（作物遗传育种专业论文）小麦成熟胚脱分化过程中转录因子家族及其靶基因的表达谱分析.pdf

河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论 小麦成熟胚脱分化过程中转录因子家族及学位 文题目 其靶基因的表达谱分析级别 硕士 学生学科导师 姓名 耿华春作物遗传育种陈新建教授 专业姓名 学位论文 是否保密 如需保密，解密时间年月 日 独创性声明 本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了文中 特别加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材 料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生躲椰 导导师躲。汐叼k 日期：刀埸年c 7 狷7 阳 日期：勿衫年拥涉日 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印 刷本和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 本人完全了解河南农业大学知识产权保护办法的有关规定，在毕业离 开河南农业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第一署名单 位为河南农业大学，实验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农 业大学所有，否则，承担相应的法律责任。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 研究生签名橼导师签名：俐d 撑院领导签名： 日期：勰6 为期日期：椭6 月曲日期：年月日 致谢 首先感谢导师陈新建教授对本论文的悉心指导和大力支持，导师学识渊博、 学风严谨、为人宽厚、幽默，其人格魅力和做事风格使我受益终生。三年来，从 课题设计、实施到论文撰写，导师付出了辛勤的劳动和大量的心血。同时也要感 谢陈军营老师在学习和生活中对我的关心、鼓励和帮助，陈军营老师献身科学的 求索精神、精益求精的治学态度，将激励我不断前行，在此本人对两位老师表示 最诚挚的敬意和最衷心的感谢! 再次感谢两位老师在我考搏期间的理解、支持和 关心! 我将谨记一日为师终身为父的感恩之言! 特别感谢河南师范大学生命科学学院徐存栓教授及其课题组的全体成员在 基因芯片实验设计和资料分析方面所给予的无私帮助! 特别感谢遗传育种系的崔党群老师、詹克惠老师、许海霞老师、程西永老师 和牛吉山老师的支持和帮助。他们不仅在实验实施过程中提出许多宝贵意见，也 为我的健康成长和为人处事树立了榜样。他们敏锐的洞察力、创新的思维、渊博 的专业知识，忘我的敬业精神，求实的作风，对科学工作的执著追求，为我今后 的学习和工作树立了典范。詹克慧副教授历经1 2 年培育优良小麦新品种“豫农 2 0 2 ”的科学求索精神和对国家、社会、人民的贡献值得我们大家永远学习! 非常感谢师姐尹海燕、杨艳会、王沙沙、朱雪萍、孙佩、白华举，师兄阮祥 经、舒文涛，同窗沈向磊、丁明丽，师妹崔琰、李香、林婵娟、刘海霞、凌新萍、 马锦华和师弟马平安的大力帮助。在这三年里，我与他们一起分担工作上的压力， 一起分享生活中的快乐，从他们身上我学会了很多科研知识，更学会了许多做人 的道理，我将永远怀念那段美好时光。祝他们学业有成! 感谢2 0 0 5 级作物遗传育种专业研究生班的兄弟姐妹们三年来在我学习、生 活、工作上所给予的支持和帮助，并为我提供了一个良好的学习和生活环境。感 谢矿3 2 0 3 宿舍的姐妹们，她们伴我度过了愉快的三年生活，并给予我莫大的关 心和帮助。祝福她们! 衷心感谢我的母亲及家人在生活、学业和精神上给予的理解、支持、关心和 帮助，是他们激励我积极向上，保持良好心态，不断战胜困难。在此，我向他们 致以最诚挚的感谢! 一生有他们陪伴是我最幸福、最值得珍惜的! 最后感谢所有给予我帮助、关心和支持而未能提及的领导、老师和同学们! 祝福你们在以后的工作、生活和学习中快乐、顺利、健康! 耿华春 2 0 0 8 年6 月于郑州 河南农业大学硕士学位论文 摘要 为研究小麦成熟胚脱分化的分子机理，本研究以豫麦1 8 为材料，利用a f f y m e t r i xw h e a t g e n e c h i p 基因芯片技术在转录水平上研究了转录因子及其靶基因在小麦成熟胚脱分化中 的表达变化。以小麦成熟胚脱分化起始0 点为对照，研究了在2 ，4 d 分别诱导0 、2 、6 、 1 2 、2 4 和7 2 h 时这些基因的表达变化，将那些与0 点比值大于2 或小于o 5 ，即表达变化两 倍以上的基因视为有意义的差异表达基因。结果表明，在含有6 1 1 2 7 个探针组，代表了5 5 0 8 5 个基因的小麦基因组表达谱上，发生有意义表达变化的基因共约有1 5 0 0 0 个。在这些有意义 变化的基因中着重对有意义变化的转录因子及其靶基因作了深入分析。共检测到4 2 类转录 因子家族，初步确认有4 2 5 个相关基因在脱分化过程中发挥作用，其中上调表达的转录因子 有1 3 9 个；下调表达的转录因子有2 3 2 个；上下调表达的转录因子有5 4 个。