ta 1 1 9 9 3 ) 。目前认为干旱，盐等胁迫能调控a q u a p o r i n 在生 物膜上的数量和相对丰度。水分的跨膜运输还和水通道蛋白的磷酸化程度密切相关。目前， 6 已从冰草中分离到编码的水通道白基因m i p 。在盐胁迫下，m i p 基因的转录水平大大提高。 4 。清除细胞中的活性氧 盐胁迫会产生大量的活性氧若不能得到及时清除。这些活性氧就会导致细胞结构的氧 化损伤。植物体内存在着抗氧保护体系，主要包括酶促保护系统和非酶促保护系统( 小分子 化合物) 。 酶促保护系统主要包括s o d ，p o t 和c a t 酶等，植物中可以清除活性氧的主要是s o d 、c a t 、 抗坏血酸过氧化物酶( a p x ) 及谷胱甘肽还原酶( g r ) 等。其中，s o d 是抗氧化系统中一种极 为重要和在生物体内普遍存在的金属酶。在酶保护系统中，s o d 处于核心地位，许多报道认 为：水分胁迫下植物体内的s o d 活性与植物抗氧化胁迫能力呈正相关。另一个酶保护体系是 抗坏血酸谷胱甘肽循环，抗坏血酸过氧化物酶( a p ) 和谷胱甘肽还原酶( g r ) 是其中的关 键酶，它们可以直接清除h 疵( i n z ed 1 9 9 5 ) 。 非酶促保护系统包括g s h ，a s a ，v e 、类胡萝h 素等一些小分子化合物。此外酚类、类黄 酮化合物、脯氨酸、甘露醇、多胺、激动素等也有清除活性氧的功能。在正常条件下，植物 体内的活性氧的产生和灭亡是处于动态平衡的：当遭受盐胁迫时，这种平衡就会被打破，如 果保护系统不能及时清除过量的活性氧，植物细胞的膜系统就可导致严重受损。因此，活性 氧清除系统对植物的抗盐生理至关重要( b o w l e rc ，1 9 9 1 ) 5 改变光合作用途径 自然界存在些肉质植物如豆瓣绿属植物、马齿觅科植物以及番茄科植物冰草等，在受到 盐渍或水分胁迫时它们可以改变光合碳同化途径，即由c a 途径变为c a m 途径。c a m 植物在夜 间开放气孔进行c o z 的吸收和固定，白天气孔关闭减少蒸腾失水，这是一种对环境干旱的适 应。整个光合作用途径转变是一个十分复杂的过程，涉及到的基因很多，所以很难利用这种 改变植物光合作用的途径来提高植物耐盐性。 1 3 1 3 盐胁迫信号传递途径 当生物受到盐胁迫时，植物体产生的一系列盐应答效应分子负责胁迫信号的传递，事实 上许多与生物生长发育、激素传递相关的调控分子都参与了细胞的盐应答反应。 酵母作为单细胞真核生物，由于和高等植物在信号传递系统和膜转运蛋白系统上有很好 的类比性，因此被广泛应用于这两类分子的克隆和功能研究中。酵母中的三条渗透胁迫信号 途径的各个环节已经基本研究清楚：第一条为：s l n l - - s s k l 一s s k 2 s s k 2 2 一p b s z - - h o g l ( b o g l 途径是渗调剂甘油的受控合成途径) ，该途径属于两组分信号传递系统( p o s a sf 。1 9 9 7 m a e d at ，1 9 9 4 ，p o s a sf ，1 9 9 8 ) ：第二条途径是：s b o i - p b s 2 - h o g1 这两条途径在p b s 2 处汇合并最终导致甘油合成基因的转录激活，调节渗透平衡。途径中的其他成员如 s s k 2 s s k 2 2 ，p b s 2 和h o g1 分别相当于促有丝分裂激活蛋白激酶( i t a p k ) 信号级联系统中的 激酶成员( i u l e tjm ，1 9 9 9 ) 。尽管在酵母和动物中已发现了许多m a p k 级联途径，但在植 物中还不很清楚。