（内科学专业论文）mip1a增加肠屏障通透性的研究.pdf

一、摘要 中文论著摘要l 英文论著摘要3 二、英文缩略语5 三、论文 前言6日u 舀6 材料与方法7 实验结果9 讨论”l3 结论”1 5 四、本研究创新性的自我评价1 6 五、参考文献17 六、附录 综述一1 9 在学期间科研成绩3 7 致i 射“3 8 个人简介3 9 中文论著摘要 m i p l q 增加肠屏障通透性的研究 目的 探讨m i p l c 对肠上皮细胞屏障的通透性及紧密连接蛋白分布及表达的影响 材料与方法 1 、肠屏障体外模型的建立：应用人大肠腺癌细胞株( c a c o 2 细胞) 为 陈誉华教授惠赠。将l x l 0 5 加到孔径为0 4 微米的t r a n s w e l l ( c o s t a r ) 2 4 孔板上，定 时换液，培养4 天后细胞达到融合状态，形成具有紧密连接的上皮细胞单层。 2 、单层细胞通透性分析：在t r a n s w c l l 上室中加入浓度为 5 0 n g m lm i p l a ，分别孵育0 、1 、4 、8 、1 6 h ；加入不同浓度的m i p l a ( o 、5 、 1 0 、5 0n g m 1 ) 孵育8 h ，观察加入m i p 1 a 前后m i p 1 a 对c a c o 2 细胞辣根过氧 化物酶透过率的影响。 3 、 用免疫荧光法观察m i p l 0 【与c a c o 2 细胞相互作用后肠上皮细胞紧 密连接蛋白z o 1 和o c c u d i n 的变化。 3 1 在盖玻片上接种c a c o 一2 细胞，培养至完全融合时加入m i p l 仅，3 7 孵 育0 、2 、4 、8 、1 6 、2 4 小时，用免疫荧光染色检测z o 1 的变化。 3 2 在盖玻片上接种c a c o 2 细胞，培养至完全融合时加入m i p l 0 【，3 7 。c 孵 育0 、2 、4 、8 、1 6 、2 4 小时，用免疫荧光染色检测o c c u d i n 的变化。 结果 1 、m i p l a 增加肠上皮细胞屏障的通透性与对照组相比，在m i p 1 a 作 用8 小时后，过氧化物酶的通透性开始升高，1 6 小时这种作用达到最强。 2 、m i p 1 a 引起肠上皮细胞紧密连接蛋白z o 1 和o c c l u d i n 的定位异常。 正常c a c o 2 细胞，o c c l u d i n 及z o 1 蛋白沿细胞膜分布；加入m i p 1 a5 0 n g m l 作 用2 小时后，z o 1 及o c c l u d i n 蛋白呈锯齿状分布，并且荧光信号减弱；加入m i p 1 a 结论 1 、m i p 10 【增加肠上皮细胞屏障的通透性 2 、m i p 10 【引起紧密连接蛋白z o 1 及o c c l u d i n 的异常分布及表达减弱 关键词 肠粘膜屏障；m i p l a ；c a c o 2 细胞；紧密连接；z o 1 ；o c c l u d i n 2 在胞 英文论著摘要 t hr e s e a r c h0 f i n c r e a s ei n t e s t i n a le p i t h e l i a lbarrierer e s e a r c i ii n c r e a s ei n t e s t i n aa r r i e rn0 i量 o e r m e a b i l i t y i n d u c e d i nu c eb vm i p l 仅d vm l r l 一仅 o b j e c t i v e t o i n v e s t i g a t e t h ee f f e c to fm i p1 ao ni n t e s t i n a lp e r m e a b i l i t ya n d i n t e r e p i t h e l i a lt i g h tj u n c t i o n m a t e r i a l sa n dm e t h o d s 1 、i n t e s t i n a lb a r r i e r ： c a c o 一2c e l l sw e r eg r o w ni nac u l u r em e d i u mc o m p o s e do fm e mw i t h2 0 f b s p l a c elxl0 5c a c o - 2i nt r a n s w e l lc u l t u r em e m b r a n e ，c u l t u r e d4 d a y sb e f o r eu s e 2 、d e t e r m i n a t i o no fe p i t h e l i a lm o n o l a y e r p a r a c e l l u l a rp e r m e a b i l i t y f o rd e t e r m i n a t i o no ft h ee f f e c to