对这4 2 类转录 因子家族中的3 类转录因子家族及其靶基因又做了进一步的分析。结果如下： ( 1 ) m y b 家族转录因子及其靶基因本文研究了1 2 个m y b 家族转录因子及它们调控 的2 7 个下游基因。根据它们在芯片上的总体表达情况可知，m y b s t l 负调控l h c b 5 ，在小 麦成熟胚脱分化信号响应期起作用；m y b 4 1 i k e 通过负调控4 c l l 和c 4 h 在小麦成熟胚脱分 化信号传导期起主要作用；m y b 2 通过负调控a d h l 和r d 2 2 在小麦成熟胚脱分化信号响应 期和愈伤组织形成期发挥作用。 ( 2 ) a p 2e r e b p 家族转录因子及其靶基因a p 2 亚族中的b b m 和a n t 基因可以维持 细胞分生能力并调节细胞增殖、器官生长和愈伤组织形成。在小麦基因芯片上没有找到直接 描述为这两个基因的相关基因，但描述为a p 2 亚族转录因子的基因有1 0 个。根据小麦成熟 胚脱分化时期划分的生理生化特点可知，2 4 h 之后为愈伤组织形成主要时期。在芯片上从2 4 h 开始大量表达上调的基因有3 个，它们分别是g b ：b j 2 7 7 7 4 4 、g b ：c a 6 5 1 2 5 3 和g b ：c k 2 0 0 1 5 5 。 根据它们的表达情况可知，g b ：c k 2 0 0 1 5 5 基因有可能是b b m 和a n t 基因的同源基因，其 在小麦成熟胚脱分化的愈伤组织形成期上调表达幅度达对照的7 9 倍，其在愈伤组织形成期 的作用有待进一步利用基因敲除或r n a 干扰等方法做功能验证。 ( 3 ) m a d s 家族转录因子及其靶基因本文研究了小麦脱分化中的3 2 个m a d s 家族转 录因子及其2 个靶基因。根据它们在小麦基因芯片中的表达情况可知，它们主要在脱分化信 号传导期和愈伤组织形成期起一定的作用。有关它们详细的功能还有待进一步的研究。 关键词：小麦成熟胚；脱分化；基因芯片；差异表达；转录因子及其靶基因 河南农业大学硕士学位论文 1 文献综述 1 1 细胞脱分化研究简史 1 1 1 细胞全能性 1 8 3 8 年s c h l e i d e n 以植物为材料，1 8 3 9 年s c h w a n n 以动物和植物为材料，几乎同时提出了 细胞学说，即细胞具有独立发展能力，甚至具有细胞全能性【l 】。而后德国著名的植物学家 h a b e r l a n d t 在1 9 0 2 提出了细胞全能性的学说( t o t i p o t e n c y ) ，即高等植物的器官和组织基本单 位的细胞，都有可能在离体的条件下进行细胞分裂和分化，甚至形成完整植物，所有活的植 物细胞都有发育成一个完整植株的潜力【2 】，这暗示每个细胞包含了所有发育成整个植株的遗 传信息i 而他的理论在5 0 年以后被证实。由于实验条件的限制，动物细胞的全能性直到1 9 6 2 年才由g u r d o n 证实，当时他用非洲爪蟾小肠上皮细胞培养获得成熟蛙【3 】，第一次证明了动物 细胞全能性。1 9 9 7 年，”多莉”羊的诞生进一步证实了哺乳动物细胞的全能性【4 】。然而，植物 细胞和动物细胞都要经过一个脱分化过程才可以进行再分化。细胞脱分化是指细胞从一个分 化细胞转变为无组织结构的细胞团的过程，很多现象都与此有关，例如植物中愈伤组织的形 成；人与动物中癌细胞的形成等5 。9 1 。在这一理论的指导下，目前已经建立了各种动植物的 组织培养体系。细胞脱分化的研究就是在细胞全能性这一学说的基础上发展起来的，经过一 个世纪的研究，人们对细胞脱分化的现象已经得到深入研究。随着荧光标记激素灵敏性的不 断提高和原生质体操作激素的不断稳定，利用叶肉原生质体系统对植物细胞脱分化的研究已 取得重要进展。同时，一个高度同步化分裂的烟草细胞系b y - 2 的建立及其细胞同步化激素 的应用，也为植物细胞脱分化及其相关研究提供了模式体系。近年来，利用这些系统对植物 细胞有丝分裂的调控研究已取得许多重要进展，并已分离和检测出多个与植物细胞脱分化相 关基因，为了解植物细胞在培养条件下脱分化进入有丝分裂周期的调控过程奠定了基础。然 而，由于没有便于操作的脱分化系统，细胞为什么会发生脱分化，细胞脱分化过程中哪些基 因发生了差异表达，却很少有人去研究。 ， 我们已经知道从理论上讲，任何一个细胞都有发育成完整个体的潜在能力，但一个体细 胞的细胞全能性的体现必须首先要回复到分生状态或胚性细胞状态，这种回复能力在不同的 细胞类型之间差异很大。1 9 6 6 年，g a u t h e r e t 提出一个观点，一个植物细胞向分生状态回复过 程所能进行的程度，取决于它所在的自然部位的生理状态，离生长中心越远，分化程度越高， 其向分生状态回复的可能性越小。一般的说，营养生长中心、形成层、伴胞及分泌细胞，薄 壁细胞回复的较容易，而厚壁细胞、纤维细胞和退化的微管和筛管回复的可能性比较小【l 们。 1 1 2 脱分化过程中生理活动和细胞结构变化 近几十年来，随着植物组织细胞培养工作的蓬勃发展，有关学者，特别是英国的学者对 外植体脱分化时形成愈伤组织过程中的超微结构变化做了许多工作，发现其主要的变化发生 于细胞质。