第三条途径可能涉及一种依赖于c g c a m 的p p 2 b 类型的蛋白激酶( c a n ) ， 它包括催化亚基( c n a ) 和调节亚基( c n b ) 。c a n 与e n a ( 促进离子外捧的a t p a s e ) 共同作 7 用，将酵母细胞内的n a + 和l i + 排出，从而达到抗盐的目的( s e r a n n or ，1 9 9 9 ，m a t h e o sdp 1 9 9 7 ，c r e s p ojl ，2 0 0 1 ) 。 高等植物的信号传导途径通路比酵母更为复杂，在受到低温、干旱及盐胁迫等影响下， 信号传导并非通过单一的途径完成，而是形成一个调控网络。植物细胞中每一种信号感受器 仅能调节某一方面胁迫信号传导途径的某一个分支。例如低温可以改变膜的流动性，某一信 号感受器可能启动膜流动性的信号传导途径，而不能调控细胞内直接参与低温反应的保护细 胞的某些蛋白的激活及其构建。由此可见，细胞内还有其它更多的信号感受器来感知外界环 境的胁迫，从而起始其他信号传导途径。通常在这些信号传导过程中，都有一个外界胁迫信 号受体作为信号传导的起始。然后经过第二信使的传递和胞内c a “水平调节来起始一系列的 蛋白磷酸化，最后通过转录因子的调控使直接参与细胞保护及修复的目的蛋白得以表达。同 时在转录起始胁迫调控基因过程中的一些基因产物，例如a b a ，e t h y l e n e ，s a 等调节分子， 反过来又能起始下一轮的信号传递。 现在认为细胞在受外界环境( 寒冷、渗透以及盐胁迫等) 影响过程中，信号传导并不是 某一信号传导机制独立完成的，而是形成一个网络。植物外界环境的低温、干旱及盐胁迫 时产生的信号传导网络途径大致分为3 个类型： 1 由m a p k 信号传导途径参与的渗透氧化胁迫信号传导。 该途径的主要功能是接受外界环境的低温、渗透等胁迫信号，并经过m a p k 途径的一系 列磷酸化过程从而起始某些抗氧化、渗透的相关蛋白，从而达到细胞保护、损伤修复以及细 胞周期调控等功能( k a n ghm ，2 0 0 2 ) 。 2 由c a 2 依赖的信号诱导启动的信号传导途径。 l e a 基因包括脱水反应元素d r e c r e p e a t ( c r t ) 系列。因为p h o s p h o l i p a s ee 在植物 中有可能参与了g 蛋白的调控和类l e a 基因的表达。在低温、干旱及盐胁迫下，g 蛋白关联 的感受器有可能存在并且在接受由胁迫产生的第二信使方面发挥功能( d i n gck 2 0 0 1 ) 。 3 c 矿依赖的s o s 信号传导途径，该途径主要作用是维持细胞内离子平衡。 随着生物技术的不断发展与提高，将会有越来越多新的植物激酶被证明与盐应答相关， 它们之间的相互作用和功能的研究也将有助于逐步了解盐胁迫信号在植物中级联反应的传 递方式。 1 3 2 植物耐盐基因工程研究进展 了解植物的耐盐机理后，将控制这些机理的遗传密码子进行基因定位，然后通过基因工 程的手段，将这些目的基因转移到受体细胞的d n a 结构中。基因工程技术可以打破物种间遗 传物质横向转移的壁垒，为难度较大的作物耐盐性改良开辟了更直接更有效的途径。近年来， 已相继克隆了一些与植物耐盐有关的基因，对其中一些基因在植物耐盐过程中的作用的研究 大大加深了我们对植物耐盐机制的认识，出现了一些新的、卓有成效的基因工程策略。 植物的耐盐性是一个复杂的数量遗传性状，既受到环境的影响，又受植物发育时间和空 间的限制，一般认为是受多基因控制的。耐盐性与其他的连续性状一样，也可能被少数主效 8 基因控制。