fm i p1 0 【o nc a c o - 2m o n o l a y e rp a r a c e l l u l a r p e r m e a b i l i t y , t h ef i l t e r - g r o w nc a c o - 2c e l l sb y4d a y sp o s t p l a t i n gw e r ei n c u b a t e dw i t h m 口- q5 0 n g m lf o ri n c u b a t e dt i m e s ( 1 、2 、4 、6 、8 、1 6 、2 4 h ) o rm i p 一0 【0 、5 、1 0 、 5 0 n g m lf o r8h o u r s ，a n dt h em u c o s a l - t o s e r o s a lf l u xr a t e so ft h ee s t a b l i s h e dp a r a c e l l u a r m a r k e rh r pw a sd e t e r m i n e d 3 、a s s e s s m e n to fz o - la n do c c l u d i n gp r o t e i nl o c a l i z a t i o na n de x p r e s s i o n 3 1c u l t r u e dc a c o 2c e l l so i lt h ec o v e rs l i c et oc o n f l u e n t a d d e dm i p 一0 to n t h et r a n s w e l l c u l t u r e da t3 7 a n dt o o ko u tt h ec o v e rs l i c e sa th o u rl 、2 、4 、6 、8 、 16 a n d2 4 e x a m i n e dz o 一1b yi m m u n o f l u o r e n c em e t h o d 3 2c u l t r u e dc a c o 2c e l l so nt h ec o v e rs l i c et oc o n f l u e n t a d d e dm i p 0 【o nt h e t r a n s w e l l c u l t u r e da t3 7 a n dt o o ko u tt h ec o v e rs l i c e sa th o u rl 、2 、4 、6 、8 、1 6 a n d 2 4 e x a m i n e d o c c l u d i n gb yi m m u n o f l u o r e n c e m e t h o d 3 u l a rp e r m e a b i l i t y t h em i p1 - ae f f e c to nc a c o 一2p a r a c e l l u a rp e r m e a b i l i t ye x a m i n e db yu s i n gt h e p a r a c e l l u a rm a r k e rh r pi n d i c a t e dt h a tm i p1 一伐p r o d u c e dap r o g r e s s i v ec o n c e n t r a t i o n a n dt i m e - d e p e n d e n ti n c r e a s ei nt r a n s e p i t h e l i a lp e r m e a b i l i t yt oh r p 2 、m i p1 一qc a u s e st i g h tj u n c t i o np r o t e i nz o 1a n do c c l u d i nd i s t r i b u t e d i nt h ec o n t r o lc a c o 一2m o n o l a y e r s ，o c c l u d i n gp r o t e i n sw e r el o c a l i z e da tt h ea p i c a l c e l l u a rj u n c t i o n sa n da p p e a r e da sc o n t i n u o u sb e l t - l i k es t r c t u r e se n c i r c l i n gt h ec e l l sa t t h ec e l l u l a rb o r d e r s m i p1 一a ( 5 0 n g m l ) c a u s e dap r o g r e s s i v ed i s t u r b a n c ei nt h e c o n t i n u i t yo fo c c l u d i n gl o c a l i z a t i o