他们看到，当静止细胞分化过渡到细胞分裂时，细胞质生长很快，细胞质中多聚 核糖体数量明显增加，线粒体、高尔基体和内质网也不断增加，并不断产生囊泡【1 1 1 。在烟 2 河南农业大学硕士学位论文 草叶片外植体细胞的脱分化中，原质体是通过叶绿体出芽产生的，原有叶绿体变成造粉体， 并在脱分化分裂之前在液泡中首先出现一种蛋白质 1 2 , 1 3 。当水稻等植物的愈伤组织分化根和 芽时，细胞中的质体、线粒体和核糖核蛋白体的数量增多，而贮藏的淀粉和脂类物质消失。 在番茄子叶外植体细胞的脱分化及其愈伤组织再分化过程中，不仅观察到类似以上的各种超 微结构的变化，还观察到细胞核膜与质体的连络现象。在藓类中曾发现脱分化时叶绿体出芽 生殖由叶绿体变为原质体，在细胞核中观察到核仁增大，核仁液泡增多，颗粒区扩大。随着 核区胞质向周围幅射出多条细胞质丝或细胞质桥，细胞核移到桥中央，这决定了以后细胞分 裂的方向。一般认为，植物细胞在离体培养条件下脱分化后的细胞分裂有多种形式，头几次 分裂主要是无丝分裂【1 4 】。胡萝卜细胞在进行脱分化分裂时，全部以无丝分裂方式进行，小 麦花粉细胞在进行脱分化分裂时也存在大量的劈裂式和碎裂式无丝分裂。所有这些观察都说 明了细胞i 为r n a 和蛋白质合成水平增高及细胞整个代谢水平的增高。许多研究者曾企图找 出细胞脱分化所特有的亚显微水平上的形态特征，但未得到理想的结果【l5 1 。朱至清在研究 烟草细胞脱分化的过程中观察到，培养2 0 h 开始至3 4 d ，脱分化细胞的液泡出现电子密度很高 的圆球体，同时还可观察到液泡中有一些新形成的细胞质团可能是在蛋白体的基础上形成 的，其结果是实现细胞脱分化过程中的细胞质改组。c i o n n i 等在1 9 8 7 年也报道了类似的研究 结果。在大多数情况下，蛋白体的出现和细胞质密度增加是同步的，这一现象被认为是细胞 开始脱分化的标志。根据细胞脱分化过程中细胞结构发生变化的时空顺序，细胞脱分化过程 可分为3 个阶段：第一阶段为启动阶段，表现为细胞质增生，并开始向细胞中央移动，质体 演变成原生体，第三阶段为脱分化终结期，回复到分生细胞状态，细胞分裂即将开始。在细 胞脱分化的初期，细胞内首先出现新的m r n a 的增加，即相关基因已经转录表达，但这期间 染色体是否显著变化却一直没有报道。2 0 0 1 年，z h a o 等人以烟草叶肉细胞原生质体为材料， 采用流式细胞仪和微球核分析技术，首次成功地观察到了烟草叶肉细胞脱分化过程中染色体 的二次解凝聚过程【1 6 1 。第一次解凝聚发生在细胞壁酶解过程中，第二次发生在激素诱导3 6 h 后，根据它们的实验结果显示，第二次解凝聚对于细胞进入s 期很重要，而在没有激素的培 养基中的细胞，染色体不发生第二次解凝聚，细胞迅速死亡。可见，细胞的第二次解凝聚过 程是与细胞有丝分裂周期联系在一起的，而第一次解凝聚是和细胞进入脱分化有关的，可能 是为细胞进入脱分化作准备。可见细胞脱分化涉及到很多基因的表达，染色体的解凝聚只是 有利于细胞脱分化相关基因的转录。细胞脱分化是一个复杂的过程，在这一过程中，有关基 因的表达调控及其基因的协同作用还不清楚。 1 1 3 细胞脱分化的调控机理 1 1 3 1 细胞周期调控 从一个有组织有结构的高度分化的细胞经过脱分化，变为无组织结构的细胞团，重新使 细胞进入细胞分裂状态，这一标志性的转变必然是在一系列的调控机制作用下完成的。细胞 离体培养的研究表明，细胞脱分化调控的实质是g o 期细胞回复分裂周期的调控过程。细胞 河南农业大学硕士学位论文 在g l 期通过一系列的机制来决定是否进, k s 期，细胞缺少外界生长信号或调控因子，细胞就 无法从g o 期进入g l 期。真核生物存在复杂的调节细胞周期的调控因子，它们之间相互制约 或偶联形成复杂而精密的调控网络。在这些关键因子中，e y c l i n 细胞周期蛋白和c d k 周期蛋 白依赖激酶是主要的调节因子。细胞周期运动的动力主要来自c d k ，其活性则主要通过 e y c l i n 调节，c d k 的活性还受另外一类蛋白质的负向调节，即周期蛋白依赖激酶抑制子 ( c k i ) ，这个基因可以解释为什么静止细胞可以转向无限制的分裂细胞。植物细胞周期的 调控主要有两大类c d k ( c d k - a ，c d k a - b ) 和两类细胞周期蛋白( c y c b 、c y c d ) 。 1 1 3 2 激素调控 植物激素是离体培养所必须的条件，因此，与植物激素有关的基因表达被认为是启动细 胞脱分化的关键基因，目前已从不同植物中克隆出多个植物激素诱导表达的基因，但大部分 基因的功能并不清楚。现有研究证明，植物激素本身并不能直接作用于d n a 从而导致特定 基因激活，而是需要其受体蛋白以及其它信号转导过程的参与。生长素受体研究表明，植物 细胞感受生长素的信号是通过生长素受体和生长素分子结合，使生长素受体被活化来完成 的，这一过程被称为生长素感应，激活的受体可能引起某些特定的反应，如某些离子的吸收 或释放，特定蛋白的磷酸化或去磷酸化等，进而引起一系列连锁信号的传导反应，最终导致 生长素诱导的基因表达。1 9 8 9 年，t a k a h a s h i 等从叶肉细胞原生质体c d n a 文库中分离到2 ， 4 一d 诱导的基因的转录表达，他们把这个基因命名为p 甜基因，在没有2 ，4 d 的培养基里检测 不到该基因的表达，在旺盛生长的烟草悬浮系中表达量也很弱，进一步研究表明，该基因在 细胞从g o 期转a s 期的早期启动中具有功能性作用【l n 。