（作物遗传育种专业论文）转bar基因水稻向普通野生稻的基因漂流研究.pdf

内容提要 自1 9 9 4 年我国获得世界首例转基因水稻以来，水稻基因工程取得了突飞猛进的发 展，获得了一批具有优良农艺性状的转基因水稻。但是由于国际贸易和安全性评估数据 尚不完善，因而转基因水稻并没有批准商业化生产，个别材料进入了生产性试验，整体 仍停留在环境释放阶段，转基因水稻的环境安全性问题及其争论已成为其商业化应用的 瓶颈。普通野生稻是水稻育种和改良的重要遗传资源，由于人为等因素的影响，目前中 国多数普通野生稻原生境已遭到破坏，自然居群大量丧失，普通野生稻已经被列为我国 二级保护的渐危种。普通野生稻和亚洲栽培稻具有相同基因组，和转基因水稻之间存在 发生基因漂流的可能性。因此，转基因水稻的安全性评估显得十分重要，尤其是对普通 野生稻影响的生态安全性评估。本文从两个方面研究了转b a r 基因水稻向普通野生稻的 基因漂流，为评估转基因水稻田间推广后所产生的生态安全问题提供重要参数。 首先，以转施堪因粳型水稻品种b 2 为花粉供体，以普通野生稻作为花粉受体材料 进行田间试验，研究转基因水稻向普通野生稻的基因漂流频率及最大距离。结果表明， 转幻瑾因水稻向普通野生稻的基因漂流频率在花粉源与野生稻近距离种植( 0m ) 时， 测得的基因漂流频率最大，其中玻利维亚普通野生稻为5 0 2 0 7 ，高州普通野生稻为 1 6 8 5 7 ，玻利维亚普通野生稻高于高州普通野生稻，且不同距离上的基因漂流频率始 终是玻利维亚普通野生稻大于高州普通野生稻；转6 瑾因水稻向高州普通野生稻最远 的基因漂流距离达2 0 0m ，向玻利维亚普通野生稻最远的基因漂流距离达2 5 0m 。两种材 料都是随着距离的增加，漂流频率有降低的趋势。 其次，以b 2 为花粉供体，不同居群的普通野生稻为花粉受体，包括云南元江普通 野生稻、广西来宾普通野生稻、广西桂平普通野生稻、广东高州普通野生稻、江西东乡 普通野生稻和马来西亚普通野生稻，在小范围试验地研究转b a r 基因水稻向不同居群普 通野生稻基因漂流频率。结果表明，转基因向高州普通野生稻的基因漂流频率最高，达 1 3 8 4 6 ，向东乡普通野生稻基因漂流频率最低，为2 2 2 2 ，其他均介于4 一1 1 之 间，分别为元江普通野生稻5 7 6 9 、桂平野生稻1 0 2 6 7 、来宾普通野生稻1 0 4 4 8 和 马来西亚普通野生稻4 2 2 。 主题词：转基因水稻普通野生稻基因漂流生物安全 a b s t r a c t s i n c et h ef i r s t 仃a n s g e n i cr i c ew a gd e v e l o p e db yc h i n ai n1 9 9 4 ，t r a n s g e n i cf l e eh a gw e l l d e v e l o p e d as e r i e so ft r a n s g e n i cr i c eh a sb e e nd e v e l o p e dw i t hd i f f e r e n tf e a t u r e s a st h e e x i s t i n gp r o b l e mo fb i o s a f e t yo ft r a n s g e n i cr i c e ，i th a sn o tb e e na p p r o v e df o re x t e n s i v e c o m m e r c i a lc u l t i v a t i o n c o m m o nw i l dr i c e ，as i g n i f i c a n t8 0 u r c ef o rb r e e d i n go fr i c eh a sb e e n l i s t e da se n d a n g e r e dp l a n tf o rm o s ti n ns i t ue n v i r o n m e n t sa r el o s tb yt h ei n f l u e n c eo fh u m a n e l e m e n t s f o ri ta l s os h a r e st h es a l n eg e n o m ew i t ha s i a nc u l t i v a t e dr i c e ，t h e r ei sp o s s i b i l i t yo f g e n ef l o wb e t w e e nt h e m t h e r e f o r e ，i ti ss e r i o u st oe v a l u a t i n gt h eb i o s a f e t yo ft r a n s g e n i cr i c e ， e s p e c i a l l yf o re c o - s a f e t yt oc o m m o nw i l dr i c e i nt h i sa r t i c l e t h er e s e a r c ho fb a rg e n ef l o w f r o mt h et r a n s g e n i cr