na tt h ec e l l u l a rb o r d e r sc h a r a c t e r i z e db yz i g - z a g g i n g a p p e a r a n c ea tp o i n t so fm u l t i p l ec e l l u a rc o n t a c t c o n c l u s i o n i 、m i p1 - c td i s r u p t st h ei n t e r e p i t h c l i a lt i g h tj u n c t i o na n di n c r e a s ec a c o 一2 i n t e s t i n a le p i t h e l i a lp e r m e a b i l i t y 2 、m i p1 一ac a u s e sad i s t u r b a n c ei nt h ec o n t i n u i t yo fz o 1a n do c c l u d i n g l o c a l i z a t i o na tt h ec e l l u l a rb o r d e r sa n dp r o d u c e sad e c r e a s ei nz o - 1a n do c c l u d i n g p r o t e i ne x p r e s s i o n k e y w o r d s i n t e s t i n a lb a r r i e rp e r m e a b i l i t y ；m i p l - q ；c a c o 一2 ；t i g h t j u n c t i o n ；z o 一1 ；o c c l u d i n 4 英文缩略语 英文缩写英文名称中文名称 m i p l - a m a c r o p h a g ei n f l a m m a t o r yp r o t e i n l 一巨噬细胞炎性蛋白卜q z o 1z o n u l ao c c l u d e n 一1 紧密连接蛋白一l t j t i g h tj u n c t i o n 紧密连接 f i t cf l u o r e s i n i s t h i o c y a n a t e 异硫氰酸荧光素 f b sf e t a lb o v i n es e r u m 胎牛血清 p b s p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n磷酸盐缓冲液 i b d i n f l a m m a t o r yb o w e ld i s e a s e 炎症性肠病 u cu l c e r a t i v ec o l i t i s溃疡性结肠炎 c d c r o h n sd i s e a s e 克罗恩病 c a c o 2t h eh u m a nc o l o nc a r c i n o m ac e l人结肠癌上皮细胞 h r ph o r s er a d i s hp e r o x i d a s e 辣根过氧化物酶 5 m i p l a 增加肠屏障通透性的研究 日吾 肠粘膜屏障是机体最重要的免疫防御屏障，将机体与肠道内的外源性物质隔 离开来，避免病原微生物的侵袭和抗原分子的损伤。 肠黏膜屏障主要包括机械屏障、免疫屏障及生物屏障。机械屏障由肠上皮细 胞、肠黏液组成：免疫屏障即肠道免疫防御系统主要由分泌性免疫球蛋白 ( s e c r e t o r yi m m u n o g l o b u l i n ，s i g a ) 和肠相关淋巴组织( g u ta s s o c i a t e dl y m p a t h i ct i s s u e ， g a l t ) 构成：肠道正常菌群构成了肠道的生物屏障。肠上皮细胞屏障是最重要的一 道屏障，是肠粘膜屏障具有选择性通透的基础。 目前研究发现肠上皮细胞屏障通透性增高参与多种疾病的发生( 如炎症性肠 病、败血症、烧伤、终末期肝病、重症胰腺炎等) ，并且在这些情况下，血清炎症 分子明显增高，与肠上皮细胞屏障的损害程度成正相关。因此认为炎症因子是增 加肠上皮细胞屏障通透性的重要因素。 炎症性肠病( i n f l a m m a t o r yb o w e ld i s e a s e ，i b d ) 是一组病因不明的慢性肠道 炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎( u l c e r a t i v ec o l i t i s ，u c ) 和克罗恩病( c r o h n s d i s e a s e ，c d ) ，i b d 的病因和发病机制尚不清楚，i b d 发病可能与环境、感染、 遗传、免疫等因素有关，目前普遍认为免疫反应异常所导致的肠黏膜通透性增加 在其发病中起重要作用“，已经证实，u c 患者肠黏膜中促炎细胞因子表达升高， 且升高程度与疾病严重程度相关。