此后，该实验室在1 9 9 4 年，分离出3 个生长素调节基因并分别命名为p a r a 、p a r b 和p a r c ，其中，p a r b 编码谷胱甘肽s 型转移酶， p a r a 和p a r c 被认为在生长素诱导后在转录调节中起到关键性的作用【1 8 1 。m a t s u b a y a s h i 和 s a k a g a m i 应用一个竞争性酶联免疫分析系统，在石刁柏叶肉细胞低密度悬浮培养系统中，分 离到两个促进细胞分裂的黄肽素，p s k - a , p s k - f 1 名e 培养基里没有n a a 和b a 的培养细胞里，检 测不n p s k - a 的存在，同时细胞也停留在g o g l 期而不启动分裂。由此可见，在细胞脱分化和 促进细胞分类的过程中，p s k - a 可能介导了与生长素和细胞分裂素密切相关的信号传导途径 1 9 2 0 1 。 1 1 4 脱分化研究目的意义 植物体是一个具有高度结构的多细胞系统，植物体中的细胞及其组成的不同组织均是高 度分化的，他们相互协调而发挥作用，这些分化的体细胞经过分裂后只产生相应的组织或器 官，细胞的全能性不能表达。但要发育成完整植株，必须先脱分化，脱分化的细胞具有发育 成任何组织的能力，然后进行再分化，形成完整植株。可见细胞全能型的表达潜力首要的条 件是该细胞必须处于未分化的原始状态，所以一个植物细胞要想体现出全能性，就必须先要 经过两个过程：一是已经分化的组织或细胞必须转变为不分化的状态或分生组织细胞状态， 并在此呈现其分类机能和分化潜力，这就是脱分化过程。虽然脱分化过程的实质是解除分化， 4 河南农业大学硕士学位论文 逆转细胞分化状态，使其回到分化前的原始状态，以恢复细胞的全能性，但脱分化过程并不 是分化简单的可逆过程。二是从经过脱分化形成的细胞团中分化出组织或器官。由于这种组 织或器官是从成熟细胞经脱分化而又分化形成的，所以这是一个再分化的过程，通常简称分 化，所以我们研究脱分化是为研究再分化作准备。 1 1 5 愈伤组织形成时期的划分及各个时期的特点 愈伤组织的形成，从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、 分裂期和形成期。起动期是指细胞准备进行分裂的时期。用于接种的外植体的细胞，通常都 是成熟细胞，处在静止状态。起动期是通过一些刺激因素( 如机械损伤、改变光照强度i 增 加氧等) 和激素的诱导作用，使外植体细胞的合成代谢活动加强，迅速进行蛋白质和核酸的 合成。机械损伤能诱导植物体细胞开始分裂，如伤口上会出现愈伤组织。在植物组织培养中 沿用了愈伤组织这一名词，但是植物组织培养中诱导外植体细胞分裂形成的愈伤组织，大都 不是损伤的结果。 分裂期是指外植体细胞经过诱导以后脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程。处于分裂 期的愈伤组织特点是：细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明。外植体的脱分化因植物种类、 器官来源及其生理状况的不同而有很大差别。例如，烟草、胡萝卜等植物的脱分化比较容易， 禾本科植物的脱分化比较难；花的脱分化比较容易，茎、叶的脱分化比较难；幼嫩组织的脱 分化比较容易，成熟的老组织脱分化比较难。对于细胞脱分化分裂期期间细胞分裂的类型还 没有完全统一，大多数研究表明，进入分裂周期的细胞第一次分裂即为正常的有丝分裂，但 有些研究认为培养细胞的初期的前几次分裂为无丝分裂，以后才转入正常的有丝分裂【2 1 2 2 1 。 2 0 0 3 年朱至清认为，细胞初期的分裂分式与外植体细胞类型有关，如果是二倍体细胞，第一 次分裂通常为有丝分裂，如果外植体是多倍体细胞，脱分化第一次分裂可能是无丝分裂【2 3 1 。 分化期是指在分裂期的末期，细胞内开始出现一系列形态和生理上的变化，从而使愈伤 组织内产生不同形态和功能的细胞。这些细胞类型有薄壁细胞、分生细胞、色素细胞、纤维 细胞等。 外植体的细胞经过起动、分裂和分化等一系列变化，形成了无序结构的愈伤组织。如果 在原来的培养基上继续培养愈伤组织，会由于培养基中营养不足或有毒代谢物的积累，导致 愈伤组织停止生长，甚至老化变黑、死亡。如果要让愈伤组织继续生长增殖，必须定期地( 如 2 4 周) 将它们分成小块，接种到新鲜的培养基上，这样愈伤组织就可以长期保持旺盛的生 长。 经过起动、分裂和分化期产生的愈伤组织，其中虽然发生了细胞分化，但是并没有器官 发生。只有满足某些条件，愈伤组织的细胞才会发生再分化，产生芽和根，进而发育成完整 植株。愈伤组织的形态发生方式主要有不定芽方式和胚状体方式两种。不定芽方式是在某些 条件下，愈伤组织中的分生细胞发生分化，形成不同的器官原基，再逐渐形成芽和根。胚状 体方式是由愈伤组织细胞诱导分化出具有胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。 5 河南农业大学硕士学位论文 这种由愈伤组织中的薄壁细胞不经过有性生殖过程，直接产生类似于胚的结构，叫做胚状体。 