（作物遗传育种专业论文）特异性PCR在检测玉米ae基因中的应用.pdf

摘要 乇米是世界上三大作物之一。玉米淀粉是人类淀粉的主要来源，淀粉是乇米籽粒中 的 要积累物质，占籽粒总重的7 0 左右。淀粉是以淀粉粒的形式存在于植物体巾。普通 玉米淀粉是直链淀粉和支链淀粉的混合体，两者所占的比重大约分别为2 8 和7 2 。直 链淀粉由于其独特的理化性质，是一神高附加值的玉米淀粉。直链淀粉是重要的工业原 料，在工业上应用十分广泛，已发展到了3 0 多个领域。 然而普通玉米的直链淀粉含量在2 2 2 8 之间，很难在工业上加以利用。从普通玉 米中分离高水平的直链淀粉成本很高，因此科学家们开始寻找富含直链淀粉的植物资 源。高直链淀粉玉米研究的真正突破是发现a e 基因( 直链淀粉扩充者) 突变体，含a e 基因玉米胚乳的直链淀粉含量大大提高。后来又发现该位点的其它突变基因，对直链一 支链淀粉的比率可以起到微效修饰作用。 本研究利用a e 基因的序列，设计了2 2 对特异引物，利用这些特异引物对3 个生产 上常规玉米自交系和3 个具有a e a e 纯合基因型的高直链淀粉玉米自交系及它们的3 个 杂交材料进行标记，电泳检测，结果如下： ( 1 ) 引物4 、7 、1 0 、1 1 、1 5 、1 8 没有扩增出任何条带。 ( 2 ) 引物1 、1 2 、1 4 、1 6 、1 7 、1 9 在材料1 9 中全部扩出目的条带，没有筹异。 ( 3 ) 引物3 、6 、2 0 、2 1 在材料1 9 中出现多条谱带，每个泳道中都含有目的条带， 而且出现非常清楚的非特异性带谱。 ( 4 ) 引物2 在材料l 9 中都扩增出多条带，但没有出现目的条带。 ( 5 ) 引物8 、9 、l3 、2 2 在材料1 9 的扩增中有的出现目的条带，有的没有目的条带， 出现的条带没有规律性。 t 6 ) 引物5 在材料1 、2 、4 、5 、7 、8 中只扩增出一条特异带谱，在材料3 、6 、9 没有 条带。 引物5 表现出了很强的特异性，利用引物5 检测2 1 个玉米材料( 材料l l3 0 ) ，引 物5 在常规玉米自交系与高直链淀粉自交系的杂交种n 、1 2 、1 3 、【4 、1 5 、1 6 、1 7 、1 8 、 】9 、2 0 、2 l 、2 2 、2 3 、2 4 、2 5 、2 6 中出现非常明显的特异性条带，在普通玉米杂交种 2 7 、2 8 、2 9 、3 0 没有条带。结果证明这对引物可以将基因型a e a e 与a e a e 区分开，为 将普通玉米自交系快速改良为高直链淀粉玉米自交系提供了一种有效技术。 关键词：玉米；直链淀粉：a e 基因；分子标记辅助选择 s u m m a r y m a i z ei so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tc r o pp l a n t si nt h ew o r l da n dc o r ns t a r c hi sam a i n s t a r c hs o u r c eo fh u m a nb e i n g t h es t a r c hi sa m a i nb a c k l o gm a t e r i a lo ft h ec o r ns e e d ，t h e m a i z es t a r c hi sa b o u t7 0 o ft h es e e d t h es t a r c he x i s t si nt w of o r m s ：a m y l o p e c t i n a n da m y l o s e t h ec o m m o nc o r ns t a r c hi sam i x t u r eo fa m y l o p e c t i n a n da r n y l o s ea n dt h e i rc o n t e n ti sa b o u t 2 8 a n d7 2 r e s p e c t i v e l yb e c a u s eo fi t ss p e c i a lp h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e s ，a n a y l o s e s t m c hi sak i n do fh i g ha d d i t i o n a lv a l u es t a r c h a m y l o s es t a r c hi sa r l i m p o r t a n ti n d u s t r i a l m a t e r i a la n d a p p l i e di ne x t e n s i v e l yi nm o r e t h a n3 0f i e l d s t l o w e v e r ，t h ea m y l o s e c o n t e n ti nc o m m o nc o mi sr a t h e r l o w , g e n e r a l l y b e t w e e n 2 2 - 2 8 t