i c et oc o m m o nw i l dr i c ef r o mt w oa g p e c t sp r o v i d e ss i g n i f i c a n tp a r a m e t e r f o re v a l u a t i n gt h ee c o l o g i c a le f f e c t sw h e nt h et r a n s g e n i cr i c ei sc o m m e r c i a l i z e d f i r s t l y , w eu s e dt h eb a rt r a n s g e n i cr i c eb 2a sd o n o ro fp o l l e n sa n dw i l dr i c ea sr e c e p t o r st o m e a s u r et h ef r e q u e n c ya n dm a x i m a ld i s t a n c eo fg e n ef l o wf r o mt r a n s g e n i cr i c et ow i l dr i c e b a s e do nt h eg e n ef l o wf r e q u e n c yo fd i f f e r e n td i s t a n c et od o n o r , t h er e s u l ti n d i c a t e st h a tw h e n t h ed i s t a n c ee q u a l sw i t h0 m ，t h ef r e q u e n c yi s1 6 8 5 7 a n d5 0 2 0 7 t og a o z h o uw i l dr i c ea n d b o l i v i aw i l dr i c er e s p e c t i v e l y t h ef r e q u e n c yi sa l w a y sh i g h e rf o rb o l i v i aw i l dr i c ea td i f f e r e n t d i s t a n c e t h em a x i m a ld i s t a n c eo fg e n ef l o wf r o mt r a n s g e n i cr i c et ow i l dr i c ec a l lr e a c h2 0 0 m a n d2 5 0 m t ob o t ht h ec o m m o nw i l dr i c e ，t h em o r ed i s t a n c ea w a yf r o mt h ep o l l e ns o u i c e ，t h e l o w e rf r e q u e n c yo fg e n ef l o w s e c o n d l y , r e s e a r c ho nt h eg e n ef l o wf r e q u e n c yo fb a rt r a n s g e n i cr i c et oc o m m o n w i l dr i c e o fd i f f e r e n tp o p u l a t i o ni ns m a l le x p e r i m e n t a la r e a w ea l s ou s e dt h eb 2a sd o n o ro fp o l l e n s a n dc o n l n l o nw i l dr i c eo fd i f f e r e n tp o p u l a t i o na sr e c e p t o r s ，i n c l u d i n gy u a n j i a n gw i l dr i c e l a i b i nw i l dr i c e ，g u i p i n gw i l dr i c e ，g a o z h o uw i l dr i c e ，d o n g x i a n gw i l dr i c ea n dm a l a y s i a w i l dr i c e t h ee x p e r i m e n t a ld a t ai n d i c a t et h e r ei sh i 【g h e s tg e n ef l o wf r e q u e n c yt og a o z h o u w i l dr i c e1 3 8 4 6 a n dl o w e s tf r e q u e n c yt od o n g x i a n gw i l dr i c e2 2 2 2 t h eo t h e r sa r e b e t w e e nt h e ma b o u t4 一l l ：y u a n j i a n gw i l dr i c e5 7 6 9 ，g u i p i n gw i l dr i c e1 0 2 6 7 。 