（作物遗传育种专业论文）蛋白质组技术在小麦谷蛋白分离与鉴定中的应用.pdf

摘要 小麦谷蛋白是面筋的主要成分之一，对加工品质有着重要决定作用。由于低分子量麦谷蛋白 亚基( l m w - g s ) 组成复杂，等位变异丰富，不同实验室间缺乏统一判定标准与命名，对l m w - g s 特别是g i u - a 3 和g i u - d 3 位点亚基的鉴定结果存在较大差异，单个l m w - g s 对品质的贡献大小 尚未达成共识。因此l m w - g s 弧基的标准命名体系与分离方法对于l m w - g s 的组成鉴定及与品 质的关系研究具有重要意义。收集了主要文献中常用于高分子量麦谷蛋白弧基( h m w - g s ) 和 l m w - g s 研究的国际小麦品种1 0 3 份以及我国秋播麦区主栽品种与高代品系2 3 3 份，利用十二烷 基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 技术以及蛋白质组核心技术双向电泳( 2 - d e ) 和基 质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术( m a u ) i - t o f _ m s ) ，分析h m w - g s 和l m w - g s 组成， 建立了l m w - g s 亚基的标准命名体系，验证了m a l d i t o f - m s 质谱技术在h m w - g s 和l m w - g s 鉴定中的应用潜力与可行性。主要结果如下： 1 同时利用s d s p a g e 、2 - d e 和m a l d i - t o f - m s 分析l m w - g s 组成，建立了l m w - g s 亚基 的标准命名系统。在l m w - g s 的鉴定中，2 一d e 分辨率最高，能够检测剑的等位变异最丰富， 2 d e 和m a l d i t o f - m s 皆能够准确鉴定g l u - a 3 位点的g l u - a 3 e 和g l u - a 3 f 弧基。此外，用 2 d e 能够检测出稀有亚基g l u - a 3 9 。三种方法对g l u b 3 位点亚基的鉴定结果基本一致。在 g l u - d 3 位点，s d s p a g e 检测到的g l u - d 3 d 亚基，用2 - d e 和m a l d i t o f m s 检测不到， 但用2 d e 检测剑了较g l u d 3 c 弧基少一个蛋白点的g l u d 3 c 基。共鉴定出2 2 个等位变异， 其中g 觑- a 3 位点7 个，包括g l u - a 3 a 、g l u - a 3 b 、g l u - a 3 c 、g l u - a 3 d 、g l u - a 3 e 、g l u - a 3 f 和 o l u - a 3 9 ，g i u - b 3 位点1 0 个，包括g 觑b 翔、g l u b 3 b 、g l u b 3 b 、g l u b 3 c 、g l u b 3 d i ( 表 示不能明确区分的亚基类型，下同) 、g l u b 3 9 、g l u b 3 9 + 、g l u - b 3 h 、g 觑召五+ 和g i u - b 3 j ，g l u - d 3 位点5 个，包括g l u - d 3 a 、g l u - d 3 b 、g l u d 3 c 、g l u - d 3 c * f h lo l u - o 弘 2 m a l d i - t o f - m s 是分析h m w - g s 组成的高效、快速质谱技术，对于g u b 1 位点等位变异如 7 a 。、7 b 、8 a 、8 b 4 和7 0 e 等s d s p a g e 不能区分的亚基鉴定特别有效，能够快速鉴定与超强 筋小麦密切相关的亚基7 0 e 。用m a id i - 1 o f - m s 质谱技术在g l u - a 1 、g l u b 1 和g l u d j 位点 分别检测到1 个、1 5 个和4 个等位变异，其中g l u - b 1 位点的等位变异包括6 + 8 b 、7 、7 + 8 、 7 + 8 a 、7 + 8 b 、7 a + + 8 、7 b + 8 、7 0 e 、7 0 e + 8 、7 0 e + 8 a + 、7 0 e + 8 b 、7 + 9 、1 3 + 1 6 、1 4 + 1 5o r2 0 和 1 7 + 1 8 亚基。在参试材料中检测到6 个7 + 8 a * 、6 个7 + 8 b 和4 个7 0 e + 8 a 。亚基，在a c a6 0 1 、 冀麦2 4 和绵阳9 4 0 1 1 2 中检测到7 0 e + 8 b 。弧基，在p r o 斟1 ai s l av e r d e 、济麦2 0 和o p a t a 中检 测到1 3 + 1 6 亚基，在e s h i m a s h i n d k i 和烟4 7 5 中检测到7 b + 8 亚基，在o r c a 中检测到7 单亚 基，在济麦1 9 中检测到7 a + 8 亚基。