h i sl i m i t e di t s a p p l i c a t i o ni ni n d u s t r yb e c a u s et h ec o s t o fs e p a r a t i n gt h eh i g h a n w l o s ef r o mt h ec o m m o n c o r ni sv e r y h i g h t h u s ，i ti sn e c e s s a r yf o r c o r nb r e e d e r st oe x p l o r e h i g ha m y l a s ec o r nt of i tf o ri n d u s t r i a lu s e t h eb r e a k t h r o u g ho fh i g ha m y l o s er e s e a r c hi st h e d i s c o v e r y o ft h ea e g e n e ( a m y l a s ee x t e n d e r ) m u t a t i o nb o d y , t h ea m y l o s ec o n t e n t sr a i s e d c o n s u m i n gw i t ha eg e n e a f t e r w a r d so t h e rm o d i l y i n gg e n e sa r ed i s c o v e r e d ，t h e ya f f e c tt h e r a t i oo f a m y l o p e c t i na n da m y l o s e t nt h ec u r r e n tr e s e a r c h ，2 2p a i r so f s p e c i f i cp r i m e r s w e r ed e s i g n e da c c o r d i n gt ot h ea e g e n es e q u e n c ep u b l i s h e di ng e n b a n k t h r e ei n b r e dl i n e so f c o m m o nc o r da n dt h r e ea em u t a n t i n b r e dl i n e sa n dt h r e em a t e r i a l so fh y b r i dl i n e sw e r em a r k e d ，t h r o u g hp o l y a c r y l a m i dg e l e l e t r o p h o r e s i sd e t e c t i n g ，t h er e s u l t a sf o l l o w i r g ： ( 1 ) p r i m e r 4 、7 、t 0 、1 1 、1 5a n d l 8 d i d n o ts h o w a n y b a n d s i n t h e m a t e r i a l l - 9 ( 2 ) p r i m e r1 、1 2 、1 4 、1 6 、1 7a n d1 9s h o w e dt a r g e tb a n d si nt h em a t e r i a ll 一9 ，t h eb a n d sh a v e n od i f l o r e n c e ( 3 ) p r i m e r 3 、6 、2 0a n d21s h o w e dm a n yb a n d si nt h em a t e r i a l1 - 9 ，i tc o n t a i n e d t a r g e tb a n d s a n do t h e ru n s p e c i f i cb a n d s ( 4 ) p r i m e r2s h o w e dm a n y b a n d si nt h em a t e r i a l1 - 9 ，b u ti ti sn o tc o n t a i n e d t a r g e tb a n d s ( 5 ) p r i m e r8 、9 、1 3a n d2 2s h o w e dt a r g e tb a n d si ns o m em a t e r i a la n dt h eb a n d sh a v en or u l e ( 6 、p r i m e r5s h o w e dt a r g e tb a n d s i nm a t e r i a l1 、2 、4 、5 、7 、8a n dh a v en ob a n d si nm a t e r i a l 3 、6 、9 t h e p r i m e r 5s h o w e d s t r o n gs p e c i a l t y , u s i n gp r i m e r5t od e t e c t2 1h y b r i dl i n e s ( m a t e r i a l l1 - 3 0 ) p