l a i b i nw i l dr i c e1 0 4 4 8a n dm a l a y s i aw i l dr i c e4 2 2 k e yw o r d s ：t r a n s g e n i cr i c e ，c o m m o nw i l dr i c e ，g e n ef l o w , b i o s a f e t y n 海南大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原刨性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。 除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品或成果。 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人 承担。 论文作者签名： 静个 日期：多叼年月1 日 学位论文版权使用授权说明 本人完全了解海南大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有 关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权海南大学可以将本学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和 汇编本学位论文。本人在导师指导下完成的论文成果，知识产权归属海南大学。 保密论文在解密后遵守此规定。 本人已经认真阅读a i i s 高校学位论文全文数据库发布章程”。同意将本人的学位论文提交 c a i 腮高校学位论文全文数据厍”中全文发布，并可按“章程”中规定享受相关权益。回童逾塞埕銮 匿遗匠 目圭生；巳= 生i 目三生蕴亚。 论文作者签名： 日期：纠年 导师签 日期： 砷护 静肌 1 序言 1 1 转基因水稻的研究进展 水稻是世界上重要的粮食作物，包括大多数发展中国家在内的约占全球总数4 0 的 人口以水稻为主要营养来源。但是由于全球人口的急剧增加，可耕作土地的减少，严重 制约了水稻的总产量和人均粮食占有量，从而威胁到人类的生存和发展。提高水稻产量 和质量，是粮食安全的有力保证，也是人类社会可持续发展的重要条件之一。在土地资 源有限的情况下，提高水稻生产能力的关键是依靠科技进步提高单位面积产量。目前要 进一步提高水稻的单产，必须依靠遗传育种技术进行品种改良。然而常规育种手段选育 周期长、抗病亲本缺乏，难以获得理想的优良品种。 植物基因工程利用现代科技将外源基因有目的、有计划地插入、整合到受体植物基 因组中并在受体植株中得到遗传表达，使受体植株获得新的性状，从而开辟了水稻育种 的新时代。自1 9 9 4 年我国获得世界首例转基因水稻以来，水稻基因工程取得了突飞猛 进的发展，获得了一批具有优良农艺性状的转基因水稻，特别是粳稻基因组第4 号染色 体的精确测序以及籼稻基因组精细图的完成更是奠定了水稻基因工程快速发展的坚实 基础。 1 1 1 水稻基因转化方法 1 1 1 1 农杆菌介导法 自z e m b r y s k i p ( 1 9 8 3 ) 【1 1 利用农杆菌转化烟草获得首例转基因植物以来，该方法在 双子叶植物中得到了广泛应用。此后，随着人们对农杆菌侵染机理的了解和转化技术的 改进，相继在多种单子叶植物中取得了成功，c h a r ti v r r ( 1 9 9 3 ) 2 1 首次报道利用农杆菌 转化水稻获得可育植株，此后开始了提高农杆菌转化水稻频率因素的研究。农杆菌介导 的基因转化利用的是一种能够实现d n a 转移和整合的天然系统，具有多重优点：转化 方法简单、转化效率高、再生植株可育率高、可转化较大片段d n a 、转入基因的低拷 贝数可降低同源抑制产生的基因沉默几率等。 1 1 1 2 基因枪转化法 该法的最大优点是转化材料广泛，细胞、组织和器官均可用作转化，而不受原生质 体培养的限制，从而减小了对基因型的依赖性，并且周期短，适用于水稻转化。目前利 用该方法在水稻转化中应用较多的转化材料有幼胚、胚性愈伤组织以及胚性悬浮细胞。 自1 9 8 8 年用基因枪法成功转化水稻悬浮细胞以来，一系列含不同外源基因的转基因水 稻相继问世( 黄大年，2 0 0 1 ) 3 1 0 当前，基因枪法已成为水稻遗传转化的可靠途径，但 是其存在价格昂贵，转化频率低，外源基因多拷贝整合，后代的遗传稳定性差，对大片 段基因难以导入以及机械方法导入随机性强等不足，因此需要进一步改进和完善。 1 1 1 3 花粉管通道法 该法避开了组织培养及植株再生过程，可以直接在田间进行整株操作，价格低，易 于推广，方法上也日趋成熟，并且发展出子房注射、d n a 直接涂抹柱头、供体花粉匀 浆涂抹柱头、受体花粉与供体d n a 混合后授粉以及直接将d n a 滴入小穗等技术。但 这一方法转化效率低，在操作上受到开花季节的限制，而且对后代的筛选工作量很大。 马静( 2 0 0 6 ) 【4 】采用花粉管通道法和穗茎节导入法，将野生稻等外源d n a 导入宁夏水 稻品种中，初步研究了不同受体在对外源d n a 的介入和整合能力上的差异。 1 1 1 4 其他 脂质体转化法是用人工合成的、类似生物膜结构功能特性的脂类化学物质( 脂质 体) ，将d n a 包裹成球体，通过植物原生质体的吞噬或融合作用把d n a 转入受体细 胞。