在植物组织培养中，不定芽方式和胚状体方式是愈伤组织形态发生的两种最常见和最重要的 方式。胚状体方式比不定芽方式有更多的优点，如胚状体产生的数量比不定芽多，胚状体可 以制成人工种子等。大多数情况下，愈伤组织细胞团并不完全是脱分化形成的，从而使其很 容易再分化成再生植株。 1 1 6 脱分化研究存在问题 脱分化牵涉到的基因很多，并不是一个或几个基因起主要作用，而是有大量的基因起作 用，并且基因与基因之间相互促进，相互抑制，是一个非常庞大的调控网络，并且基因分布 一在整个染色体组上，现在很多物种的基因组并没有测序，很多基因的功能都不清楚，并且运 用常规方法很难去研究。 脱分化过程牵涉到的生理代谢过程也很复杂，包括信号传导，糖类物质代谢，脂类物质 代谢，氨基酸代谢，能量代谢等。 没有便于操作的脱分化体系，研究脱分化的体系，自从烟草原生质体技术发展起来以后， 脱分化的研究才逐步发展起来，烟草原生质体是细胞除去细胞壁，小麦胚细胞愈伤组织培养 系统建立起来以后，也成为脱分化研究的一个重要的体系。 植物细胞脱分化过程是一个调节的过程2 4 1 ，在脱分化过程中往往包含着植物生长发育 基因，它们之间存在紧密地相关性，这部分基因在脱分化过程中也起到十分重要的作用，我 们不可能把这部分除去而孤立的去研究脱分化。正是由于生长发育相关基因与脱分化相关基 因存在交叉，它们之间又相互调节，并且它们之间也是密不可分，对于我们应用常规的方法 很难去研究植物细胞的脱分化。 1 1 7 脱分化产生的条件 大量的研究表明，有结构的组织或器官，当他们与母体分离，并在一定的条件下培养， 都可脱分化转变为愈伤组织。根据越来越多的研究表明，几乎所有的多细胞植物都有诱导产 生愈伤组织的潜在可能性，任何一个分化的细胞都具有保持分生组织状态的潜势，不过它平 常处于受抑制的状态，消除抑制作用就可以使细胞恢复分裂，也就是说，诱导细胞的脱分化， 形成愈伤组织成败的关键不是实验条件，而是培养条件，需要许多外界条件，其中激素的成 分和浓度是最重要的因素。生长素和细胞分裂素对诱导愈伤组织的产生及促进迅速生长是必 要的，但有些植物只需要生长素就可以脱分化，例如小麦胚细胞，菊苣；有的仅需加入细胞 激动素类，如大豆、萝卜；另一类需加生长素和细胞激动素类，如烟草髓、胡萝卜、马铃薯； 还有一类不需加任何激素，如冠瘿组织，烟草肿瘤组织。 脱分化产生与外植体的状态有关，据研究，越老的组织发生脱分化的条件越难，一般幼 嫩的细胞和组织较易发生脱分化。 1 1 8 愈伤组织和脱分化的关系 在大多数情况下，细胞脱分化后进入细胞分裂的结果都是形成愈伤组织，但并不是所用 6 河南农业大学硕士学位论文 的细胞脱分化都一定要形成愈伤组织，许多实验表明，有些外植体的细胞脱分化以后直接形 成胚性细胞，进而形成体细胞胚。愈伤组织和脱分化是两个不同概念，脱分化与愈伤组织的 形成在性质上是不能等同的，脱分化是细胞生理状态的改变，而形成愈伤组织是离体培养中 的一个阶段。愈伤组织的形成与脱分化发生的时期不同，一般认为诱导启动是脱分化的开始， 进入分裂期是脱分化的完成。而愈伤组织的形成不单包含脱分化的全部过程，而且包含细胞 形成愈伤组织的分裂期 1 2 小麦胚脱分化研究进展 1 2 1 小麦胚的脱分化过程 在谷类作物的组织培养实践中，幼胚、幼穗以及幼叶的基部都是诱导愈伤组织和胚性 细胞系的理想材料【2 5 1 。在普通小麦中，叶片、幼胚、成熟胚、花药，原生质体等均可在诱 导条件下形成愈伤组织 2 6 1 。其中，幼胚仍然是公认的可产生高再生率愈伤组织的理想外植 体。尽管幼胚做外植体形成的愈伤组织再生率高于成熟胚产生的，但是其取材受季节的严重 制约，且其发育程度不易控制，而成熟胚则可以克服这些影响。 普通小麦的正常胚胎发育可以划分为几个连续的发育过程：细胞增殖，细胞分化，器官 形成，成熟和脱水。脱水和于贮藏可以使胚保持重建的能力，所以在胚的吸水过程中原来的 合成代谢变成了分解代谢，分解代谢促使幼苗萌发生长【2 7 】。在植物器官有机物质合成结束 时，切取胚放在培养基上，当在生长素存在的条件下，胚便不再萌发，细胞开始增殖脱分化 形成愈伤组织【2 7 2 引。 在小麦中，由幼胚和成熟胚发育成的愈伤组织仍然保持有胚胎发生的潜能，通过体细胞 胚胎发生获得再生的能力，这个过程也是一些重要谷类作物的重要遗传特性 2 9 , 3 0 1 。小麦愈伤 组织的形成和再生机理现在研究的还不清楚。当小麦的盾片按照朝上的方向放在含有2 ，4 d 的培养基中时，愈伤组织就可以诱导形成【2 9 1 。当小麦胚的培养基中没有放2 ，4 d 时，在2 4 h 之内，初生根开始生长和胚芽鞘开始膨胀，4 8 h 之后长出大量的初生根和次生根。当培养基 中添加2 ，4 d 时，胚芽发育受到抑制，并且愈伤组织开始启动。在愈伤组织形成的前2 4 h 内， 胚的外在形态并没有发生明显可见的变化。但是，诱导7 2 h 时，胚内的细胞发生了大量的增 殖，这就使得胚胎的剖面发生了很大的紊乱，胚轴和盾片连接处的细胞层也发生了断裂。在 愈伤组织启动阶段，胚芽和胚根的生长受到抑制。相反，增生的细胞在形式上开始伸长，分 裂，继续增殖。在诱导培养基上4 d 之后，细胞继续绕着胚轴保持增殖，形成愈伤，其表面 呈现无定型、无分化状态【3 。愈伤组织转到分化培养基上继续培养，逐渐形成体细胞胚， 获得再生能力，分化出幼茎和幼根，发育成完整的植株。