r i m e r5s h o w e d t a r g e t b a n d si nt h e h y b r i d o fc o m m o ni n b r e dl i n e sa n da e m a t e r i a l ( m a t e r i a l1 1 、1 2 、1 3 、1 4 、1 5 、1 6 、1 7 、1 8 、1 92 0 、2 1 、2 2 、2 3 、2 4 、2 5 、2 6 ) h a v e n ob a n d si nc o m l t l o nh y b r i d ( m a t e r i a l2 7 、2 8 、2 9 、3 0 ) i ti sc o n c l u d e dt h a tt h i sp a i ro f p r i m e ro a nd i s t i n g u i s hh y b r i dl i n e sa e a ef r o mh y b r i do fh i g ha m y l o s em a i z ea e a e i ti sa n e f f e c t i v et e c h n o l o g yt oi m p r o v ei n b r e dl i n e si nc o m m o nu s et oi n b r e dl i n e so f h i g ha n a y l o s e m a i z e k e yw o r d s ：t o m ；a m y l o s e ；a eg e n e ；m o l e c u l a rm a r k e ra s s i s t e ds e l e c t i o n 1 1 甘肃农盐大学颈i 学位论文 特异性p c r 在检测玉米高直链淀粉基因中的应用 一、前言 玉米是世界上第三大粮食作物，我国的种植面积约2 0 0 0 力h m 2 ，总产已达到 1 2 亿吨左右。，成为世界玉米生产大国。玉米具有广泛的用途，尤其通过深 r ，e 产高价值的终端产品而使其成为高附加值( h i g ha d d i t j o n a v a l u e ) 作物。 i 随着社会的发展。玉米作为重要工业原料的市场有扩大的趋势。因此，。在保持高产 的基础上，尽可能改善品质是令后玉米育种的一项基本要求。 淀粉是玉米籽粒中的主要积累物质，占籽粒总重的7 0 左右，淀粉也是构成植 物王国的主要成分。玉米淀粉是人类淀粉主要来源之一，也是工业淀粉和以淀粉为 原料的深加工产业的主要原料。美国淀粉加工业9 5 的淀粉都是玉米淀粉。全世界 淀粉产量为3 6 0 0 万t ，其中的8 0 以上都是玉米淀粉。1 。淀粉是以淀粉粒的形式存 在于植物体中。普通玉米淀粉是直链淀粉和支链淀粉的混合体，两者所占的比重大 约分别为2 8 弃u7 2 “。商链淀粉由于其独特的理化性质，是一种高附加值的玉米 淀粉。高直链淀粉玉米是指直链淀粉含量高，而支链淀粉含量低的玉米。美圈高直 链淀粉玉米的直链淀粉含量一般规定在5 0 ( 指占总淀粉含量的百分比) 以上。直 链淀粉是重要钓工业原料，在工业上应用十分广泛，己发展到了多个领域。 目前高直链淀粉玉米都是利用胚乳突变基因。d u n n 等”。( 1 9 5 3 ) 报道一个乇米 隐性突变体( d u 、s u 、s u ：) 中直链淀粉含量达7 7 ，但这三个隐性突变体( d u 、s u 、 s u ：) 淀粉总合量明显下降。获得高水平直链淀粉并不明显地减少淀粉总含量的突 变是1 9 5 2 是v i n y a r d 和b e a r 发现位于玉米第5 条染色体上的a e 基因。3 e 突变体 使玉米直链淀粉大幅增加，在一些修饰基因的作用下可以进步增加直链淀粉的含 量，达到5 0 一7 0 ( b a n k sa n dg r e e nw o o d1 9 7 5 ) “。 由于直链淀粉含量由隐性基因a e 控制，所以基因型a e a e 与a e a e 在形态很难 区分开，而普通的物理化学方法又破坏了种子的完整性，常规玉米育种中通常通过 自交以获得高直链淀粉自交系a e a e ，但这种方法延长了育种的年限，限制了a e 基 因在高直链淀粉玉米育种中的应用。 本研究根据a e 基因序列设计专门的引物，对生产上常用的几个骨干自交系和 县有a e a e 纯合基因型的3 个高直链淀粉玉米自交系及其杂交材料进行分子标记， 肃农业大学 t 受j 一学位论文 筛选出能够检测出a 。基因( 包括存在于基因型a e a e 和a o d e 中的a e ) 的特异引物 并利用这些引物检测2 1 个玉米杂交材料，旨在将具a e a e 基因型的普通玉米与具 a e a e 杂合基因型的普通玉米区分开束，把高直链淀粉材料的选择从收获后提前到 苗期，在将隐性目标基因d e 从供体向受体转移时，使交替回交变为连续回交，以 缩短育种年限。 二、文献综述 ( 一) 我国玉米发展的历史和现状 玉米起源于南美洲，然后逐步向高纬度扩展，从南纬3 0 到北纬5 8 均有种植。 栽培面积最大的是北美洲，其次是亚洲、拉丁美洲、欧洲、非洲和大洋洲。