有充分的证据表明，i b d 时巨噬细胞不断补充 到粘膜并被激活，激活的巨噬细胞具有增强呼吸爆活力和抗原呈递活性，以及释 放溶菌酶和i l - 1 的能力3 。巨噬细胞炎症蛋白1 - a ( m i p l 仅) 属于c - c 亚族( b 亚族) 的成员，是参与机体炎症反应和免疫反应的一种重要的趋化性细胞因子， 主要趋化和激活单核细胞和某些t 细胞亚群。m i p l a 可以促进i f n 吖、t n f a 转 录，与抗c d 3 抗体共刺激t 细胞活化，促进增生和i l - 2 生成。也有研究证明， m i p l 0 【能抑制蛋白的表达。m i p l 0 【还能抑制细胞进入周期和或降低细胞的生 6 屏障模型，观察m i p l a 对 肠上皮屏障的通透性及对紧密连接蛋白表达及定位的影响。 材料与方法 一、实验材料 1 、实验细胞 c a c o 2 细胞株，中国医科大学发育生物教研室陈誉华教授惠赠。 2 、实验药物 m e m 培养基；胎牛血清，美国g i b c o b r l 公司；r h m i p l 一a ，r ds y s t e m s 公司；z o - 1 ，a b e a m 公司；o c c l u d i n ，i n v i n t r o g i n 公司；过氧化物酶；f i t c 标记 山羊抗小鼠二抗，；其他常规试剂购自沈阳化学采购供应站。 3 、主要仪器 荧光显微镜( o l y m p u s b x 5 1 ) 倒置显微镜( o l y m p u s c k 4 0 ) 光学显微镜( o l y m p u s b s - 6 0 ) 细胞计数板( 上海) 进口微量加样器( 日本n i c h i p e t e x ) 细胞用培养用c 0 2 孵箱( h e r e a u s c e l l ) 二、方法 1 、细胞培养 c a c o 2 细胞株，来源于人大肠腺癌细胞，可分化成有极性的肠上皮细胞， 与人肠上皮细胞在形态上十分相似，具有相同的维持细胞极性的重要结构如微绒 毛和紧密连接等，其结构和生化作用类似于人的肠上皮细胞，因而是一个很好的 研究肠上皮细胞功能的模型。应用含有2 0 0 m l l 胎牛血清的m e m 培养液，在3 7 。c 、 5 c 0 2 条件下进行培养，每7 天按1 ：2 的比例传代。 2 、肠上皮细胞屏障的建立 7 有效膜面积 培养液，下层 加入8 0 0 1 1 培养液) ，倒置显微镜下观察细胞生长情况，约4 天细胞形成紧密单层， 进行后续实验。 3 、肠上皮细胞屏障通透性的检测 c a c o 2 细胞形成单层上皮细胞屏障后，无血清培养2 4 小时，加入m i p l a5 0 n g m l 孵育不同时间( o 、l 、2 、4 、8 、1 6 、2 4 小时) ；在t r a n s w e l l 的上室及下室 加入不同浓度的m i p l - a ( 0 、5 、1 0 、5 0 n g m l ) 孵育8 小时。细胞用无血无抗培养 液孵育1 2 小时，在上室加入过氧化物酶0 0 5 m g m l ，3 7 。c 孵育指定时间后收集下 室液体，取5p l 培养液于酶标板中，分别加入1 9 5 “l 新鲜配制的浓度为4 0 0p g m l 邻苯二胺，溶于p h5 0 ，含有0 0 1 2 h 2 0 2 的柠檬酸和o 1m o l l 磷酸盐的溶液 中。1 5m i n 后加入5 0 9 l0 3m o v lh 2 s 0 4 终止反应，于酶标仪上读取a 4 9 2 的值。 4 、m i p l 0 【与c a c o 2 细胞相互作用后紧密连接蛋白的免疫荧光 4 1 在6 孔板中放入经细胞培养处理过的盖玻片，接种上c a c o 一2 ，按时换液， 培养至完全融合后加入5 0 n g m lm i p l 0 【，孵育0 、2 、4 、8 、1 6 、2 4 小时后，取出 盖玻片，用l x p b s 漂洗3 次，用4 的福尔巴林固定3 0 m i n ，p b s 洗3 次，用0 4 t f i t o n x l 0 0 处理1 0 m i n ，p b s 漂洗3 次，5 小牛血清白蛋白室温封闭l h ，弃去封 闭液，不漂洗，加入f i t c 标记z o 1 一抗，按1 ：2 0 0 稀释与1 x p b s 中，4 过夜。 阴性对照用p b s 代替一抗，再用p b s 漂洗3 次，蒸馏水洗2 次，甘油封片，置于 荧光显微镜下观察、拍照。 4 2 在6 孔板中放入经细胞培养处理过的盖玻片，接种上c a c o 2 ，按时换液， 培养至完全融合后加入5 0 n g m lm i p l a ，孵育0 、2 、4 、8 、1 6 、2 4 小时后，取出 盖玻片，用1 x p b s 漂洗3 次，用4 的福尔巴林固定3 0 m i n ，p b s 洗3 次，用 0 4 哳i t o n x l 0 0 处理1 0 m i n ，p b s 漂洗3 次，5 小牛血清白蛋白室温封闭1 h ，弃 去封闭液，不漂洗，加入f i t c 标记o c c u d i n 一抗，按1 ：2 0 0 稀释与1 x p b s 中，4 度过夜。