优质亚基7 0 b + 8 在我国小麦品种中的频率较低，仅为3 4 ， 这可能是我国小麦面筋品质较差的主要原因之一。 3 m a i d i - t o f - m s 质谱技术是l m w - g s 鉴定的重要方法之一，适于l m w - g s 的大规模鉴定， 在品种快速鉴定中具有广阔的应用前景。m a l d i - t o f - m s 质谱分析表明，l m w - g s 的分子 量约为3 0 - 4 3k d a ，g i u - a 3 位点亚基的特征峰主要分布于分子量较高的4 1 8 4 2 1k d a 区和 4 3 5 _ 4 3 8k d a 区，g l u - b 3 位点亚基的特征峰主要分布于4 0 1 枷2k d a 区和4 2 8 4 3 3k d a 区， g l u - d 3 位点亚基的特征峰主要分布于分子量较低的3 3 2 3 3 7k d a 区。m a u ) i - 1 d f m s 质谱 技术能够鉴定的l m w - g s 等位变异有1 5 个，g l u - a 3 位点5 个，包括g l u - a 3 a c ，g l u - a 3 b ， g 觑a 甜、g m - a 妇和g l u - a 3 f , g l u b 3 位点5 个，包括g 缸毋3 b ，g l u - b 3 d ，g l u - b 3 f g ，g l u b 3 h 和g l u - b 3 j ，g l u d 3 位点5 个，包括g z “- d 3 n 、g 地- d 鲐、g l u d 3 c 、g l u - d 3 c 馏和g l u d 3 f o 其中m a l d i t o f - m s 对g l u - a 3 e 和g l u - a 3 f 亚基的鉴定较s d s p a g e 有效。 本试验同时利用s d s p a g e 技术以及蛋白质组核心技术2 d e 和质谱技术分析l m w - g s 组 成，建立了l m w - g s 亚基的标准命名系统。首次利用m a l d i t o f - m s 质谱技术对我国秋播麦区 小麦品种的h m w - g s 和l m w - g s 进行人规模深入系统的研究，并与s d s p a g e 电泳结果相比较， 以进一步验证m a l d i t o f - m s 质谱技术在麦谷蛋白弧基的鉴定中应用的可行性与可靠性。上述 结果对小麦品质改良有重要指导意义。 关键词：普通小麦，蛋白质组，麦谷蛋白亚基，s d s p a g e ，双向电泳，m a i ，d i - t o f - m s ，加工 品质 a b s t r a c t h i g hm o l e c u l a rw e i g h tg l u t e n i ns u b u n i t s ( h m w - g s ) a n dl o wm o l e c u l a rw e i g h tg l u t e n i ns u b u n i t s ( l m w - g s ) p l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nd e t e r m i n i n gd o u g hq u a l i t ya st h e yc o n f e rv i s c o - e l a s t i cp r o p e r t i e s t ot h ed o u g hr e q u i r e df o rm i x i n ga n db a k i n gp e r f o r m a n c ei nc o m m o nw h e a t l m w - g sc o m p o s i t i o ni s o n eo ft h ec r i t i c a ld e t e r m i n a n t sf o rg l u t e np r o p e r t i e s h o w e v e r , t h en o m e n c l a t u r eo fg l u 3e n c o d i n g l m w - g sw a sn o tc o n s i s t e n ta m o n gl a b o r a t o r i e s ，d u et ot h ec o m p l e x i t yo fl m w - g sa n dd i f f e r e n t s e p a r a t i o nm e t h o d su s e db yr e s e a r c h e r s i ti sv e r yi m p o r t a n tt ou n i f yt h en o m e n c l a t u r es y s t e mf o r s h a r i n gi n f o r m a t i o na b o u tt h ee f f e c t so fi n d i v i d u a ll m w - g so ng l u t e np r o p e r t i e s i nt h i sw o r k ，as e to f 1 0 3w h e a tg e n o t y