通过驯 化、杂交和人工选择形成了适应温带环境的早熟、耐旱和对光周期反映迟钝的各种 生态类型。据考证，玉米于1 6 世纪传入我国在相当长的一段时间内主要供作备 荒济贫的粮食作物，耕作粗放，品种退化，产量偏低，发展缓慢。直到2 0 世纪， 在现代科学技术兴起后，玉米才有了较快的发展，从世纪之初在粮食作物中排行为 “六谷”，逐步升至第五，第四，直至仅次于水稻，小麦而位居第三。玉米杂种优 势的研究起自于1 9 世纪中叶的西方国家，我国对玉米杂种优势的研究始于2 0 世纪 1 三十年代，但因连年的内战外患，所获得的有限育种成果未能在生产上大面积利用。 t 直到5 0 年代才推广品种间杂交种，6 0 年代推广双交种，7 0 年代推广单交种。随着 优良杂交种推广和综合配套栽培技术的应用，我国玉米生产得到较快的发展，播种 面积、单产和总产均稳定增长。1 9 9 6 年和1 9 9 8 年，我国玉米总产量甚至超过小麦， 成为继水稻之后的第二大粮食作物。随着畜牧业及粮食加工业的发展，玉米在我国 粮食生产中的地位越来越重要。但是，目前我国玉米生产中也存在许多问题”：( i ) 种质基础狭窄“1 。我国生产上使用的玉米杂交种种质基础8 0 左右来源于塘四平 头、旅大红骨、兰卡斯特和瑞德黄马牙4 个杂种优势群，经过这4 大种群改良的种 质聚集了较多的有利基因，表现出性状优良，生产力较高。随着玉米生产力发展、 种植密度提高及病虫害蔓延，这些传统的种质系统的抗逆性已不能完全适应生产的 发展，开发新的种质资源已成为各国玉米育种发展的新动向；( 2 ) 我国玉米的商品 品质较差。目前我国玉米生产上主要使用的品种以马齿型为主”“，产量高但品质差， 亡其是东北玉米的含水量高，已不能满足国内外市场对玉米多方面的需求，改善玉 米的品质已成为当前玉米育种和生产发展的重要工作。 h 肃农业大学硕士学位论文 ( 二) 高直链淀粉国内外研究现状 1 高淀粉玉米的概念 广义的高淀粉玉米泛指淀粉含量高的玉米类型或品种。根据淀粉的性质高淀粉 玉米又可以划分为混合型、高直链淀粉型和高支链淀粉型3 种。生产上的普通马齿 玉米，淀粉含量一般在7 0 左右，我国现在将淀粉含量超过7 4 的品种视为高淀粉 玉米，这种玉米的淀粉是直链淀粉和支链淀粉的混合物。在我围，加工和利用的淀 粉基本上是混合淀粉。普通马齿玉米胚乳中约含2 5 的直链淀粉和7 5 的支链淀粉。 高直链淀粉玉米是指直链淀粉含量高而支链淀粉含量低的品种。美国高直链淀粉玉 米杂交种的直链淀粉含量一般规定在5 0 ( 指占总淀粉含量的百分比) 以l 。高支 链淀粉玉米又称糯玉米或蜡质玉米，其支链淀粉含量一般占淀粉含量的9 5 以i 二 f i l 钔 淀粉是以葡萄糖酐为基本单位组成的碳水化合物。直链淀粉约含2 0 0 2 0 0 0 个 或更多的葡萄糖酐，以1 ，4 方式结合而形成直链状；支链淀粉的分予量更大，除 了以1 ，4 方式连接外，还有在第6 个碳位上以1 ，6 方式连接的葡萄糖酐分支。此 外玉米淀粉还有一些是以1 ，3 连接的其他聚合物。由于直链和支链淀粉的碘亲 和力不同而产生不同的碘染色效果，成为鉴别两种淀粉的简易方法。直链淀粉染色 时呈深蓝色，而支链淀粉成红褐色。由于淀粉分子是不均匀的，侧枝的多少、长短 和线性片断的长短影响碘化淀粉复合物和对碘的吸收力，因此染色的深浅也有定 差异。 2 直链淀粉玉米的分级 商品化的直链淀粉玉米有4 种类型：第一种为五级( 含直链淀粉5 0 一6 0 ) ， 第二种为六级( 含直链淀粉6 0 一7 0 ) ，第三种为七级( 含直链淀粉7 0 一8 0 ) ，第 四种为八级( 含直链淀粉8 0 以上) 。1 。 3 高直链玉米淀粉的应用价值 3 1 食品工业 不同直支比例的淀粉作食品原料有不同的加工性能。直链淀粉是由分子量较 小的直链分子组成的淀粉。直链淀粉溶于水，不溶于脂肪。据研究，在糖果制造中 作为定型剂，可使糖果的模制和定型时间大大缩短，生产能力提高和成本降低：作 为增稠剂，用于布丁和精制食品的制作；在马铃薯酱和苹果酱制作中加入直链淀粉， 1 = | 赢农业人学硕士学位论文 可以改善果酱质地，用直链淀粉包衣处理薯条，可减少油炸马铃薯薯条内层对油分 的吸收。 3 2 食品包装材料 用直链淀粉可以制造种半透明纸，不透氧气和氮气，透二氧化碳和脂肪也很 少，且这种纸可以食用。七十年代以来，这种纸已用作面包酶的包装，预期在食品 工业中的用途会日益广泛。美国曾申请过直链淀粉生产一种薄膜的专利，这种膜在 冷热状况下都不溶化，它既可包装粉状产品有可包装速冻食品。美国玉米公司在 内布拉斯加( 中西部研究所驻地) 建立了大型的直链淀粉膜的实验工厂。皮奥里亚 实验室用羟丙基的直链淀粉( 7 1 ) 制作的薄膜做了一些实验，表明羟丙基化增强 了抗破裂的能力，这种型号的薄膜适用于包装干产品。 3 3 休闲食品 以淀粉及淀粉衍生物为原料生产的休闲食品以膨化食品为主。这些原料的基本 性质，如粘滞力、膨胀度、水分等是影响膨化效果的主要因素“，而体现这些性质 的主要是淀粉的种类，直链淀粉和支链淀粉有显著不同的膨化效果，突际加工过程 中常通过不同的直支比以得到不同的效果，直链淀粉较支链淀粉有更强的抗拉伸 力，能够增加产品的脆性和强力。