阴性对照用p b s 代替一抗，再用p b s 漂洗3 次，蒸馏水洗2 次，甘油封 片，置于荧光显微镜下观察、拍照。 8 数标准差 表示，两组均数的差别通过t 检验进行比较。 结果 验的平均值，以“均 1 、m i p l 0 【增加肠上皮细胞屏障对过氧化物酶的通透性 正常c a c o 2 细胞对过氧化物酶的通透性很低，将m i p l a5 0 n g m l c a c o 2 细胞作用后，c a c o 2 细胞对过氧化物酶的透过率从1 小时开始，c a c o 2 细胞对过氧化物酶的通过率开始升高，8 小时增加更明显，1 6 小时达到高峰。 ( 见图1 - 1 ) ；加入不同浓度m i p l a 作用8 小时后，从5 n g m 1 开始，过氧化 物酶透过率既有增加，5 0 n g m 1 时更加明显。( 见图1 2 ) 。 上述结果提示m i p l a 可以增加c a c o 2 细胞对过氧化物酶的通透性， 并具有时间浓度依赖性。 2 、m i p l 仅破坏肠上皮细胞间的紧密连接 z o 1 及o c c l u d i n 是紧密连接的重要组成蛋白，也是紧密连接的标志物， 荧光染色可见z o 1 及o c c l u d i n 定位于细胞连接处，形成网格样分布。m i p l a 刺激2 4 小时后可见z o 1 及o c c l u d i n 的分布欠清晰，并且出现皱褶变形( 图2 1 、 图2 2 ) 。以上结果显示m i p l 可引起z o 1 及o c c l u d i n 分布异常，由膜顶端向 膜下方胞浆转移，并具有时间依赖性。 9 1 0 一 o 8 - 舌0 6 _ - 、 o 壹0 。4 一 0 2 一 黼 酗 l翳 圈黢圈斟 i 圆蔓e ：汪 对照组 4 d , 时8 4 , 时 1 6 t j , 时2 4 t j , 时 图2 1 对照组 4 小时 2 4 , 时 84 , 时 1 6 小时2 4 d , 时 图2 2 图2 1 ，c a c o - 2 与m i p i - a5 0 n g m l 共培养后，紧密连接蛋白z o - i 的定位变 化：对照组( 正常) z o 1 沿细胞膜分布，呈蜂巢状线性荧光，随着作用时间的增 加，锯齿状异常分布就更加明显，以作用2 4 小时最为典型。图2 2 ，c a c o - 2 与 m i p i - a5 0 n g m l 共培养后，紧密连接蛋白o c c l u d i n 的定位变化：对照组( 正常) o c c l u d i n 沿细胞膜分布，呈蜂巢状线性荧光，随着作用时间的增加，锯齿状异常分 布就更加明显，以作用2 4 小时最为典型。 1 2 始、调节和扩展中发挥重要作用。有研究表明，培养小鼠克罗恩病( c d ) 肠黏膜 固有层单个核细胞( l p m c ) ，发现模型组上清液m i p l ( i t 的分泌显著高于对照组， 说明m i p l o t 在小鼠c d 的l p m c 中表达增高，可能参与了c d 的免疫应答和炎症 反应。有研究显示阿尔兹海默病人外周血高表达m i p l o t 能通过调控细胞骨架而 影响紧密连接蛋白的表达，从而开通血脑屏障，引起外周t 细胞穿过血脑屏障进入 脑内仃。 在感染等因素刺激下，m i p l - a 由多种细胞产生，作用于c c r l ，c c r 5 和c c r 9 3 种细胞表面受体，是n k 细胞、单核细胞、中性粒细胞、t 细胞、b 细胞化学趋化 因子( 8 ) 。而我们研究的c a c o 一2 细胞表面有c c r l 受体。这使得我们研究m i p l ( i t 对 肠细胞屏障影响成为可能。所以我们用m i p l ( i t 直接作用于c a c o 一2 细胞来研究趋化 细胞因子对肠上皮通透性及紧密连接蛋白的影响。 物质通过肠上皮细胞有两种途径：一种为跨膜细胞途径，是能量依赖性，需 要载体的参与，大部分物质的吸收通过此途径；另一种为旁细胞途径，重要受紧 密连接限制，t j 位于上皮细胞顶端，类似“系鞋带 样结构，封闭了细胞旁间隙， 使细胞对物质的通过具有选择性饽。因此我们采用测定c a c o 2 单层细胞完整性的 物质：辣根过氧化物酶( h r p ) 作为标志物，检测m i p l 0 【对c a c o 一2 细胞细胞旁 通透性的影响。结果表明m i p l o t5 n g m l 即可引起h r p 透过率的增加，m i p 1 0 t 5 0 n g m l 使h r p 透过率进一步增加，说明m i p 1 a 能增加c a c o 2 细胞细胞旁的通 透性并具有浓度依赖性。我们又检测了m i p l o t 影响c a c o 2 细胞通透性的时间依 赖性，结果表明m i p 1 0 t5 0 n g m l 作用1 小时h r p 透过率开始增加，2 4 小时达到 高峰，说明m i p 10 【增加c a c o 一2 细胞细胞旁通透性还具有时间依赖性。 