可见，由体细胞脱分化形成的愈伤 组织是否转变为体细胞胚与愈伤组织的再生率高低直接相关，在愈伤组织形成中，细胞便获 得能否再分化的信息。尽管小麦胚形成的愈伤组织的再生率对转基因改良小麦是很必要的， 但是，关于愈伤组织形成过程的调控机制现在了解的还很少。因此，鉴定影响这个过程的生 物功能性物质仍是一个关键问题。本研究的目标是由小麦成熟胚至形成愈伤组织的过程 7 河南农业大学硕士学位论文 小麦受精卵幼 胞胚 幼一植株 1 2 2 小麦成熟胚脱分化研究意义 小麦是世界上重要的粮食作物之一，小麦产量的高低、品质的优劣直接关系到人类生活 水平的提高，对食物的满意程度、营养的平衡和面粉及食品工业的发展。如何提高小麦产量、 改良小麦营养品质是现代育种家面临的主要问题。然而由于运用传统的方法存在育种周期 长，增产潜力有限等局限性，而植物生物技术育种周期短，增产潜力大。随着基因工程的发 展和完善，人们已经开始将现代基因工程技术和传统育种相结合，把小麦及其近缘种间的优 良基因直接转入普通栽培种中，进行定向筛选具有理想农艺性状的植株，从而克服传统育种 周期长的缺点。目前，已经建立了完善的植物基因转化方案，如农杆菌介导法，基因枪转化 法。但是，这些植物基因转化技术需要有高再生率的愈伤组织。所以，在利用基因工程技术 改良小麦品质中，组织培养技术是必不可少的。目前，小麦愈伤组织的再生率比较低，所以 研究小麦愈伤组织形成机理，进一步改良小麦愈伤组织品质是很有意义的。 虽然有关小麦胚细胞脱分化的研究有很多，然而很多研究都是局限于不同基因型，不同 激素浓度诱导对脱分化和再分化的影响研究，有关小麦胚细胞脱分化的分子机理方面的研究 却很少。在这一领域的研究有望解决小麦胚细胞脱分化的基因调控，以及解决愈伤组织再生 率低的问题。实践证明，用小麦成熟胚作为外植体，可以保证不同的个体间生理状况相似， 又有取材方便的优点，因此，已得到广泛的研究应用。但其愈伤组织的形成及植株再生能力 远远不及幼胚和幼穗，而且还存在有不少弊端。如伍碧华等报道，用成熟胚作外植体易被感 染，感染率高达5 0 以上，且愈伤组织质量差，呈水浸状。于晓红等报道，用小麦成熟胚进 行组织培养，愈伤组织形成绿芽的频率较高。而唐宗祥等报道【3 2 1 ，实验中采取切去果毛、2 次消毒的办法可以基本杜绝受感染的现象。另外，采用切去胚芽和调整激素的办法能够有效 抑制愈伤组织的发芽。实验初步证明了用成熟胚作为外植体进行组织培养进而获得转基因小 麦的可行性。张根发曾经提出，脱分化能力与再分化过程具有一致性，认为外植体的类型对 小麦体细胞组织再生能力影响很大。 以上研究表明，利用小麦成熟胚诱导、分化再生植株的方法还有待继续探索，以期为小 麦育种寻求较好的转基因受体并建立成熟胚的小麦再生体系，进而为小麦新品种的选育奠定 基础。 8 河南农业大学硕士学位论文 1 3 植物转录因子研究进展 1 3 1 植物转录因子的基本概念 转录因子( t r a n s c r i p t i o nf a c t o r ，t f ) 也称反式作用因子，是指那些具有同真核生物启动子 特定d n a 序列结合活性的蛋白质分子，或者是具有已知d n a 结合域结构特征的蛋白质分子， 其主要功能是激活或抑制基因的转录效应。自从1 9 8 7 年p a z a r e s 首次报道玉米转录因子基因 的克隆以来，相继从高等植物中分离出的调控干旱、高盐、低温、激素、病原反应及生长发 育等相关基因表达的转录因子已达数百种【3 3 1 。从蛋白质结构分析，这些转录因子一般由d n a 结合域( d n a b i n g d i n gd o m a i n ) 、转录调控域( a c t i v a t i o nd o m a i n ，包括激活域或抑制域) 、寡 聚化位点( o l i g o m e r i z a t i o ns i t e ) ，以及核定位信号( n l s ，n u c l e a rl o c a l i z a t i o ns i g n a l ) 等4 个功 能区域组成。转录因子通过这些功能区域与顺式元件相互作用或与其它转录因子的功能区域 相互作用来调控基因的表达。( 1 ) d n a 结合域是指转录因子识别顺式作用元件并与之结合的 一段氨基酸序列，相同类型转录因子d n a 结合域的氨基酸序列较为保守，因此，这段氨基 酸序列决定了转录因子与顺式作用元件结合的特异性。( 2 ) 转录调控域包括转录激活域和转 录抑制域两类，它们决定了转录因子功能的差异。同类转录因子的主要区别在于它们的转录 调控域各不相同。转录因子的激活或抑制作用依赖于它对靶基因的转录起激活还是抑制作 用。转录因子对靶基因的抑制作用可能是通过与其他转录因子竞争同一顺式调控元件进行 的。( 3 ) 寡聚化位点是不同转录因子借以发生相互作用的功能域。它们的氨基酸序列很保守， 大多与d n a 结合域相连并形成一定的空间构象，如b z i p 类转录因子的寡聚化位点包括1 个拉 链结构，而b h l h 型转录因子含有螺旋环螺旋结构，m a d s 转录因子的寡聚化域则形成两 个c 【螺旋和两个p 折叠。这些寡聚化位点空间构象的变化产生了转录机制的多样性，从而使 转录因子具有调控高等植物基因表达的能力。许多高等植物的转录因子形成异聚或同聚 物以影响d n a 结合的特异性、转录因子对启动子元件的亲和性和核的定位。