直链淀粉含量高的面团成型性好，因而增强了面 团的干燥及切割性能；支链淀粉在面团中形成一个网状结构，在膨化过程中两团中 的水分变成蒸汽被压出时使网状结构形成多孔组织。 3 4 低脂食品 美国二战之后快餐业开始起步，但是由于这类食品的高油高脂性，在前几年的 发展中处于缓慢状态。近年来以高直链淀粉作为油脂、奶油的替代物解决了这一问 题，如在某些冰激凌中以直链淀粉代替大量奶油，某些夹心饼干中以直链淀粉代替 油脂等，制成“低脂食品”。研究结果表明，用高直链玉米淀粉作为脂肪替代物研 制成的低脂食品，具有很好的流变学特性及稳定性，与全脂奶油产品具有相同的口 感，且生产过程只需原来的生产巍，不需要添加另外的设备“。 3 5 环境保护 玉米高直链淀粉最具吸引力的应用便是生产光解塑料，是解决目前r 益严重的 “白色污染”的有效途径“。目前，我国乃至全球的“白色污染”都是一个突出 的生态和社会问题。实验证明，目前大量使用的塑料袋、快餐盒等塑料制品至少需 1 5 0 年才能被土壤中的微生物降解掉。直链淀粉( 线性多糖) 在形成连接区部分结构 甘肃农业大学硕十学位论文 和形成薄膜甚至形成高强度和高韧性的纤维的能力方面，具有线性分、子共同的特 性。与其他线性分子不同之处在于由直链淀粉生产的塑料产品具有牛物可降解性。 3 6 工业 直链淀粉是优质的桨纱原料，可作为玻璃状定型胶料，制作波纹提花板和制造 瓦楞纸箱的快干粘合剂等。 3 7 医疗保健 高直链淀粉食品是糖尿病人的理想食品，被称为“功能性食晶”( f u n c ii o f k t l f o o d ) 。国外许多人类营养研究实验证实了直链淀粉的医疗保健价值”“3 。高直链 淀粉还是胆结石及高血压病人的理想食品，具有防止胆结石及降低血液胆固醇的作 用。6 ”1 。直链淀粉也影响人体内其他营养元素的吸收。，尤其是一些重要的微量元 素，如z n ，f e ，c a ，p 等，可以说这是直链淀粉玉米潜在的重要作用。 ( 三) 高直链淀粉玉米研究的发起 自从1 9 4 2 年s e h o c k ”发表直链淀粉和支链淀粉分离技术以后，人们对这种特 殊淀粉在淀粉工业中的利用产生了极大的兴趣。后来又有一些新的发现使淀粉分馏 工艺取得进展从而扩大了直链淀粉在食品工业中的应用。但是，从普通淀粉中分离 直链淀粉的成本很高，因此，科学家们开始寻找富含直链淀粉的植物资源。早在 1 9 5 3 年，o u n n 等。”在对玉米的研究中发现了比一般玉米含量更高的直链淀粉玉米 突变体，d u s u s u ：三隐性基因纯合体的直链淀粉含量高达7 7 ，同时也发现该突变体 的总淀粉含量明显减少。为寻找直链淀粉合成水平高的玉米，对包括三隐性突变体 在内的本地和外来玉米种质做了大量测定分析。发现来自北美、南美和中美洲的 3 9 个不同的印地安玉米中直链淀粉含量幅度为2 2 2 至2 8 3 ，平均值接近2 7 。 1 9 5 5 年，d e a t h e r a g e “”等对包括7 0 多个外来品种在内的2 0 0 多个自交系和品种的 研究表明，直链淀粉含量幅度为0 3 6 。 高直链淀粉玉米研究的真正突破是1 9 5 2 年发现了位于第5 条染色体的a e 基 因，该基因被称为直链淀粉扩充者。令人满意的是8 e 基因在提高直链淀粉含量的 同时总淀粉含量并没有显著下降。后来发现了该位点的其他突交基因，这些等位基 因与a e 突变基因相比，对直链一支链淀粉的比率可以起到微效修饰作用。 1 影响玉米淀粉的遗传基因及其表现 据报道，在玉米基因库中，存在着许多表现隐性单基因遗传的胚乳突变基因， 这些突变基因不同程度地影响胚乳中碳水化合物的数量和质量。h o l d 等m 和 甘肃农业大学硕1 1 学付论文 n e l s o n ”“分别比较了若干肛乳突变基因在籽粒发育时期胚乳碳水化合物组分的变 化。从表1 可见b t ( 易碎1 ) 、b t 。( 易碎2 ) 、s h 2 ( 皱缩2 ) 、s u ( 甜质1 ) 基因可 以显著地降低胚乳组织中淀粉的含量，称为淀粉缺陷型的胚乳突变基因；而w x ( 糯 质) 、s u 。( 甜质2 ) 、d u ( 暗胚乳) 和a e ( 直链淀粉扩增) 基因并不导致胚乳淀粉 含量的明显下降，被称为淀粉修饰型胚乳突变基因。 表1 不同胚乳突变基因型的碳水化合物组份 t a b e1t h eq u a n t i t i e so fv a r i o u so fd i f f e r e n te n d o s p e r mm u t a t i o ng e n o t y p e s 正常型 b t b t 2 s n ! s n d 正常型女 a e d u s u 6 8 5 5 52 3 8 ，9 4 4 9 5 32 3 8 ，3 8 7 0 6 7 3 7 2 。7 8 0 ，7 5 4 88 0 0 931 6 9 2 97 4 2 695 9 8 1 1l2 1 o 1 9 95 2 1 4 2 64 9 0 1 7 12 5 4 3 0 。64 2l 4 3 85 4 3 4 6 25 2 6 1 2 ，62 0 7 2 02 9 1 0 71 93 6 81 7 6 3 27 1 1 2 02 2 5 0 。