朱祯等( 1 9 9 2 ) 【5 】利用脂质体转化法成功地将含有人a 。干扰( h u - a - 硝) 的e d n a 导入籼稻中获得转基因植株。p e g 法的作用是在二价阳离子存在下促进原生质体对外源 d n a 的吸收，同时还保护外源d n a 免受核酸酶的降解。电击法用脉冲电激在细胞壁上 打孔，使基因能够通过。 综上所述，水稻基因转化方法大体可以归纳为两类：一是载体介导的转化，即利用 另一种生物来实现基因的转入和整合，主要方法就是农杆菌介导法；二是基因的直接转 化，即将裸露的d n a 直接转入水稻，包括基因枪法、花粉管通道法、电击法、p e g 法 和脂质体转化法等。总之，各种技术各有优缺点和适应范围，但是近年来应用较多的是 基因枪法和农杆菌介导法。 1 1 2 重要农艺性状基因在水稻改良中的应用 1 1 2 1 抗虫性转基因 目前应用于水稻抗虫性改良的外源基因主要有三种( 蒋家焕，2 0 0 3 ) 1 6 1 ：一是苏云 金杆菌杀虫结晶蛋白基因( 西) ，b t 毒蛋白基因是目前应用最为广泛的毒蛋白基因，其 杀虫机理在于该基因使转基因株系合成一种对昆虫有毒的内毒蛋白，b t 菌系含有大量不 同的杀虫晶体蛋白编码基因，目前已经有约1 8 0 个不同的b t 杀虫蛋白基因被克隆并被 广泛应用于水稻抗虫改良方面的研究，如c r y l a ( b j 、c r y i a ( c ) 等。二是豇豆胰蛋白酶抑制 剂基因( c p t i ) ，该基因表达的蛋白酶抑制剂能专一地与某一类消化酶结合，影响昆虫 的消化作用，同时引起昆虫体内蛋白酶产生，造成必需氨基酸亏空，破坏其正常生理功 能，从而导致昆虫发育受阻或者死亡；此外它们还可以引起昆虫体内水分平衡失调，影 响酶的调节及昆虫蜕皮。三是植物凝集素基因，主要有豌豆外源凝集素基因( p _ l e c ) 和雪莲外源凝集素基因( g n a ) 。 1 1 2 2 抗病性转基因 抗病转基因主要针对真菌病、细菌病、病毒病和线虫等( 蒋家焕，2 0 0 3 ) 1 6 。水稻 真菌性病害包括稻瘟病和纹枯病，将抗稻瘟病和纹枯病的基因导入水稻基因组中并获得 转基因植株已见报道。水稻细菌性病害是世界范围内发生的病害，目前在抗水稻细菌性 病害转基因研究方面比较成功的是c e c r o p i nb 基因和x a 2 1 基因等的遗传转化。水稻抗 2 病毒的转基因主要以研究病毒外壳蛋白基因( c p ) 为主。水稻抗线虫性病害转基因的报 道较少。 1 1 2 3 抗逆性转基因 逆境影响和限制水稻生长和产量形成，近年来关于水稻抗逆转基因的研究包括抗 旱、抗寒、耐盐、抗重金属胁迫等。段苏然( 2 0 0 6 ) 【7 】将编码大麦p a p x 的基因h v a p x l 导入水稻并过量表达，可以提高转p a p x 水稻对镉胁迫的耐性。赵凤云( 2 0 0 6 ) 嘲利用 农杆菌介导法将盐地碱蓬的c s t ( 谷胱甘肽转移酶) 单基因和g s t + c a t i ( c a t a l a i ) 双 基因转入低温敏感水稻，增强水稻幼苗对低温胁迫的抗性。李南羿( 2 0 0 6 ) 【9 】采用基因 枪法将耐盐的转录因子o p b p l 和o s i w r k y 基因共转化水稻并超表达，提高水稻的耐盐 及抗病能力。 1 1 2 4 抗除草剂性转基因 抗除草剂是植物基因工程最早涉及的领域之一，将抗除草剂基因导入水稻使其产生 对除草剂的抗性，有助于水稻田间杂草的控制( 王关林，2 0 0 1 ) n 川。目前已经获得了抗 草丁膦( p h o s p h i n o t h i c i n ) 的b a r 基因和p a t 基因，抗草甘膦( g l y p h o s a t e ) 的a r o a 基因 等3 类抗除草剂转基因水稻植株。其中，b a r 基因是目前主要应用的抗除草剂基因，b a r 基因编码瞵丝菌素乙酰转移酶( p h o s p h i n t h r i e i na c e t y l t r a n s f e r a s e ，p a t ) 可以使草丁膦的 自由氨基乙酰化，使之不能抑制谷氨酰胺合成酶( g l u t a m i n es y n t h e t a s e ，g s ) ，从而对草 丁瞵显示抗性。 1 1 2 5 其他 在利用转基因技术进行水稻品质改良方面，主要是提高营养品质和改善口感。利用 现代基因工程，水稻还可以作为生物反应器，生产疫苗、p 胡罗卜素等具有高经济附加 值的医用蛋白、工农业用酶、特殊碳水化合物、生物可降解塑料、脂类及其它一些次生 代谢产物。此外，为了提高水稻产量，可以改造光合代谢过程，将高光效c a 植物的磷 酸烯醇式丙酮酸羧化酶( p e p c ) 基因和二磷酸核酮糖羧化酶( r u b p c ) 基因导入水稻 ( c 3 植物) 中，提高水稻叶片中的光合效率( 李霞，2 0 0 1 ) h i 。在水稻雄性不育基因 的转化方面，v a n d e r m e e t i m ( 1 9 9 2 ) 【l 习用c h s 基因的反义r n a 转化水稻，使转基因 水稻花药形成过程中因不能合成黄酮而导致花粉败育，最终获得雄性不育植株。 