p e sf r o mt w e l v ec o u n t r i e s ，a n d2 3 3c h i n e s ew i n t e ra n df a c u l t a t i v ew h e a tc u l t i v a r sa n d a d v a n c e dl i n e sw e r eu s e dt oa n a l y z et h ec o m p o s i t i o no fh m w - g sa n dl m w - g sb ys d s - p a g e ，2 - d e a n dm a l d i - t o f - m sm e t h o d o l o g i e sf o re s t a b l i s h i n gas t a n d a r dn o m e n c l a t u r eo fl m w - g sa n dt e s t i f y t h e p o s s i b i l i t ya n dp o t e n t i a lo fi d e n t i f i c a t i o nh m w - g sa n di 腓g su s i n gm a u ) i - 1 1 0 f - m s t e c h n i q u e t h er e s u l t sw e r ep r e s e n t e db e l o w 1 t h es t a n d a r dn o m e n c l a t u r es y s t e ma n dm e t h o d st oi d e n t i f yg l u 一3a l l e l e sw e r ee s t a b l i s h e du s i n g s d s p a g e 2 一d ea n dm a id i - 1 o f - m s a n a l y s e s t h e2 - d em e t h o d o l o g yc u r r e n t l yu s e di n i d e n t i f i c a t i o no fl m w - g so f f e r e dm u c h g r e a t e rr e s o l v i n gp o w e r t h a ns d s - p a g ea n d m a l d i - t o f m sm e t h o d o l o g i e s t h i su n i q u ef e a t u r eo f2 - d ew a st h ee n o r m o u sp o t e n t i a lf o r a n a l y z i n gt h ea l l e l i cd i v e r s i t yi ng l u - b 3l o c u s i ti ss i g n i f i c a n tt h a tt h i sm e t h o d o l o g yi sa ne f f e c t i v e a n a l y t i c a lt e c h n i q u ei nd i s c r i m i n a t i n gs u b u n i t sg l u - a 3 da n dg l u - a 3 9 ，g l u - a 3 ea n dg l u - a 3 fa tg l u - a 3 l o c u s t h ea l l e l e so fg l u b 3l o c u si d e n t i f i e dw i t ht h r e et e c h n i q u e sw e r ec o n s i s t e n t a tg l u - d 3l o c u s ， a l l e l eg l u d 3 dw a so n l yd e t e c t e db ys d s p a g e ，w h i l ea l l e l eg l u - d 3 c 。l e s so n ep r o t e i ns p o tt h a n g l u - - d 3 cw a sd e t e c t e do n l yb yt h e2 - - d em e t h o d o l o g y t o t a l l y , 2 2a l l e l e sw e r ei d e n t i f i e db y2 - d e m e t h o d o l o g y a tg i u - a 3l o c u s ，s e v e na l l e l i cv a r i a t i o n si n c l u d i n gg l u - a 3 a ，g l u - a 3 b ，g l u - a 3 c ，g l u - a 3 d , g l u - a 3 e ，g l u - a 3 f a n dg l u - a 3 9w e r eo b s e r v e d a tg l u b 3l o c u s ，1 0a l l e l i cv a r i a t