( 4 ) 核定位信 号是转录因子中富含精氨酸和赖氨酸残基的核定位区域，转录因子进入细胞核的过程受该区 段控制，不同植物转录因子中n l s 的序列、组织器官的分布和数量存在着差异，可含l 至数个， 不规则的分布在转录因子中。有的转录因子只有一个核定位信号区，该类核定位信号区的碱 性氨基酸或者聚集在一起或者形成两个被非保守氨基酸隔开的功能群，而有的转录因子具有 多拷贝的核定位信号区，这些多拷贝核定位信号区或在功能上相互独立，或成簇存在p 4 】。 目前，在高等植物中结构了解较清楚的是拟南芥中t a t a 框结合蛋白等少数转录因子【3 5 1 。 拟南芥基因组测序已经完成，据推断，至少有1 5 5 3 个编码转录因子的基因，约占其估计基因 总数的5 9 ，而拟南芥中植物特有的转录因子约芒i 4 5 t 3 6 1 。拟南芥中转录因子数量如此之大， 种类之多，表明了高等植物转录调控的复杂性，同时也表明转录因子研究的重要性。然而， 到目前为止，有关高等植物转录因子功能域的知识主要来自与动物相关转录因子氨基酸序列 的比较【3 7 1 。 9 河南农业大学硕士学位论文 1 3 2 植物转录因子与植物的生长发育和形态建成 高等植物的生长发育和形态建成是一个非常复杂的过程。在这个过程中，d n a 与蛋白 质起着主要作用，通过它们之间的互作，实现了对基因表达的调控。近年来发现的与植物生 长发育有关的转录因子主要有m y b 家族和m a d s 框家族等。近年来，人们已经从人、玉米、 拟南芥、金鱼草、水稻和棉花等多种植物中鉴定出了m y b 类转录因子【3 8 】。m y b 蛋白是转录 因子中非常重要的一类，而且是植物转录因子中最大的家族之一，参与植物次生代谢调控、 激素和环境因子的应答，并对细胞分化、细胞周期、器官的形成以及植物叶片的形态建成具 有重要的调节作用【3 9 , 4 0 1 。m y b 类转录因子家族是指含有保守的m y b 结构域的一类转录因子。 m y b 结构域是一段约5 1 5 3 个氨基酸的肽，包含一系列高度保守的氨基酸残基和间隔序列， 每隔约1 8 个氨基酸分布的色氨酸( w ) 残基，参与空间结构中疏水核心的形成。高等植物中，数 量最大、功能多样的是含有2 个m y b 区( r 2 和r 3 ) 的m y b 蛋白，仅在拟南芥中就有1 2 5 种之多， 估计在其他高等植物中也会有相应的甚至更大数量的r 2 r 3 类m y b 转录因子【3 9 1 。m y b 转录因 子家族以含有m y b 结构域为共同特征，广泛参与植物发育、代谢调节和植物激素的信号转 导。王栋等【4 0 】研究了拟南芥根特异表达转录因子a t m y b 3 0 5 过量表达对酵母细胞分裂周期的 影响，结果表明a t m y b 3 0 5 在酵母中的过量表达导致染色体凝缩、细胞核不能正常分裂、胞 质分裂不能进行、产生单核长细胞。因为许多功能保守的植物基因在裂殖酵母中和植物细胞 中具有相似的功能，因此可以推测植物m y b 可能与植物的细胞周期调控有关。植物m y b 转 录因子另一个研究得较清楚的功能是控制细胞和植物的形态建成编码m y b 类转录因子的 l h y ( i a t ee l o n g a t e d h y p o c o t y l ) 和c c a l ( c i r c a d i a nc l o c ka s s o c i a t e d ) 基因，对拟南芥生物钟有调 节作用。l h y 和c c a l 对光信号在转录和蛋白质水平的应答，暗示了m y b 类转录因子可能通 过光信号而参与生物生理节律的调控【4 。 m a d s 框是另一类数量庞大的基因家族，其广泛存在于人、动物、植物和真菌中，估计 在每种植物中约有2 5 - - - 3 0 种m a d s 框基因【4 2 】。m a d s 分别是m c m l 、a g a m o u s 、d e f i c i e n s 和s r f 的首字母缩写。其中m c m l ( m i n i c h r o m o s o m em a i n t e n a n c e l ) 是参与酵母细胞周期、细 胞生长、细胞代谢、专一性( s p e c i a l i z a t i o n ) 和决定细胞类型的调节因子【4 习；a g a m o u s ( a g ) 和d e f i c i e n s ( d e f ) 分别是拟南芥和金鱼草( a n t i r r h i n u mm a j u s ) 花器官特征基因( f l o r a lo r g a n i d e m 耐) 的产物 4 5 l ；s r f ( s e r u mr e s p o m ef a c t o r ) 是) k 类血清应答因子晰】。序列分析表明，在这 些转录因子中都含有一个由5 6 5 8 个氨基酸组成的高度保守的结构域，称为m a d s b o x 结构域， 从而将这类基因称为m a d s b o x 基因1 4 7 , 4 8 1 。m a d s 该类基因的结构、表达，以及功能进化与 植物花器官发生、花形态多样性的遗传机制和进化规律有密切的关系。