1 1 3 外源基因在转基因水稻中的表达和遗传 外源基因导入后的表达调控受到启动子的影响，根据作用方式及功能可将启动子分 为3 类：组成型启动子、组织特异型启动子和诱导型启动子( 李杰，2 0 0 4 ) 1 3 1 组成型 启动子( c o n s t i t u t i v ep r o m o t e r ) 是指在该类启动子控制下，结构基因的表达大体恒定在 一定水平上，在不同组织、部位表达水平没有明显差异组织特异型启动子( t i s s u e s p e c i f i cp r o m o t e r ) 又称器官特异性启动子，在这类启动子调控下，基因往往只在某些特 定的器官或组织部位表达，并表现出发育调节的特性。诱导型启动予( i n d u c i b l ep r o m o t e r ) 是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下，该类型的启动子可以大幅度地提高基因的 转录水平。此外，研究显示外源基因在转基因植株中一般作为显性基因，符合孟德尔遗 传分离规律，即自交表现3 ：1 分离，回交表现1 ：1 分离，从而稳定遗传到高世代并予以表 达；但也存在不符合上述规律的现象，由于基因沉默等原因使转入的基因不能正常表达， 或不能在后代中稳定遗传，或导致植物不育( g a h a k w ad ，2 0 0 1 ) 1 1 4 。 1 1 4 转基因水稻存在的问题 转基因水稻的安全性问题，包括环境安全问题和食品安全问题等，目前正在进行研 究之中。尽管部分转基因水稻品种在技术上已经成熟，但由于转基因水稻的安全性评估 数据尚不完善，对转基因水稻的安全性问题仍存在争论，所以转基因水稻的研究仍然处 于试验阶段，没有批准转基因水稻新品种进入大规模商业化生产( 杨庆文，2 0 0 3 ) 【l ”。 1 2 普通野生稻概述 1 2 1 普通野生稻的分类地位和命名 稻属( 0 r y z al ) 隶属于禾本科( g r a m i n e a e ) 稻族( o r y z e a ed u m o f f ) ，是一个仅 有2 0 多个种的小属。对稻属植物的分类，大多数学者利用不同技术进行的研究结果能 够互相验证，但因为所用的材料往往不一致或不系统，无法形成一个完整的分类体系。 因此，v a u g h a n ( 1 9 8 9 ，1 9 9 4 ) 【l 卅7 1 在总结众多学者稻属分类研究结果的基础上将稻属 划分为2 2 个种，其中包括2 个栽培稻和2 0 个野生种，并分为四个种复合体以及两个独 立的种。四个种复合体是：d r i d l e y i ，d m e y e r i a n a ，d f f i c i n a l i s 和d s a t i v a 。其中， d s a t i v a 复合体包括所有a a 基因组的种，并含有普通野生稻和两个栽培稻种：亚洲栽 培稻( d s a t i v a ) 和非洲栽培稻( d g l a b e r r i m a ) 。 普通野生稻是世界上分布最广的稻属野生种，其自然繁殖地大多接近稻田，由于野 生稻和栽培稻自然杂交类型的多样性，在分类学上仍然存在有待解决的问题。国际上普 通野生稻的分类和命名十分混乱，迄今分布在亚洲、美洲和大洋洲的普通野生稻有1 5 个 命名。其中常用的普通野生稻学名是：o r y z as a t i v aif s p o n t a n e a ，dp e r e n n i sm o e n c h 和d r u f i p o g o ng f i 仟等( 范树国，2 0 0 0 ) 【埘。吴万春( 1 9 8 0 ) 【1 9 1 等人认为我国普通野生 稻的拉丁学名应为d r u f i p o g o ng r i f f 。 1 2 2 我国普通野生稻的分布及其生物学特征 中国是世界上原产普通野生稻的主要国家之一。早在1 9 1 7 年，m e r r i l l 就在广东省 东江中下游地区罗浮山麓至石龙平原发现了普通野生稻；1 9 2 6 年，丁颖在广州郊区犀 牛尾的沼泽地也发现此种。普通野生稻在我国海南、云南、湖南、广西、广东、江西、 福建、台湾8 个省区均有分布，范围为北纬1 8 0 0 9 - 2 8 0 1 4 ( 海南省三亚市至江西东乡县 东源) ，东经1 0 0 0 4 0 - 1 2 1 0 1 5 ，( 云南省景洪县至台湾省桃园县 。普通野生稻在不同的海 拔以及不同的生态环境，由于光照、温度和土质等因素的影响，具有不同的分布，通常 分布海拔为2 5 5 5 2 7m ，多数分布在海拔1 3 0m 以下的地方。普通野生稻属喜温、喜 湿、喜光的多年生沼泽植物，对土壤要求不严( 全国野生稻资源考察协作组，1 9 9 0 ) 2 0 1 。 4 普通野生稻俗名较多，多称鬼禾或野禾。根有强大的须根系；茎有匍匐、倾斜、直 立和半直立四种类型，具高位分支，一般为1 0 0 - 2 5 0c m ，地上茎有缸1 2 个，茎基部节 间呈紫、红色，分蘖力强；叶披针形狭长，具茸毛，叶舌膜质，顶都尖二裂，成熟期茎 叶衰老迟而慢；穗属圆锥花序，穗枝散生，枝梗少，每穗2 0 - 6 0 粒；谷粒狭长，快开花 时内外颖淡绿色，成熟时灰褐色，玻璃质，米质好；外稃乳突横向及纵向排列都很整齐， 列较宽，乳突座分离，乳突座间距较小，有许多小瘤状突起均匀而整齐地排列在每列两 侧的边缘，即“中间型”双峰乳突，也有报道无小瘤状突起。 