i o n si n c l u d i n gg l u - b 3 a ， g l u b 3 b ，g l u b 3 b + ，g l u b 3 c ，g l u - b 3 d l i ，g l u b 3 9 ，g l u b 3 9 ，g l u b 3 h ，g l u b 3 i + a n dg l u 聊w e r e p r e s e n t e d a tg l u d 3l o c u s ，f i v ea l l e l i cv a r i a t i o n si n c l u d i n gg l u - d 3 a ，g l u d 3 b ，g l u d 3 c ，g l u - d 3 c a n dg l u d 3 f w e r ef o u n d t h es e e d so ft h i sd e f i n i t es e ta r ea v a i l a b l eo nr e q u e s t 2 m a l d i t o f - m sw a sau s e f u la p p r o a c hi nw h e a tb r e e d i n gp r o g r a m sf o rr a p i di d e n t i f i c a t i o no f h m w - g se s p e c i a l l yi nd i s c r i m i n a t i n gs u b u n i t s7 a ，7 b ，8 a ，8 b + a n d7 0 ea s s o c i a t e dw i t hs u p e r i o r q u a l i t y u s i n gm a l d i t o f - m st e c h n i q u e ，o n e ，f i f t e e na n df o u ra l l e l e sw e r eo b s e r v e da tg i u - a 1 ， g 胁毋1a n dg l u - d jl o c i ，r e s p e c t i v e l y t h ea l l e l i cv 撕a t i o n so fg l u b 1l o c u si n c l u d e ds u b u n i t s6 + 8 b 一，7 ， 7 + 8 ，7 + 8 a ，7 + 8 b ，7 a + 8 ，7 b + + 8 ，7 0 e ，7 0 e + 8 ，7 0 e + 8 a ，7 0 e + 8 b ，7 + 9 ，1 3 + 1 6 ，1 4 + 1 5o r2 0 ，a n d1 7 + 1 8 s u b u n i t s7 + 8 a ，7 + 8 b ，a n d7 伽+ 8 a w e r ef o u n di ns i x ，s i xa n df o u rg e n o t y p e s ，r e s p e c t i v e l y u n c o m m o n s u b u n i t ( s ) 7 0 e + 8 b w e r ef o u n di na c a6 0 1 ，j i m a i2 4a n dm i a n y a n g9 4 0 11 2 ，1 3 + 1 6i np r o 町ai s l a v e r d e ，j i m a i 2 0a n do p a t a ，7 b + 8i ne s h i m a s h i n r i k ia n dy a n4 7 5 ，7i no r c a ，a n d7 a + 8i nj i m a i1 9 t h e l o wf r e q u e n c yo fs u b u n i t7 u e + 8w i t h3 4 w a st h ep r i n c i p a lr e a s o nf o rt l l ew e a kg l u t e nq u a l i t yi n i i i c h i n e s ew h e a t 3 m a l d i - t o f m si sa l le f f e c t i v ea n dv e r yi m p o r t a n ta p p r o a c hi ni d e n t i f i c a t i o no fl m w - g s p a r t i c u l a r l yi nw h e a tb r e e d i n gp r o g r a m sw h e r el a r g es c a l ei s o l a t i o no fl i n e sc o n t a i n i n gl m w g s a s s o c i a t e dw i t hs u p e r i o rq u a l i t yi sam a j o ro b j e c t i v e i t sap o t e n t i a lt e c h n i q u ei nr a p i dv a r i e t 2 l l i d e n t i f i c a t