71 0 9 0 6 474 1 071 58 8 68 7 j88 6 67 5 7 1l l6 3 3q8 1 1 82 1 3 1 6 22 1 3 5625 1 4 02 63 681 7 8 3 43 9 3 044 3 14 ，3 283 5 2529 264 3 1 1 51 7 51 6 22 4 655 8 3 资料来源于n e l s o n ( 1 9 8 0 ) ，样本取自授粉后2 2 d 的籽粒 资料来源于h o l d ee ta l ( 1 9 7 4 ) ，样本取自授粉后2 1 d 的籽粒 淀粉修饰型突变基因( 表2 ) m “1 可以改变淀粉的化学或物理属性，是淀粉品 质遗传改良的重要种质资源。其中w x 突变体不含直链淀粉，相反，d u 、s u j 和a e 基因不同程度地增加直链淀粉的含量，以a e 最为明显。研究表明淀粉修饰型胚乳 突变基因影响淀粉合成过程中的某些酶促反应，从而导致胚乳组织中淀粉数量和质 6 8 o 8 盯 虬 晡 眦 锄 m 肃农业大学硕十学位论定 量的变化”1 。w x 含有少量的淀粉合成酶， 凶降低淀粉合成酶tt 和分支酶i 的活性， 同时植物糖原分支酶的活性增加。d 、，基 而降低了支链淀粉所占的比例和脏乳中 表2 胚乳突变基因符号、位点和表现型 t a b e2t h es i g n ，l o c ia n dp h e n o t y p e so fs t a r c h - m o d i f i e de n d o s p e r mm u t a t i o ng e n e 表3 已报道的4 中突变体再聚合酶损伤方面的影响 t a b l e3e f f e c to ff o u rm u t a n t sr e p o r t e do np o l y m e r a s ed e t e r i o r a t i o n 淀粉总贮量：a e 基因导致一个分支酶完全缺失，从而提高了直链淀粉含量；至今 尚未见有关s u ：基因如何影响淀粉合成过程中的酶促反应的报道( 表3 ) 。 a e 、d u 、s u 。、w x 突变基因既可单独也可以以多基因组合形式影响淀粉成分中 直链淀粉的相应比率。采用碘化法测试比较时，a e 的影响比d u 、s u 。显著( 直链淀 粉的百分率高) ( k r a m e r ，1 9 8 5 ) ”。g a r w o o d 等( 】9 7 2 ) 。”利用不同双隐性，r _ = 三隐 性突变材料，研究了隐性单基因的互作效应。在双基因和三基因中普遍存在着上位 甘肃农业大学预十学位论文 性和互补性。w h i t e ( 1 9 9 4 ) 试验证明w x 对a e 、s u z 、d u 起上位作用，抑制直链淀 粉的形成( 表4 ) 。除d u 、w x 组合含有少量淀粉外，其余包含有w x 基因的双基因 和三基因组合中均不含直链淀粉，而a e 基因突变体和包含b e 基因的双基因和三基 因组合含有较高的直链淀粉。a e 和w x 基因以外的各种基因组合，直链淀粉含量介 于a e 和w x 的基因突变体之间。 2 淀粉修饰基因对淀粉物理特性和酶 活性的影响 一些淀粉的物理特性对于确定淀 粉生物价值和经济价值是很重要的。多 糖的微结构、直链淀粉和支链淀粉分布 比率决定淀粉粒的物理特性，淀粉粒重 要的物理特性包括形态学特征，直链淀 粉含量，结晶性，胶凝化温度，吸光性 和可消化性等。所有这些特性都可被不 同的胚乳突变基因所改变。淀粉粒具有 结晶结构，其结晶性由直链淀粉所决 定。淀粉粒还表现出偏振性的双折射， 并具有独特的x 射线衍射图样。淀粉的 结晶性，由直链淀粉所决定。普通玉米 淀粉粒是圆形的，x 光衍射所表明的结 构为a 。w a n g 等“”发现w x 籽粒淀粉粒 具有与普通玉米同样的结晶特点( x 射 表41 6 种基因型玉米的直链淀粉含量 t a b l e4a m y l o s ec o n g t e n t so fs i x t e e n d i f f e r e n tg e n o t y p e so fm a i z e ( ) 基因型 g e n o t y p e 直链淀粉 线衍射a 型) ，而a e 突变体，不具有高度的结晶度，并常常在结晶活化部位产生非 结晶性延长部分，形成不规则类型的淀粉粒。a e 基因型以及带a e 基因的双隐性突 变体都表现b 型。a e 基因具有两种不同形态的淀粉粒，一种是圆形，一种是不规 则的x 射线衍射图样：s u z 基因型淀粉在发育早期为a 型x 射线衍射图样，成熟后 则为b 型。淀粉粒丧失双折射是测定淀粉胶凝特点的一个方法。w x 突变体具有与 普通玉米相似的双折射顶点温度( b e p t ) ，s u 。突变体具有非常低b e p t 的二次凝胶， e r e 基因表现出高的b e p t 值，并对d u 、s k i ：、w x 和它们的组合起上位性作用。 淀粉糊化过程中的热力学属性是淀粉品质的重要特征之一，李建生。”1 以两套近 卯叫铺四0盯惦0 0 “够坞 0 他 常o o o；札靴叭帆眦惦w 帆眦零兰二兰竺意黧罴 甘肃农业大学硕“卜学位论文 等基因系为材料，在相同的遗传背景条件下比较了不同胚乳突变基因淀粉的热力学 性状( 表5 ) ，结果表明，胚乳突变基因对淀粉糊化的热力学性状有显著影响。