1 2 3 普通野生稻的遗传多样性 遗传多样性( g e n e t i cd i v e r s i t y ) 广义上是指地球上所有生物所携带的遗传信息的总 和，狭义上则是指种内不同群体和个体间的遗传多态性的程度，或称遗传变异( 马克平， 1 9 9 4 ) f 2 ”。遗传多样性的研究具有重要的理论和实际意义。首先，物种和居群的遗传多 样性大小是长期进化的产物，是其生存( 适应) 和发展( 进化) 的前提；其次，遗传多 样性是保护生物学研究的核心之一。遗传多样性的研究经历形态学、细胞学和生化标记， 发展到现在的d n a 分子标记技术，人们对生物多样性的研究更加准确和深入。近年来， 国内外运用d n a 分子标记技术对普通野生稻遗传多样性的研究取得了很大的进展。 对于普通野生稻与栽培稻之间的遗传关系，研究结果表明普通野生稻的遗传多样性 明显高于栽培稻，说明从普通野生稻演化成栽培稻的过程中，经过自然选择和人工选择， 遗传多样性显著降低。因此，普通野生稻是比栽培稻蕴藏着更加丰富基因多样性的遗传 资源宝库。孙新立( 1 9 9 6 ) 1 2 2 利用同工酶研究了6 8 0 份栽培稻和8 8 份中国普通野生稻 的遗传多样性，发现普通野生稻的遗传多样性高于栽培稻。孙传清( 2 0 0 0 ) 1 2 3 利用分子 标记从多态位点的比率、等位变异数、平均基因杂合度及平均基因多样性等多个方面， 对普通野生稻和亚洲栽培稻的遗传多样性进行的比较结果也支持上述结论。 1 2 4 我国几种不同居群普通野生稻介绍 居群是指在特定空间里能自由交配繁殖后代的同种个体的集合，它既是变异的单 位，又是适应的单位( 周纪纶，1 9 9 2 ) 渊，也可以定义为“在某一特定时刻占据某一特 定空间的一群同种的生物”( m e r r e ld ，1 9 9 1 ) 2 s 】。根据该定义，居群表现为个体之间 能够自由交配，使它们共享一个基因库，从而产生种内的遗传多样性，以提供自然和人 工选择机会，形成物种的进化。反言之，如果不具备自由交配的可能性，就可视为不同 的居群。 中国普通野生稻分布的8 个省区中，包括了海南岛区、两广大陆区( 包括两广大陆、 湖南的江永和福建的漳浦) 、云南区( 景洪和元江) 、湘赣区( 湖南的茶陵和江西的东乡) 、 台湾区( 桃园和新竹) 。经过1 9 6 3 年以及1 9 7 8 1 9 8 2 年的普查与考察，中国科学家收集 到大批野生稻资源，编写了中国稻种资源目录( 野生稻种) 。其中收录普通野生稻3 7 3 3 份l ”】，此目录主要包括学名、采集地、生长习性、始穗期、茎基部色、叶舌形状、芒性、 柱头色、花药长度、地下茎有无、内外颖色、种皮色、外观品质、百粒重、谷粒长宽、 生育周期、抗病性等2 0 多个项目，对各居群普通野生稻特征特性进行了描述。 云南省原具有2 5 个普通野生稻居群，目前已经有2 4 个消失，仅在玉溪地区元江县 东峨镇的曼旦村保存有一个野生居群，即元江普通野生稻，位于北纬2 3 0 2 6 7 ，东经 1 0 2 0 0 9 ，海拔7 8 0 m ，是目前发现的海拔最高的普通野生稻分布点。元江普通野生稻为 多年生，具有匍匐茎；根系发达，多而粗，宿根性多年生；茎态散生，匍匐或半直立， 株高5 3 1 7 9c m ；叶狭长；穗形散，穗长和穗颈长度不一；颖花为两性花，雌蕊呈羽毛 状，柱头有紫色和白色，外露率1 0 0 。杨庆文( 2 0 0 4 ) 【2 6 1 用3 0 对微卫星引物，对海 拔最高且与栽培稻隔离较好的云南元江普通野生稻进行分析，结果表明：该地3 个普通 野生稻自然居群均具有较高的遗传变异水平，且群体遗传分化系数较大，即元江普通野 生稻居群内遗传多样性比较丰富。 广西是我国普通野生稻的主要自然繁殖地，普通野生稻分布于4 3 个县市，分布区 内的生态环境极其多样，由大小不一的居群组成的庞大居群体系散布在多样化的生境 中，位于北纬2 l o 一2 6 0 ，海拔2 - 1 7 0m ，从而为野生稻居群间与居群内的分化提供了条 件。广西普通野生稻的形态变异复杂，在形态学水平上具有丰富的遗传多样性；此外， 同功酶分析、r d n a 分析和s s r 分析等也表明广西普通野生稻的遗传多样性较高( 余萍， 2 0 0 4 ) 2 7 1 。 高州普通野生稻是目前广东省普通野生稻分布面积最大的一个野生稻居群，约3 0 0 亩，分布于北纬2 1 0 4 2 3 4 一一2 2 0 1 8 4 8 ”，东经1 1 0 0 3 6 4 8 ”一1 1 1 0 2 2 4 5 ”。属南亚热带与北热 带的过渡地带，其生长习性为水生性，无明显越冬期，四季常绿，一年抽穗一次，穗小、 结实率低，米粒呈褐色，边抽穗、边成熟、边落粒，具有抗病力强、抗虫力强、耐寒性 强、耐瘠薄性强等特性，是宝贵的稻种资源。杨培周( 2 0 0 6 ) 哪j 等对高州普通野生稻主 要生殖性状的数理统计分析，发现不同居群的生殖特性呈显著差异，表现出明显的生殖 多样性。