i o nt oe x t e n s i v e l yc o n f i r mt h ec l a s s i f i c a t i o no fc o m m e r c i a ls a m p l e s n el m w - g se x h i b i t e d m rb e t w e e n3 0 - 4 3k d ai nm a l d i t o f - m sp r o f i l e s t h eu n i q u ep e a k so ft h ea l l e l i cv a r i a t i o n sa t g l u 诅3l o c u sm a i n l yp r e s e n t e da tm rr a n g e so f4 1 8 _ 4 2 1k d aa n d4 3 5 4 3 8k d a a n dt h o s eo fg 觑毋1 3 a l l e l e so b v i o u s l ye x h i b i t e da tm rr a n g e so f4 0 1 - 4 0 2k d aa n d4 2 8 4 3 3k d aw h i l et h em rr a n g eo f 3 3 2 - 3 3 7k d ac o r r e s p o n d e dt ot h eu n i q u ep e a k so fg 胁圆3a l l e l e s t o t a l l y , f i f t e e na l l e l i cv a r i a t i o n so f l m w - g sw e r er e l i a b l yi d e n t i f i e db ym a l d i - t o f - m st e c h n i q u e a tg l u - a 3l o c u s ，f i v ea l l e l i c v a r i a t i o n si n c l u d i n gg l u - a 3 a c 。g l u - a 3 b ，g l u - a 3 d , g l u - a 3 ea n dg l u - a 3 fw e r eo b s e r v e d a tg l u b 3 l o c u s ，f i v ea l l e l i cv a r i a t i o n si n c l u d i n gg l u b 3 b 。g l u b 3 d , g l u - b 3 f g ，g l u b 3 ha n dg l u b 3 jw e r e p r e s e n t e d a tg l u d 3l o c u s 。f i v ea l l e l i cv a r i a t i o n si n c l u d i n gg t u d 3 n 。g l h - d 3 b ，g l u d 3 c 。g l u d 3 ci d a n dg l u d 3 f w e r ef o u n d t l l l es t a n d a r ds y s t e mo fc l a s s i f i c a t i o nf o ri m w r g sw a se s t a b l i s h e du s i n gs d s - p a g e 2 - d ea n d m a l d i - 1 o f _ m sm e t h o d o l o g i e s t h i si st h ef h - s te x t e n s i v es u r v e yt h ec o m p o s i t i o no fh m w - g sa n d l m w - g su s i n gm a u ) i - 1 o f - m st e c h n i q u e c o m p a r i n gw i t ht h ea l l e l e si d e n t i f i e db ys d s - p a g e i t c o n f o r m e dt h a tm a u ) i 1 o f - m sw a sa ne f f e c t i v ea n dv e r yi m p o r t a n tm e t h o di n i d e n t i f i c a t i o no f h m w - g sa n dl m w - g s n en o m e n c l a t u r es h o u l da l l o wt h o s ep e o p l ew o r k i n gi nt h i sf i e l dt oc r o s s r e f e r e n c et h e i ra l l e l ed e s i g n a t i o nw i t ht h o s ew i d e l yu s e da n da l l o wt h eu n d e r s t a n d i n go fe f f e c t so f u 订w g so nq u a l i 哆t