通过在组织和细胞培养中自发和诱发突变等措施，可使这些主效基因的性能得到 恢复；另外当用耐盐性不同的基因型杂交时，通过改变环境条件或遗传背景也可以使主效基 因恢复。耐盐性可能来自一个显性或一个等显性的等位基因。目前己有一些关于单基因的变 化和植物耐盐性密切相关的报道。陈受宜等( 1 9 9 1 ) 通过凸i s 诱变和盐胁迫反复选择得到一 个粳稻耐盐突变体，田问鉴定结果表明，该耐盐突变体的耐盐性受对主效基因控制。z h a n g 等( 1 9 9 5 ) 及丁海媛等( 1 9 9 8 ) 分别利用r f l p 和r a p d 技术将突变位点定位在水稻第七条染 色体上。 迄今为止，已有许多与植物耐盐相关的基因被用于转基因研究中。根据这些基因产物的 作用可将这些盐诱导基因分为两大类： 第一类基因包括，直接保护细胞免受水分胁迫伤害的功能蛋白基因，如l e a 蛋白基因、 渗调蛋白基因、离子通道蛋白基因如具有n a 转运作用的+ h + 反向转运蛋白基因：渗透调节 因子的合成酶基因，如参与脯氨酸合成的p s c , y 基因( k i s h o r ，1 9 9 5 ) 、o a t 基因( p a t r i c k ， 2 0 0 4 ) 与甜菜碱合成有关的基因、与甘露醇合成有关的基因( 刘俊君等，1 9 9 6 ) 、与山梨醇 合成有关的基因( 刘岩等，1 9 9 8 ) ：具有抗氧化胁迫作用的过氧化酶基因( b o m e r 1 9 9 2 ) ， 可降解毒性便细胞各种生理生化代谢活动维持正常进行。这一类基因产物的具体功能受到广 泛重视，研究得较为透彻。利用l e a 蛋白基因( r o s ap o r c e l ，2 0 0 5 ) 、脯氨酸合成酶基因 ( r o s ap o r c e l ，2 0 0 4 ) 及甜菜碱合成酶基因等进行转化，已获得了一些耐盐耐旱性状得到改 善的转基因植物。 第二类基因包括，参与胁迫信号传导的基因，有实验报道酵母中依赖于钙调素的钙神经 元c a n 转入烟草中可以提高烟草的耐盐性( p a r d o ，1 9 9 8 ) ；调控基因表达的转录因子，如拟 南芥中发现的d r e b 转录因子，可特异性的与顺式作用启动子元件d r e 相互作用，在调控干 旱、低温和盐胁迫诱导基因的表达上具有重要作用。最近在拟南芥和烟草中也发现双组分系 统基因的存在，其基因产物为“感受器”和“反应调节器”合二为一的激酶蛋白。拟南芥的 双组分系统基因a t r r i 和a t r r 2 受干旱、高盐及低温的诱导( u r a ol1 9 9 8 ) ，烟草双组分系 统基因n t h k l 也受高盐胁迫处理的诱导( 张劲松等，1 9 9 9 ) 。烟草的盐一渗透胁迫诱导基因 t l t c 7 ，其产物为受体样蛋白，定位于膜上，可能参与渗透胁迫信号传递，在耐盐性方面起 重要作用( t a m u r ae ta l ，2 0 0 3 ) 许多研究已经证明：植物耐盐是一个耗能的过程控制耐盐基因在转基因植物中表达的 时间及空间特异性对与植物耐盐同样具有于十分重要的意义。参与植物耐盐的基因种类很 多，目前还很难将这么多的基因同时转移到一种植物中并使它们的表达具有时空特异性。参 与植物对胁迫信号传导的基因在引起植物对环境胁迫的协调反应方面发挥了重要作用。这些 基因可以控制其他胁迫相关基因的表达，在植物耐盐基因工程研究中可能具有重要应用价 值。此外，参与植物耐盐相关基因表达调控的反式作用因子可与相应的顺式转录控制元件相 互作用。控制功能上相关基因的表达，在植物耐盐转基因研究中有较大应用潜力。 随着植物耐盐机制研究的不断深入，利用转基因技术和其它手段结合，必将培育出