s s r 标记分析其遗传多样性和居群遗传分化表明高州野生稻的遗传多样性主要 来自居群内，并且有可能是中国华南普通野生稻的一个分化中心( 李晨，2 0 0 6 ) 1 2 9 1 。 东乡普通野生稻分布在北纬2 80 1 4 、东经1 1 6 0 3 6 ，海拔4 7 6m 的小低丘地区，是迄 今中国乃至世界上分布最北的野生稻种资源( 陈大洲，2 0 0 2 ) 3 0 l 。东乡野生稻为多年生 宿根，具有匍匐茎，穗形散，穗长及穗颈长度不一，柱头紫色外露，属于对光反应敏感 类型，生育期为9 月初开始见穗，陆续抽穗直至1 1 月上旬，结实率为1 0 1 3 - 8 0 ，花粉育 性正常。东乡作为东乡普通野稻的原生地，1 月平均气温5 2 ，极端最低气温8 5 ， 普通野生稻的地上部分全部枯死，但近地表的茎秆及地表以下茎节仍有生命力，每年2 月下旬或3 月初萌发，耐冷性极强，潜在利用价值很高。在1 9 7 8 - 1 9 8 2 年的野生稻普查中， 先后在东乡县发现9 个野生稻群落，总计面积2 3h m 2 ，然而至2 0 0 0 年1 0 月底，原生地居 群已锐减至3 个，东乡野生稻正濒临灭绝。 玻利维亚普通野生稻是原产于亚洲、引自南美洲玻利维亚的一年生普通野生稻( d n i v a r a ) ，属于从基因组。玻利维亚特立尼达处于南美洲内陆地带，位于南纬1 5 0 ，西经 6 6 5 0 ，海拔2 0 0m ，属于热带草原性气候。玻利维亚野生稻具有发达的须根系，茎直立型， 叶片长而较狭，外颖顶端有紫红色的芒；衍生类型差别较大，类型较多，茎态有较紧凑 的，也有松散的。茎秆有粗的，有细的。分蘖有特强的，有中等的。更重要的是育性分 化明显：有高度不育型、半不育型，也有花粉正常和结实较高，而其它性状相类似的。 种子有较长的休眠期，成熟后的谷粒具有高度耐浸性( 符福鸿，1 9 9 1 ) 3 1 o 1 2 5 普通野生稻的濒危与保护 普通野生稻是亚洲栽培稻最近缘的野生种，由于长期处于野生状态，经受各种灾害 和环境的自然选择，形成了丰富的变异类型，对水稻病虫害有较强的抗性，对环境有较 强的适应性，并具有优质、高产、氮磷高效利用、广亲和及雄性不育等优良基因，是水 稻育种和改良的重要遗传资源。 然而，由于人为等因素的影响，中国多数普通野生稻原生境已遭到破坏，自然居群 大量丧失，目前中国普通野生稻已经列为我国二级保护渐危种。九五期间中国农业科学 院初步调查，我国2 0 世纪8 0 年代发现的普通野生稻分布点6 0 7 0 已经消失。如： 云南省原具有的2 5 个普通野生稻居群，已经有2 4 个消失，仅在玉溪地区元江县东峨镇 的曼旦村保存有一个野生居群。因此，加强对普通野生稻的保护刻不容缓。我国对普通 野生稻种质的保护主要有异地保存( e x s i t u c o n s e r v a t i o n ) 和原位保存( ns i t u c o n s e r v a t i o n ) ( 范树国，2 0 0 2 ) 3 2 1 两种。 1 3 转基因稻向栽培稻及其稻属植物的基因漂流研究进展 世界稻米生产国有1 2 2 个之多，栽培面积自7 0 年代起常年约2 1 2 2 亿亩。稻米在 全球粮食生产和消费中占有十分重要的地位，约有半数人口以此为主食。水稻的特点是 适应性广、单产高、营养好、用途多等。6 0 年代以来，虽然全球稻作面积和产量均有较 快增长，但因人口的迅速增长，人均稻米占有量并未改观，粮食发展问题始终不能掉以 轻心。随着1 9 8 3 年首例转基因植物问世，植物基因工程已经取得了令人瞩目的成就， 转基因水稻的研制技术也日渐成熟，出现了一系列的转基因水稻新品种，并将在生产上 应用，为世界粮食发展做出贡献。但是，任何技术都有其两面性，转基因水稻也不例外， 尤其是其环境安全性不容忽视。由于国际贸易和安全性评估数据尚不完善，因而转基因 水稻并没有批准商业化生产，个别材料虽进入了生产性试验，而整体仍停留在环境释放 阶段，转基因水稻的环境安全性问题已成为其商业化应用的瓶颈。因此，转基因水稻的 安全性评估就显得十分重要，尤其是生态安全性评估( 卢宝荣，2 0 0 3 ) f 3 ，】。转基因水稻 的安全性评估包括其生存竞争性、生殖隔离距离、与近缘野生种的可交配性以及对非靶 标生物的影响等。 1 3 1 转基因稻安全性及其评估方法 目前通过农杆菌介导法、基因枪转化法、p e g 法、电击法、花粉管通道法以及其他 方法已经获得的转基因稻涉及的主要性状为抗除草剂、抗虫、抗病、抗逆性和品质改良 7 等农艺性状。近年来应用较多的转化方法是基因枪法和农杆菌介导法( 蒋家焕，2 0 0 3 ) 6 1 。其中基因枪转化的最大优点是转化材料广泛，细胞、组织和器官均可用作转化，而 不受原生质体培养的限制，从而减小了对基因型的依赖性，这是它适用于水稻转化的主 要原因。但是相对于能够实现d n a 转移和整合的天然系统，以及具有高效率水稻基因 转化的农杆菌转化方法来说，基因枪转化法存在价格昂贵、转化频率偏低，导入的外源 基因拷贝数较高，在后代中容易丢失，对片段较大的基因难以导入且嵌合体不易排除等 缺点。外源基因在水稻体内的表达水平受许多因素的影响，如分子元件、启动子等，多 数实验表明，外源基因能稳定遗传到高世代并予以表达，符合孟德尔遗传分离规律，即 自交表现3 ：1 分离，回交表现1 ：1 分离( g a h a k w a d ，2 0 0 1 ) 1 4 1 转基因植物外源基因漂流是指用遗传工程方法转移到植物中的单个或多个外源基 因通过基因漂流而转移到非转基因植物的现象。