ob ei n t e r p r e t e di na n yl a b o r a t o r y t h er e s u l t sd e s c r i b e dw i l lb ec r u c i a lf o r i m p r o v e m e n to fw h e a tq u a l i t y k e yw o r d ：c o m m o nw h e a t ，p r o t e o m i c s ，g l u t e n i ns u b u n i t s ，s d s - p a g e ，2 - d e ，m a l d i - t o f m s ， p r o c e s s i n gq u a l i t y i v 英文缩略表 v 独创性：声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究威 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了 明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：友，) 丽时间：劲。睁多 月石同 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科 学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不 同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 论文作者签名： 焘1 丽 时间：锄如年 占月 占t 7 导师签名： 稳呵渺 时间： 夕卯g 年多月秒同 中国农业科学院博l ：学位论文第一章文献综述 第一章文献综述 小麦是我国重要的粮食作物。过去小麦育种多注重产晕提高，忽视了品质改良，造成推广品 种加上品质普遍较差。近年来，市场对加工品质提出了更高的要求，品质改良已成为小麦育种的 重要目标之一。我国小麦蛋白质含量并不低，但面筋质量差，强度和延展性皆有待提高( h e ，2 0 0 1 ； 何中虎等，2 0 0 2 ；l i u 等，2 0 0 3 ) 。小麦贮藏蛋白主要由麦谷蛋白和醇溶蛋白构成，它们是决定面 团粘弹性的主要冈素。麦谷蚩白赋予面团弹性，醇溶蛋白赋予面团延展性，良好的弹性和延展性 是制作优质面包的基础( b l a c k m a n 和p a y n e ，1 9 8 7 ) 。小麦贮藏蛋白在组成和结构上具有高度异 质性和复杂性，传统蛋白分析方法在分离和鉴定其组成及功能上皆具有一定的局限性，快速发展 的蛋白质组学技术已发展成为贮藏蛋白的重要分离与鉴定技术，在很人程度上促进了贮藏蛋白的 高效分离与组成鉴定，推动其功能研究的深入进行。 麦谷蛋白的分离与鉴定方法主要有传统的十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳( s o d i u m d o d e c y ls u l f a t ep o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ，s d s p a g e ) 和高效液向色谱技术( h i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，h p l c ) ，以及近年来快速发展的蛋白质组学技术如基质辅助 激光解吸电离飞行时间质谱技术( m a t r i x a s s i s t e dl a s e rd e s o r p t i o n i o n i z a t i o nt i m e o f - f l i g h tm a s s s p e c t r o m e t r y ，m a l d i - t o f - m s ) 和双向电泳( t w o d i m e n s i o n a lg e le l e c t r o p h o r e s i s ，2 一d e ) 。在小 麦育种实践中，s d s p a g e 和h p l c 鉴定技术已成为常规育种的辅助手段，广泛用于优质麦谷蛋 白亚基的定向选择( d w o r s c h a k 等1 9 9 8 ) 。s d s p a g e 根据电泳迁移率鉴定麦谷蛋白亚基组成， 具有易丁操作、方法成熟和低成本等优点。h p l c 根据蛋白的疏水性分离蛋白，在蛋白质定量研 究中应用较广。2 - d e 技术分辨率高，是目前唯一能够将数千种蛋白质同时分离与展示的电泳技 术。m a l d i t o f - m s 质谱技术具有样品用量少、灵敏度高、速度快、重复性好和自动化程度高 等特点，在麦谷蛋白亚基的大规模鉴定中有很大的应用潜力。 蛋白质组技术已应用丁小麦品质研究领域并取得明显进展，主要包括以下方面的研究：面团 流变学特性改良，籽粒发育过程中蛋白质的累积与表达，造粉体等淀粉品质研究，籽粒硬度蛋白 分析，高温协迫对贮藏蛋白的影响及其与品质的关系研究，小麦品种鉴定中的应用，贮藏蛋白编 码基因的染色体定位研究，以及虫害对品质的影响研究( s k y l a s 等，2 0 0 5 ；m a k 等，2 0 0 6 ) 。 