对拟南芥1 4 9 l 和牵牛 花【5 0 】的研究表明，大多数m a d s 框基因参与控制花的发育，分别在花分生组织和花器官中表 达，还有部分基因在营养器官中表达，表明m a d s 框基因在植物发育中扮演多重角色。植物 m a d s 框基因除了调节花发育的作用外，还参与根、叶、果实、种子和胚胎的发育【4 9 。近年 来，通过对拟南芥表皮毛的分子遗传研究已发现了多个直接控制表皮毛发育的基因，它们都 1 0 河南农业大学硕士学位论文 编码转录因子【5 1 】，这表明高等植物的转录因子对表皮毛的发育起着重要的调控作用。这种调 控作用，是通过形成一个转录调控复合体来实现的。 a p 2 e r e b p 家族转录因子中包括与调控植物细胞周期、生长发育以及环境胁迫应答反 应等有关的一系列转录因子，其是植物所特有的一类转录因子，在拟南芥中该家族至少有1 4 5 个成员，根据含d n a 结合区的数目，a p 2 e r e b p 转录因子分为a p 2 ( a p e t a l a 2 ) 和乙烯应答 元件结合蛋白e r e b p ( e t h y l e n e - r e s p o n s i v ee l e m e mb i n d i n gp r o t e i n ) 两个大类型【5 2 】。19 9 4 年 j o f u k u 等，首先分离到了拟南芥的a p e t a l a 2 ( a p 2 ) 基因，a p 2 基因所表达的蛋白质含有两个 a p 2 e r f 的结构域。a p 2 e r e b p 转录因子分为5 个大的分支：d r e b 、e r f 、a p 2 、r a v 和其它。近年来，已经对许多a p 2 e r e b p 转录因子的功能进行了深入研究。通过对拟南芥 a p 2 、册f 玉米j 5 等突变体的分析，证明a p 2 亚族转录因子的功能主要是调控花、分生组 织、胚珠和种子等的发育过程。而e r e b p 亚族转录因子的功能主要是参与生物和环境胁追 的应答。其中，d r e b 类蛋白主要是参与了a b a 、干旱和低温等环境胁迫的应答；而e r f 类 蛋白主要参与了乙烯和病原等生物胁迫的应答【5 3 1 。 a p 2 亚族转录因子在分生组织中的作用中有两个基因与愈伤组织形成有关在芸苔属植 物b r a s s i c an a p u s 花粉形成过程中，利用减法杂交分离了一个表达上调的基因b a b y b o o m ( b b m ) 。这个基因与拟南芥a n t ( ain t eg - u m e n t a ) 基因的同源性很高，特异地 在种子和胚中表达。b b m 在拟南芥和芸苔中的异位表达造成转基因幼苗产生类似于胚和子 叶状的结构，包括肿瘤状物的生长、不依赖于激素的外植体再生以及叶和花的形态变异，说明 b b m 的功能与促进细胞生长和胚胎发生期的形态发生有关【5 4 1 。在烟草中异位表达b b m 基因， 转基因植株也表现出类似的表型，包括愈伤组织形成、叶片皱缩和不育【5 4 1 ，表明b b m 在烟草 中也激活了细胞增殖途径【5 5 1 。在枝条发育过程中，拟南芥a n t 和烟草n t a n t 基因的功能缺 失突变体产生细胞数目减少，侧枝体积减小的表型。相反，a n t 和n t a n t 基因的功能获得 ( g a i n o f - f u n c t i o n ) 突变体，细胞数目增加，引起胚胎和枝条扩大( m i z u k a m ia n df i s c h e r , 2 0 0 0 ) 。 此外，在已经分化的细胞中超表达_ a n t 基因，引起细胞增殖，产生愈伤组织、不定根以及枝 条【5 6 1 。这些结果证明，a n t 基因在器官形成中可以维持细胞分生能力并调节细胞增殖和器官 生长。而e r e b p 型转录因子仅含1 个a p 2 e r e b p 结构域，已发现有烟草e r e b p i - 4 ，番茄p t i 4 - 6 ，拟南芥r a v l 2 a t e b p , a t e r f l ，d r e b l a c 和d r e b 2 a b 等许多成员，分别与细胞发 育、激素、抗病、低温及干旱、高盐等信号传递有关【57 1 。 1 4 基因芯片技术 1 4 1 基因芯片技术概述 基因芯片馆e n ec h i p ) 【5 8 5 9 1 也叫d n a 芯片、d n a 俐( d n am i c r o a r r a y ) 、寡核苷酸阵 列( o l i g o n u c l e o t i d ea r r a y ) ，采用原位合成( i ns i t us y n t h e s i s ) 或显微点样技术将许多特定的寡核 苷酸片段或基因片段作为探针密集、规律地排列在1 平方厘米或l 平方荚寸大小的硅片或玻 璃晶片上，其容量可达2 0 4 0 万个基因探针，产生二维d n a 探针阵列，然后与标记的样 1 1 河南农业大学硕士学位论文 品进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一 探针上的荧光信号做出比较和检测唧, 6 1 , 6 2 。基因芯片可分为三种主要类型：( 1 ) 固定在聚合 物基片( 尼龙膜，硝酸纤维膜等) 表面上的核酸探针或c d n a 片段，通常