目前发现外源基因漂流存在三种可能的 途径( 王忠华，2 0 0 1 ) 刚：通过花粉传播在空间上漂流，通过种子在时间上逃逸，食物 链的传递，这里还包括转基因植物根系分泌物和残枝落叶在土壤中的残留。其中转基因 植物中花粉的散布成为外源基因逃逸的主要渠道之一，因为目前大多数转基因植物的培 育采用组成型启动子，使得外源基因在所有组织和器官中均有表达。目前对于转基因稻 外源基因的漂流研究也仅仅停留在花粉漂流上。通常转基因稻的外源基因发生逃逸的条 件( l ub r ，2 0 0 5 ) 1 3 5 有：空间上，转基因稻和非转基因稻或野生近缘种分布重叠或相 邻生长；时间上，转基因稻和和非转基因稻或野生近缘种花期、花时相遇，即一年之内 的开花时段和一天之内的开花散粉时间相遇。此外，转基因稻和普通野生稻在生物学上 有一定的杂交亲和性，且杂种后代能正常繁殖。从分类上看，禾本科( p o a c e a e ) 稻族 ( o r y z e a e ) 稻属( o r y z al ) 包含两个栽培稻：亚洲栽培稻( d s a t i v a ) 和非洲栽培稻 ( d g l a b e r r i m a ) ，亚洲栽培稻属于从基因组型，与普通野生稻亲缘关系较近，容易 发生基因漂流；而对于其他基因组型，如b b ，c c ，b b c c ，c c d d ，髓，f f ，g g ，j j i - t h 和j j k k 之间往往存在生殖隔离，很难发生天然杂交。 转基因水稻中的外源基因是否发生漂流及漂流程度，通过基因漂流频率来衡量( 宋 小玲，2 0 0 3 ) 【鄹8 j o 期。其试验设计一般是在实验地中心设一个转基因稻样方，周围种 植非转基因稻或其亲缘种，于水稻成熟期在不同方向、不同距离上取一定面积的样方或 一定数量的植株或种子，分析植株或成熟种子中转基因存在的频率，作为转基因传粉的 频率；也可采用转基因稻和非转基因稻隔行种植和混合种植的田间设计。检测手段采用 形态学特征分析，细胞学方法( 如减数分裂和染色配对分析) ，蛋白质及同工酶电泳分 析，d n a 分子标记技术( 包括p c r 、s o u t h e r n 杂交、a f i , p 、r a p d 、r f l p 和d n a 测 序等) 以及统计分析方法。一般这些研究方法并不是孤立的，而是相互渗透、相互结合 的。但是宋小玲( 2 0 0 5 ) 口7 】等提出上述田间实验设计与外界环境有明显的相关性，经历 周期长，试验规模较大，田间试验往往要收集大量的花粉接受种的种子，大量的种子需 要再一次种植才能检测到是否有携带抗性基因在杂交种中产生，这无异于大海捞针，盲 目性较大，收获过程往往容易丢失种子，这些丢失的种子中就可能有携带抗性基因的杂 交种，造成试验结果的不可靠性，也容易造成环境污染，而且不能明确发生杂交的首要 条件，即种和种的亲和性，不能明确杂交不亲和的具体原因和时期，不能早期客观、快 速地评价基因流动，因此提出了以亲和性为依据的抗性基因流的评估方法 1 3 2 转基因稻向栽培稻的基因漂流 转基因稻和非转基因栽培稻之间如果发生基因漂流，将降低非转基因栽培稻的纯 度，无疑会增大转基因稻的分布，从而改变二者在农业生态系统中的布局，同时带来难 以预测的环境风险，甚至引起一些法律、法规方面的纠纷和国际政治、经济影响等。j i a s r ( 2 0 0 7 ) 【3 8 1 等以带b a r 基因水稻品种为花粉供体，常规稻、杂交水稻和不育系作为花 粉受体研究了转基因漂流规律，数据表明转基因向不育系的漂流频率大，而向常规稻和 杂交稻的漂流频率较低，这是由于不育系没有可育花粉、柱头外露率高、异交结实性好、 易于接受外来花粉，基因漂流频率高，其最大漂流距离可达3 0 0m 以上。结合杨庆文 ( 2 0 0 4 ) 3 9 1 、l ub r ( 2 0 0 5 ) 3 5 】、s o n gz p 【4 m 4 3 1 、r o n gj ( 2 0 0 5 ) 4 4 1 、c h e r tu ( 2 0 0 4 ) 4 5 1 、m e s s e g u e r j ( 2 0 0 1 ，2 0 0 4 ) 4 6 4 8 等对转基因稻基因漂流的研究，表明不同转基因稻 与不同栽培稻之间的基因漂流频率存在差别，并且两两材料之间，基因漂流频率在不同 方向上差别较大，顺风方向基因漂流频率大、逆风方向基因漂流频率小，而且随着距离 的增加，基因漂流频率明显下降。其中，与非转基因稻相比，转基因稻的传粉率有所下 降，当隔离0 5m 并用风扇作风媒时，转基因水稻的传粉率为4 ，而非转基因水稻传 粉率为9 ( a j i s a k ah ，1 9 9 4 ；t a d ay ，1 9 9 4 ) 【搏删。y u a nq h ( 2 0 0 7 ) 1 5 0 l 等利用水稻 不育系研究了不同方向上的基因漂流频率，结果显示不同方向上的基因漂流频率与风 向、风速以及花粉供体与受体材料所处的位置有关。在最大风速为4 2m s 时，转基因 向下风方向的相邻种植受体不育系的基因漂流