普 通玉米淀粉内焓为1 0 4 5 j g ，最大峰值是7 1 8 8 。c 。a e 基因的热力学性状最显著 特点是糊化温度范围较广。w x 基因使糊化峰值稍有提高。d u 基因型的热力学性状 与普通玉米基本相似。s u ，淀粉的糊化温度几乎比普通型低1 0 ，内焓也显著降低。 表5 不同胚乳突变基因型淀粉热力学性状的比较 t a b l e5t h ee o m p a r i s o no ft h e r m o d y n a m i ca m o n gd i f f e r e n te n d o s p e r mm u t a t i o ng e n o t y p e s 资料选自l i ( 1 9 9 5 ) ，均为两种遗传背景的平均值 提高淀粉的消化率对提高淀粉的营养很重要。在不同的淀粉修饰型突变基因 中，淀粉粒的消化率存在广泛差异。i n o v c h i l1 9 8 8 研究表明含s u 。基因突变体可 消化率最高，s t 。、w x 组合和d u 、s u ：、w x 组合淀粉可消化率比正常玉米淀粉高2 5 5 倍。w x 基因型的相应可消化率比正常玉米淀粉高1 5 倍，而a e 突变体籽粒淀粉非 常抗水解化酶消化。3 。这些差异的存在可能与直链淀粉、支链淀粉及淀粉分子微 结构和可溶性有关，遗传背景的基因型互作可能对淀粉胶凝起主要影响。 3 a e 基因的利用 甘肃农业大学硕士学位论文 由淀粉突变基因和它们的组合所决定的淀粉特性的广泛变异性表明，这些基 凼和组合可以有效地用于特用玉米的遗传改良。在高直链淀粉商业用途方面，a e 笨因可把直链淀粉提高到5 5 6 5 “。有试验表明通过积累a e 修饰基因的轮刚选择 技术，可使直链淀粉含量达8 0 以上( 表6 ) 。v i n e y a r d 等“2 1 用一个普通a e 资源与 13 5 个不同玉自交系杂交，结果表明直链淀粉含量变化幅度为3 6 5 一6 4 9 。后来 g a r w o o d “”研究表明这些差异是a e 主基因和修饰基因相互作用的结果。自2 0 世纪 7 0 年代以来商业化高直链淀粉玉米杂交种有两种类型：直链淀粉含量在5 0 以上的 v 型( c l a s sv ) 和直链淀粉含量为7 0 8 0 的v i i 型( c l a s sv i i ) 。美国有少量的 种植面积，每年种植1 2 - 1 6 万h m 2 ，集中分布在伊利诺斯和下印第安那州中部。 现在由c u s t o mf a r ms e e do fm o n m e n c e 公司推广、生产和上市的高直链淀粉玉米 品种，其直链淀粉含量基本上是级( 直链淀粉含量为9 0 以上) “。我国目前没 有高直链淀粉玉米品种，也没有高直链淀粉玉米种植和淀粉生产。顾晓红”分析鉴 定了国家种质资源库长期保存的玉米种质资源材料表明，我国的玉米种质材料中高 淀粉资源材料非常稀少，没有高直链淀粉材料。近年来，我国一些育种单位已经引 进了一些高直链淀粉种质资源，并开展了前期的探索性研究。 表6a e 轮回选择的结果 t a b 】e6t h er e s u 】to fa es e l e c t i o i l 轮数 l23467 891 0 直链淀粉含量6 8 8 7 1 8 1 囊3 0 7 4 37 9 88 0 08 1 0 8 3 08 4 8 ( 四) 遗传标记及其在玉米育种中的应用 1 遗传标记的发起 在植物遗传育种研究中，遗传标记是与目标形状紧密连锁的可遗传的标识， 包括形态标记、细胞标记、蛋白质及同工酶标记、d n a 标记等，是目的基因的间接 或直接表现形式，也是遗传育种工作中对目标基因进行鉴定、定位和选择的重要工 具。人们借助遗传标记以研究目标性状的遗传规律，改良和培育动植物品种，以期 得到高产、优质、抗逆性强的优良品种。 在人类社会发展的很长一段时间内，人们一直把肉眼可见的生物外部形态特征 作为遗传标记来选择、驯化和改良动植物。进k _ - 十世纪，随着生物学各个分支学 科的发展，遗传标记的范围也相应的拓宽，从外观形态的表现型扩展到，l 理、生化、 1 0 | 肃农业大学硕十学位论文 细胞、病理和免疫等多个方面，诞生了生化标记和细胞学标记。从检测方法的角度 ，看，e 化标记是一类新型的遗传标记，表现的是生物分子水平上的差异，但是仍然 没有突破基因表达的范围。而且由于方法和技术上的限制，迄今经常使用的同工酶 标记的数目还相当有限，难以满足遗传育种研究的需要。 1 9 8 0 年，b o t s t e i n 等首先提出r f l p ( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h is m ，限制性片断长度多态性) 可以作为遗传标记，从此开创了直接应用 d n a 多念性作为遗传标记的新阶段。 2 遗传标记的种类 2 1 形态标记 形态标记是一种特定的肉眼可以看见的外部特征，而且影响这一特征的基因及 其所在的染色体、基因与相邻基因在染色体上的相对位置都已得到明确的阐述，可 以用其标记某一染色体区段，并对其他未定位的基因进行连锁分析。