1 3 紧密连接蛋白由多种紧密连接蛋白分子组成，包括跨膜蛋白o c c l u d i n 、 c l a u d i n s 、连接粘附分子( j a m ) 和胞质附着蛋白z o s 、a f 6 、7 h 6 等n 。紧密连 接的功能主要取决于紧密连接蛋白的组成，不同细胞紧密连接蛋白的组成和含量 不同，这决定了t j 数目和t j 网络的复杂性。o c c l u d i n 是第一个发现的跨膜蛋白“ ， 大约6 0 一6 5 k d ，跨膜4 次，有2 个胞外环，相邻细胞通过外环以拉链状结合而产 生细胞旁封闭。是t j 的主要功能蛋白“，对于屏障功能的维持和紧密连接的完整 性具有重要作用。有研究表明用o c c l u d i n 转染l 一纤维母细胞( 缺乏t j ) 后，相邻细 胞之间可以形成t j 样结构“ 。它在上皮及内皮均表达，在维持和调节紧密连接屏 障功能中具有重要作用。它的功能类似于细胞与细胞之间的粘附分子。z o s 属于 膜相关鸟苷酸激酶m a g u k ( m e m b r a n ea s s o c i a t e dg u a n y l a t ek i n a s eh o m o l o g s ) 家 族，分子量约为2 1 0 2 2 5 k d ，是一种胞内蛋白，其含有三种异构体( z o 一1 ，2 ，3 ) 均含有由鸟苷酸激酶样( g u k ) 结构域、p d z 、s r c 同源s h 3 结构、酸性结构域等 组成的保守序列，他们有相似的氨基酸序列，但是c 端的长度不尽相同，是构成 t j 的重要成分，同时也有信号传导的作用( 1 3 ) 0z o 1 是1 9 8 6 年首先发现并鉴定的 组成紧密连接的蛋白1 们，通过其p d z 1 结构域与其他许多细胞连接蛋白如跨膜蛋 白o c c l u d i n 、c l a u d i n 和j a m 的胞浆尾端区域( c 端) 相互连接、相互作用，而z o 1 的c 末端则结合细胞骨架结合肌动蛋白、应力纤维和肌球蛋白，从而将o c c l u d i n 等t j 蛋白和肌动蛋白骨架系统连接在一起形成a c t i n z o o c c l u d i n 复合物，构成稳 定的连接系统“，z o 1 的n 末端可直接与0 【2 连锁蛋白( c a t e n i n ) 或细胞质e 一钙黏 连素结合，介导紧密连接的开启和闭合“酌，并使细胞内细胞骨架与胞外连接蛋白 实现信号沟通。 我们首先发现了m i p 10 【可以增加肠上皮屏障的通透性，破坏紧密连接，而 紧密连接蛋白z o 一1 和o c c u d i n 在屏障功能和紧密连接状念的维持中占据重要作用， 因此我们假设m i p 10 【是通过影响紧密连接蛋白7 0 1 和o c c u d i n 的表达来发挥上 述作用的。 我们应用免疫荧光染色对z o 1 和o c c u d i n 蛋白的定位进行研究。正常情况下， z o 1 和o c c u d i n 定位在细胞膜顶端，交织成网状，加入m i p l 0 【后，z o 1 和o c c u d i n 由膜顶端向膜下转移，表现为荧光信号呈锯齿状分布并且胞浆内出现阳性染色。 1 4 是其不能定位在紧密 近十年来，有关趋化因子的研究进展迅速，但未见有关于m i p l a 对c a c o 2 作 用的相关报道，本研究也为进一步探索i b d 的发病机制及治疗方法提供了理论依 据。研究i b d 的致病机理是为了找到特异的药物阻断疾病的发展。一些与细胞因 子相关的免疫调节治疗也开始试用于临床，并且取得了初步疗效。有研究表明， 抗t n f a 单克隆抗体可用于治疗c d “l1 8 ) 。从目前的实验结果可以得出m i p l q 可以破坏肠粘膜屏障，使肠上皮的通透性增加，阻止m i p l 一o 【与肠上皮的结合，可 以减少炎症反应；但由于细胞因子数量及其种类繁多，相互作用形成了一个级联 的网络系统，针对几种细胞因子难以阻止炎症的进一步发展。但是细胞因子对机 体所造成的影响最终是通过胞内外信号转导途径来完成的，阻断某些信号转导通 路，在有效地减少炎症发生的同时，还能调节细胞因子的产生，才能更好地减少 炎症的发生。m i p l 0 【作用于肠粘膜屏障的分子机制及信号通路尚不清楚，还有待 于进一步研究。为了进一步证实m i p l a 能够增加肠粘膜通透性及使紧密连接蛋白 表达下降，我们可以在未来的实验中应用m i p l 0 【特异性抗体作用于肠上皮细胞， 用相关的实验方法检测肠上皮通透性及紧密连接蛋白形态的恢复情况；同时也可 以更深入的研究m i p l a 作用于肠上皮细胞的信号通路。 总之，i b d 病因和发病机制复杂，涉及到免疫学、遗传学及环境因素多方面 的问题。相信随着对i b d 研究的深入，必将全面的认识医学上这一顽症，并发现 更多有效的药物以使患者获得痊愈。 结论 1 m i p l a 增加肠上皮细胞屏障的通透性 2 m i p l a 引起紧密连接蛋白z o 1 及o c c l u d i n 异常分布。 