提高作物品质，培育市场需求的优质高产品种是品质育种的主要目标任务。通过导入优质基 因并进一步筛选优良基因型的育种工作已取得一定进展，然而生态环境对品质的影响仍是当前品 质改良面临的重要挑战。与d n a 和m r n a 相比，蛋白质较稳定，而且基因型与环境的互作最终 皆反应在蛋白质水平上，因此蛋白组成是蛋白质组学的重要研究内容之一。 中国农q k 科学院博十学位论文第一章文献综述 1 小麦蛋白质组学研究 1 1 从基因组学到蛋白质组学 基因组学的主要研究内容是基因组测序，揭示生命的所有遗传信息。s a n g e r 等( 1 9 8 2 ) 最早 完成了入噬菌体的全基冈组测序，d n a 测序技术和大功能生物软件的开发与利用为真核生物全 基因组测序奠定了基础，继入噬菌体之后完成了拟南芥全基因组测序( 2 0 0 0 ) 。拟南芥具有遗传 背景简单、基因组小、生长期短、易于转化等优点，已成为典型的模式植物，其全基因组测序对 芸苔类作物的基因组研究具有重要意义。拟南芥全基因组测序表明，拟南芥大约有2 60 0 0 个基因， 但其中4 0 的基闪功能尚不清楚( t h e a r a b i d o p s i sg e n o m ei n i t i a t i v e ，2 0 0 0 ) 。目前，拟南芥的基因 功能鉴定已成为分子生物学的主要研究热点，“拟南芥2 0 1 0 蛋白质组学研究计划”已正式启动， 部分结果已提交n c b i 数据库。 随着拟南芥全基冈组测序的完成，主要经济作物如水稻的全基因组测序已取得明显进展 ( a d a m ，2 0 0 0 ) 。国际水稻基因组测序计划( r g s ea d a m , 2 0 0 0 ) 由日本、美国、中国、法国等 1 1 个国家和地区发起并参与，于2 0 0 2 年完成。水稻基因组测序结果有助于比较分析其它重要经 济作物如小麦、玉米、谷子、高梁和大豆等基冈组中的有关基因，推动农作物的分子生物学研究， 为农作物遗传改良提供信息和理论依据。麦类作物是多倍体物种，基因组结构复杂，染色体含有 复等位基因及大量的冗余基因，因此其基因组测序较复杂。最近，国际小麦基因组测序协会 ( 研g s c ) 已经制定计划，开始对普通小麦基因组中的基因间隔区进行测序。 基因组研究为深入了解植物及麦类作物的品质性状奠定了理论基础，然而基因是遗传信息的 携带者，生物功能的执行者却是蛋白质，它具有自身的活动规律，因而仅仅从基冈的角度来研究 远远不够，必须研究基因的转录和蛋白质的翻译过程，才能真正揭示生命的活动规律，由此产生 了研究细胞或有机体全部蛋白质的存在及其生命活动的新兴学科一一蛋白质组学( h u m p h e r y s m i t h 等，1 9 9 7 ) 。 1 2 蛋白质组学 基因表达包括m r n a 和蛋白质表达。基因表达具有时间性，细胞的生命活动主要发生在蛋白 质水平而不是r n a 水平，基因的生物学功能最终体现在蛋白质水平上，因此对蛋白质的表达研 究有助于深入了解基因表达的本质与功能( a n d e r s o n 和s e i l h a n l e r ，1 9 9 7 ) 。蛋白质组( p r o t e o m e ) 最早由w a s i n g e r 等( 1 9 9 5 ) 提出，是指基因组表达的全部蛋白质及其存在方式，是基因在不同环 境下表达的产物。蛋白质组学( p r o t e o m i c s ) 是研究一种生物基因在一定组织、一定时间和一定 环境下表达的全套蛋白质( h u m p h e r y s m i t h 等，1 9 9 7 ；w i l l i a m s ，1 9 9 9 ：d u n n ，2 0 0 0 ；p e n n i n g t o n 和d u n n ，2 0 0 1 ) 。 随着生物技术的发展，生命科学研究进入了“组学( o m i t s ) 时代”。基因组学、转录组学、 2 中围农业科学院博l j 学位论文第幸文献综述 蛋白质组学及其生物信息学和交互数据库等系统生物学技术平台分别从d n a 、m r n a 和蛋白质 三个水平进行研究，以了解分子生物学中心法则的本质即遗传信息由d n a 传递到m r n a ，翻译 成多肽，多肽依次组装成有生物功能的蛋白质。继基因组学、转录组学及蛋白质组学之后，糖组 学和代谢组学产生并迅速发展起来，各交叉学科之间的相互关系如图1 1 所示( f i e h n ，2 0 0 2 ；f e i z i 等，2 0 0 3 ；s u m n e r 等，2 0 0 3 ：w e c k w e r t h ，2 0 0 3 ) 。 图l 一1基因组与蛋白质组交叉学科的关系 糖组学代谢组学 f i g 1 1e m e r g i n gt e c h n o l o g i e sf o rt h ee l u c i d a t i o no fg e n o m ea n dp r o t e o m ei n t e r a c t i o n s 摘自s k y l a s 等( 2 0 0 5 ) 蛋白质组技术利用高效的分离与纯化技术及大规模分析鉴定技术，对基因表达产物蛋白 质进行大规模的分离与鉴定，是研究基因表达与环境互作的重要方法，其技术路线如图1 - 2 所示 ( w r i g l e y 等，2 0 0 3 ) 。