常见的形态标 记有株高、穗长、粒色、千粒重等。形态标记简单直观，长期以来对目标性状遗传 规律的研究、动植物种质资源的鉴定咀及育种材料的选择通常都是根据形态标记来 进行的。带有形态性状标记的遗传材料被称为标记基因材料，可以通过自然突变或 物理化学诱变获得。 人们开发利用形态遗传标记的时间最早，但由于形态标记数量少，多念性差， 易受环境条件的影响，人为地通过诱变等方法培育形态标记材料不仅所需周期长， 而且许多形态标记还可能对农艺形状产生不利的影响，因而其应用有局限性。 2 2 细胞学标记 细胞遗传学研究发现，物种染色体数目的变化如缺体、单体、三体、端体等非 整倍体，缺失、易位等染色体结构变异，各种异形染色体以及分带带型( c 、g 、n 带) 等都具有特定的细胞学特征。在其与其它具有正常染色体的品系产生的杂种或 衍生系中，由于减数分裂过程异常，容易导致特定染色体上基因的分离与重组发生 偏离，因而可以作为一种遗传标记来测定基因所在的染色体及其相对位置或通过染 色体代换等遗传操纵进行基因定位。 染色体结构变异体和非整倍体等细胞学标记材料，常常具有特定的形态学特 征，使其很容易与对应的二倍体区分开来。此外，培育带有形态学标记性状的非整 倍体及染色体结构变异的衍生系，即将形态学标记与细胞学标记结合起来，可以在 杂种后代中直接根据形态学标记确定个体细胞学特征，不必进行染色体鉴定。以上 苎塑竖些叁兰里主兰垡丝茎 这些都有助于提高细胞学标记的利用效率。 、 2 3 生化标记 生化标记主要包括同工酶和种子贮藏蛋白标记 同工酶是一类结构和理化性质不同、但催化功能相同的酶。与其他蛋白质一样， 同工酶也是基因表达的产物，所以酶谱的差异主要是由决定酶本身的等位基冈或非 等位基因的差异造成的。同工酶呈共显性遗传，杂合和纯合的位点易于区别，在分 离群体中能区分基因型，因而被用于品种指纹分析。和大多数基因一样，编码酶的 基因也可以通过适当的方式定位于染色体上，并可以确定它们之间的连锁关系。但 同二r 酶标记仍因位点数量不够和基因表达具明显的组织特异性等缺陷而不能成为 理想的遗传标记，因而其应用也具有局限性。 种子贮藏蛋白分为醇溶蛋白、谷蛋白、清蛋白、球蛋白等，可用于品种鉴定工 作。这种标记还可转化为p c r 标记，比较种间或种内的遗传多态性。 到目前为止，已在小麦上发现了1 6 0 多个生化标记位点，并进行了染色体的定 位。随着定位染色体的增加，就可咀利用它们作为一种遗传标记来确定未定位的其 它基因。燕麦抗秆锈基因p g 。与一个5 6 6 k d a 的多肽位点连锁，抗冠锈基因p c x 与 燕麦蛋白b ：( 以互引相) 、及与b 。( 以互斥相) 紧密连锁，这为燕麦育种中检测这 些基因的存在提供了有力的工具。 2 4d n a 分子标记 d n a 分子标记是指生物基因组d n a 经限制性内切酶酶切、聚合酶链式反应( p c r ) 扩增或两者结合等措施处理，经电泳检测到的反映基因组某种变异特异性1 3 n a 片 断。 与表型标记相比，d n a 标记有许多优点：( 1 ) 直接反应d n a 分子水平上的变异， + 能对个体发育时期的个体、组织、器官甚至细胞作检测，不受环境的影响，也不受 基因表达与否的限制，为研究工作提供了极大的便利；( 2 ) 多态性高，以至于无需 专i o j 造特殊的遗传材料；( 3 ) 其数量大，几乎是无限制的，遍及整个基因组；( 4 ) 分子标记对生物体通常没有不良影响，也不影响生物性状的表现，即为“中性”； 一些分子标记表现为共显性，能分辨所有基因型。分子标记所有这些特性，使其得 到广泛应用。在农业的基础与应用研究领域，分子标记技术已开始用于作物种质资 源和育种的研究，特别是在构建分子遗传图谱和标记目标性状方面取得了很大的进 展”。 h 肃农业大学硕士学位论史 目前用于标记基因的分子标记技术主要有r f l p 、r a p d 、s s r 、a f l p 等，这些标 记的特点十分显著( 表7 ) 。“驯。 表7 常用分子标记特性比较 t a b l e7 c o m p a r is o no fs e v e r a lo f t e nu s e dm o l e c u l a rm a r k e rc h a r a c t e r s 2 4 1r f l p 标记( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) “i 所谓r f l p ，是指不同生物个体基因组d n a 用限制性内切酶酶切后，用放射性 同位素( 通常是r ) 或非放射性物质( 如地高辛等) 标记的探针( 常用随机的基 因组克隆或c d n a 作为探针) 进行分子杂交，通过放射自显影( 或非同位素技术) 观察酶切片断长度的差异。r f l p 标记是最早用于构建遗传图谱的d n a 分子标记， 截至目前，各种作物遗传图谱中r f l p 标记占大多数。其优点是：( 1 ) 无表型效应， 检测不受环境条件和发育阶段的影响；( 2 ) 共显性，可以区别纯合基因型和杂合基 因型；( 3 ) 可利用的探针多，可以检测到很多