1 5 发现了m i p l a 通过调控c a c o 2 细胞紧密连接结构的开通而增使肠上皮屏 障( 肠粘膜屏障模型) 的的透过率增加。 1 6 2 y a m a m o t o f u r u s h oj k g e n e t i cf a c t o r sa s s o c i a t e d 丽t ht h ed e v e l o p m e n to fi n f l a m m a t o r y b o w e ld i s e a s e w o r l d jg a s t r o e n t e r o l2 0 0 7 ；1 3 ：5 5 9 4 - 5 5 9 7 3 于红刚炎症性肠病中淋巴细胞和巨噬细胞的白介素受体：治疗上一种更具选择性的靶 标? 国际消化病杂志1 9 9 5 4 ( 0 4 7 ) 4a r o n i c as m ，c h a r l i em a n t e l ，r e n eg o n i n ，e ta 1 i n t e r f e r o n - i n d u c i b l ep r o t e i n10a n dm a c r o p h a g e i n f l a m m a t o r yp r o t e i n 一1 i n h i b i tg r o w t hf a c t o rs t i m u l a t i o no fr a f - 1k i n a s ea c t i v i t ya n d p r o t e i ns y n t h e s i s i nah u m a ng r o w t h f a c t o r - d e p e n d e n th e m a t o p o i e t i c c e l l l i n e j b s ，19 9 5 ，2 7 0 ( 3 7 ) ，219 9 8 5 吴英理、张翼军巨噬细胞炎症蛋白1 吨研究进展江苏医药杂志2 0 0 0 2 6 ( 1 0 ) 8 11 - 8 1 3 6 杨湘怡、陈维雄趋化因子受体c c r 2 、c c r 5 及其配体巨噬细胞炎性蛋白1 a 在小鼠克罗 恩病模型中表达的研究胃肠病学2 0 0 7 1 2 ( 6 ) 3 4 9 3 5 2 7s h u - m e im a n ，y i - r a nm a ，d e s h us h a n g ，w e i d o n gz h a o ，b od a - w e ng u o ，w e n - g a n g f a n g ，l iz h u ，y u - h u ac h e r t p e r i p h e r a ltc e l l so v e r e x p r e s sm i p 一一t oe n h a n c e i t s t r a n s e n d o t h e l i a lm i g r a t i o ni na l z h e i m e r sd i s e a s en e u r o b i o l o g yo fa g i n g2 8 ( 2 0 0 7 ) 4 8 5 - 4 9 6 8 何影，欧阳钦全身应用趋化因子巨噬细胞炎性蛋白1 a 加重小鼠模型炎症性肠病国际 消化病杂志2 0 0 6 ，2 6 ( 2 ) 9c l a u d ep m o r p h o l o g i c a lf a c t o r si n f l u e n c i n gt r a n s e p i t h e l i a lp e r m e a b i l i t y ：am o d e lf o rt h e r e s i s t a n c eo ft h ez o n u l ao c c l u d e n s jm e m b rb i 0 1 19 7 8 ；3 9 ：219 - 2 3 2f u r u s em ，f u j i t ak , h i i r a g i t ，e ta 1 c l a u d i i n - 1a n d - 2 ：n o v e li n t e g r a lm e m b r a n ep r o t e i n sl o c a l i z i n ga tt i g h tj u n c t i o nw i t hn o s e q u e n c es i m i l a r i t yt oo c c l u d i n g jc e l lb i 0 1 1 9 9 8 ；1 4 1 ( 7 ) ：1 5 3 9 1 5 5 0 10n u s r a ta ，t u r n e rj r ，m a d a r aj l ：m o l e c u l a rp h y s i o l o g ya n dp a t h o p h y s i o l o g yo ft i g h tj u n c t i o n s i