t h i e n e m e n t 等( 1 9 9 9 ) 和c f i n o v a s 等( 2 0 0 4 ) 对蛋白质组技术在植物遗传 及生理研究中的应用进行了全面的概述。 1 3 双向电泳技术 在蛋白质组技术中，2 - d e 是最核心的技术，广泛用于蛋白复合物的分离研究。w r i g l e y ( 1 9 6 8 ) 最早将其用于小麦贮藏蛋白研究，利用2 - d e 技术和= l 整倍体对5 0 多个醇溶蛋白编码基冈进行定 位。随后，o f a r r e l l ( 1 9 7 5 ) 进一步优化并提出2 d e 具有分辨成千上万个蛋白组分的分离潜力。 w r i g l e y ( 1 9 6 8 ) 和i s l a m 等( 2 0 0 2 ；2 0 0 3 a ，b ) 用2 - d e 对小麦贮藏蛋白编码基因进行染色体定 位研究。g 6 唱等( 2 0 0 0 ) 全面概述了2 d e 的研究进展，并提出2 - d e 技术是小麦蛋白质组学研 究的关键技术。与早期的2 - d e 分离技术相比，目前用于蛋白质组学研究的2 - d e 技术分辨率有了 显著提高。m a k 等( 2 0 0 6 ) 用2 d e 分离麦芽蛋白，共检测到6 1 2 个蛋白点，酶解后进行质谱分 析和数据库检索，其中有3 4 7 个蛋白点在数据库中有匹配序列，进一步对其中的3 0 1 个蛋白点进 行功能鉴定与分类，表明在麦芽中有6 种重要的代谢酶，其中氧化还原酶、转移酶和水解酶的表 达量最高。 3 车 卜 j一卅群 中围农业科学院博十学位论文第一章文献综述 4 中国农业科学院博学位论立 第一章空献综述 氯乙酸平0 0 7 ( v v ) b - 巯摹乙醇的丙酮提取，然后去除有机酸、酚类、色素、萜类和盐离子 等干扰2 - d e 分辨效果的物质( g - r a i n l e r ，1 9 8 8 ) 。在上述沉淀中加人2 m l 的水化渡( 7 m _ 自 素、 2 m 硫腮、2 m m 三j 基膦、4 ( w v ) 3 - 【3 - ( 胆酰胺基丙基) _ 二甲氨基】丙磺酸盐( c h a p s ) 、l ( v v ) 两性电解质，加“伽三羧甲基氨摹甲烷( t d s ) 和少茸溴芬兰，重悬浮并进行超声波处理， 最后加入棱酸内切酶击除棱酸，离心后取5 0 0 p l 上消液直接上样或贮存于- 8 0 c 冰箱。 口h 范尉 p g 脞$ i 中等的 图1 - 3 不同p h 范围坤g 胶条的2 0 d e 分离效果 f i g i - 3 p r e l i m i n a r yp m t e o m e s c r e e n i n g o fs o f tw h e a te u k i v m w h o l e m e a lp r o t e i n s s h o w nf o rt h e w h e a t c u l t i v 盯b o w i e ，u s i n g2 - d e r o s s c o m b i n a t i o n s o f b r o a d 一( p h3 - l o ) 。m i d 一( p h 4 - 7 ，5 - 8 ，a n d 6 - 1 1 ) a n dn a i t o w - r a n g e ( p h5 5 - 5 7 ) i p gs t r i p s 摘自s k y l a s 等( 2 0 0 4 ) ( 2 ) 2 - d e 分离 直接用上清液5 0 0p l 或4 0 l 蚩白提取液+ 4 5 0 l 水化液上样，选择p h 和p h6 - i l 的i p g 胶条永化样品。将水化过夜的i p g 脞条进行第向等电聚焦( 1 e f ) 分离，加入平衡液( 6m 尿 素、2 s d s 、03 7 5 m t d s m i c ip h8 8 、2 0 甘油、5r a m 二j 基膦和25 丙烯酰胺) 对胺条进 行平衡处理，使啪胶条与第一二向s d s - p a g e 凝胶的p h 值相同，咀防jj ：电内潘作用，提高蛋白 质从第一向i p g 胶条到第一向s d s p a g e 的转移效率。第二向用8 - 1 8 的s d s p a g e 梯度胶进 行分离，结果如图l - 4 所示( s k y l a s 等，2 0 0 5 ) 。经2 - d e 分离的蛋白进行凝胶扫描和图像分析， n唧圈舭 高 一 裟 p j sk 譬 图1 - 4w y a n a 耔粒蛋白的2 - d e 分析 f i g 1 - 4 p r o t e o r n e m a p so f d e v e l o p i n g i m m a t u r e w h e a t g r a i n e n d o s p e r m 0 w y u n a a t l 7 d p a ) i n t h e p hr a n g e s4 - 7 ( a c i d i c ) a n d6