v r e g u l a t i o no ft i g h tj u n c t i o n sb ye x t r a c e l l u l a rs t i m u l i ：n u t r i e n t s ，c y t o k i n e s ，a n di m m u n e c e l l s a mjp h y s i o l2 0 0 0 ，2 7 9 ：g 8 51 - g 8 5 7 l lf u r u s em ，f u j i t ak , h i i r a g it ，e ta 1 c l a u d i i n la n d - 2 ：n o v e li n t e g r a lm e m b r a n ep r o t e i n s l o c a l i z i n ga tt i g h t j u n c t i o nw i t hn os e q u e n c es i m i l a r i t yt oo c c l u d i n g jc e l lb i 0 1 1 9 9 8 ；1 4 1 ( 7 ) ： t i g h t j u n c t i o n a lp r o t e i ne x p r e s s i o n a mjp h y s i o lh e a r tc i r cp h y s i 0 1 2 0 0 1 ；2 8 0 ( 3 ) ：h 1 2 4 1 - 2 8 4 1 3m i t i cl l ，a n d e r s o nj m ：m o l e c u l a ra r c h n e c t u r eo ft i g h tj u n c t i o n s a n n u r c v p h y s i 0 1 19 9 8 ；6 0 ：12 1 - 4 2 1 4s t e v e n s o nb r , s i l i c i a n oj d m o o s e k e rm se ta 1 i d e n t i f i c a t i o no fz o - l ：ah i g hm o l e c u l a rw e i g h t p o l y e p t i d ea s s o c i a t e dw i t ht h et i g h tj u n c t i o n ( z o n u l a0 c c h d e n s ) i nav a r i e t yo fe p i t h e l i a jc e l l b i 0 1 19 8 6 ，10 3 ：7 5 57 6 6 3 8 1 5t h ea c t i v ez o td o m a i ni n c r e a s ez o 一1a n dm y o s i n1 cs e r i n e t h r e o n i n ep h o s p h o r y l a t i o n ，a l t e r s i n t e r a c t i o nb e t w e e nz o - ia n di t sb i n d i n gp a r t n e r s ，a n di n d u c e st i g h tj u n c t i o nd i s a s s e m b l y t h r o u g hp r o t e i n a s ea c t i v a t e dr e c e p t o r2a c t i v a t i o n 16c i t is ，s a b a n a yh ，j a k e sr g e i g e rb ，k e n d r i c k - j o n e sj ：c i n g u l i n ，an e wp e r i p h e r a lc o m p o n e n t o ft i g h tj u n c t i o n s n a t u r e19 8 8 ；3 3 3 ：2 7 2 - 2 s u e n a e r tp , b u l t e e lv ，i 舢m e i ll ，e ta 1 a n t i t u m o rn e c r o s i sf a c t o rt r e a t m e n tt r s t o r e st h eg u t b a r r i e ri nc r o h n sd i s e a s e a mjg a s t r o e n t e r 0 1 2 0 0 2 ；9 7 ( 8 ) ：2 0 0 0 - 2 0 0 4 18 r u t g e e r t sp ，f e a g a nb g i l i c h t e n s t e i ng r , e ta 1 c o m p a r i s o no fs c h e d u l e da n de p i s o d i c t r e a t m e n ts t r a t e g i e so f i n f l i