（作物遗传育种专业论文）花生种子全长cDNA文库的大规模测序和生物信息学分析.pdf

独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作 了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本 研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯 他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名： 罗颦胡嗍蜥6 “a 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。一 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：罗锯硝 日期： ；卯髻参， 指导教师亲笔签名：灿牡 日期：己川声陟 福建农林火学硕士学位论文 摘要 花生是世界上五大油料作物之一，也是我国单产、总产和出口创汇额最高的 油料作物和经济作物。它是一种地上开花，地下结果，其收获产品主要是地下荚 果的作物。荚果的生长发育状况直接关系到花生的产量和品质的形成，这与荚果 本身的基因的表达和调控密切相关。了解花生种子发育牵涉的基因对花生荚果发 育和产量品质形成等有重要意义。本研究主要对已建立的花生种子不同发育阶段 的全长c d n a 文库的进行了大规模测序，对得到的种子表达基因序列进行了生 物信息学分析和功能预测，得到了一些与花生种子发育、品质形成、抗性等等相 关的基因，可为以后的深入研究提供参考。主要研究结果如下。 1 从文库中挑选2 0 0 0 个克隆做5 端测序，得到1 8 2 7 条表达序列标签( e s t ) ， 经初步分析和功能注释，发现8 0 的e s t 属于已知功能的基因，另有3 6 6 条e s t 序列为未知功能基因，所得到的e s t 中有7 7 0 条属u n i g e n e ，己在g e n b a n k 登录 ( 登录号为e s 4 9 0 6 4 3 4 9 1 2 9 5 和e y 3 9 6 0 0 3 3 9 6 1 1 9 ) 。这些基因中有相当部分是 花生首次报道。对其中的1 0 0 条功能较重要基因进行了双向测序，得到了5 1 条 全长基因。 2 根据测序获得的1 8 2 7 条e s t ，按功能进行分类，共得到4 0 8 不同的基 因，其中7 4 个基因至少有两个以上同功、同源拷贝或一致序列，共有1 2 2 0 条序 列，占6 6 7 。其中一些贮藏蛋白基因有高度同源性拷贝。对所得到的功能基因 可分为编码种子贮藏蛋白、能量、运输、蛋白质合成相关蛋白、蛋白降解和修饰、 信号传导蛋白、抗逆相关蛋白、光合作用相关蛋白等9 类功能的基因。对重要的 代谢途径进行分析，发现有1 2 个基因参与脂肪酸代谢，有9 个基因参与能量代 谢，有4 0 个基因参与植物抗病性有关，有2 2 个基因与抗耐胁迫有关。 3 1 8 2 7 条e s t 序列中去除冗余序列，用s s r i t 软件搜索含有s s r s 的e s t 序列， 得到了1 9 条不同的s s r 序列，并对这1 9 条e s t - s s r ( c s s r ) 进行了引物设计，这些 s s r 标记可供用于花生的性状分子标记和遗传作图。 4 根据功能整理分类的结果，从全长基因中选出类似野大豆种子成熟蛋白基 因l e a 4 和类似大豆钙结合蛋白基因进行结构和功能预测。这两个基因全长分别 为7 5 0 b p 和1 2 5 0 b p s ，编码区长度为5 1 5 b p s 和6 7 8 b p s ，编码1 7 2 个和2 2 5 个氨基 酸。通过对l e a 蛋白分析l e a 蛋白基因具有干旱保护功能，可以用于植物的抗逆性 福建农林人学顾士学位论文 基因工程育种。钙结合蛋白一个酸性蛋白，亲水性较弱，疏水性较强，主要以 螺旋为主，间隔有、一些延伸链和大量的不规则盘绕散布于整个蛋白质中，具有 广泛的生理功能。 以上研究结果初步揭示了花生荚果发育过程中部分表达基因的组成结构，并 对基因进行了功能注释和分类，获得了一些有研究价值的基因，并对个别基因进 行了结构和功能的预测。这花生分子生物学和基因工程的深入研究提供了基础。 关键词：种子；表达序列标签；功能；c d n a 文库；生物信息学分析 2 福建农林大学硕士学位论文 a b s t r a c t p e a n u ti so n eo ft h ef i v em a j o ro i lc r o p si nw o r l d i ti sa l s oa l li m p o r t a n to i la n de c o n o m i c c r o pr a n k e dt h ef i r s ti ny i e l dp e rh e c t e r , t o t a lo u t p u ta n de x p o r ta m o u n tf o rc a s ho f a l lt h eo i lc r o p s i nc h i n a i ti sag e m o c a r p i cc r o pw i t ht h ec h a r a c t e r i s t e so ff l o w e r i n ga b o v et h eg r o u n db u t p o d d i n gu n d e rt h eg r o u n d ，a n dw i t hp o d sa st h em a i nh a r v e s t e do r g a n t h dp o dg r o w t ha n d d e v e l o p m e n ts t a t u so fp e a n u ta f f e c tm u c ho nt h ey i e l da n dq u a l i t yf o r m a t i o n , w h i c hi sa l s o r e g u l a t e db yg e n e se x p r e s s i o na n dr e g u l a t i o n i np o dd e v e l o p i n g m i n i n ga n ds t u d i n gg e n e s i n v o l v e di nt h ep o dd e v e l o p m e n ti so fg r e a ti m p o r t a n c et of u t u r ep o dy i e l da n dq u a l i t y i m p r o v e m e n t i nt h es t u d yw ef i r s tc o n d u c t e dal a r g e - - s c a l es e q u e n c i n gf o raf u l l - l e n g t he d n a l i b r a r yc o n s t r u c t e dw i t hp o d so fv a r i o u sd e v e l o p i n gs t a g e s ，t h e nf o c u s e do ni n v e s t i g a t i n go b t a i n e d s e q u e n c e su s i n gb i o i n f o r m a t i c sm e t h o dt oa n a l y z ea n df o r e c a s tt h e i rs t r u c t u r ec h a r a c t e r i s t i c sa n d f u n c t i o n m a n yg e n e sr e l e v a n tt os e e dd e v e l o p m e n t , q u a l i t yf o r m a t i o n ，a n dr e s i s t a n c ew e r eg o t , w h i c hs h o u l dh a v eb e n e f i t st ot h es u b s e q u e n ti n - d e p t hs t u d y t h em a i nr e s u l t sa 他a sf o l l o w s 1 2 0 0 0c l o n e sf r o mt h ee d n al i b r a r yw e l em a d eo n er o a da tt h e i r5 t e r m i n a l , a n d18 2 7e s t s w e 糟g o t p r e l i m i n a r ya n a l y s i sa n df e a t u r en o t e sw e r em a d ef o rt h ee s t s i tw a sf o u n dt h a t8 0 p e r c e n to fe s t so b t a i n e da r es i m i l a rt ok n o w nf u n c t i o n a lg e n e s , a n da n o t h e r3 6 6e s t sa r e u n k n o w ng e n e s a m o n gt h e18 2 7e s t s ，7 7 0e s t sw e r ei d e n t i f i e da su n i g e n e ，w h i c hh a v eb e e n r e l e a s e do ng e n b a n k ( a c c e s s i o nn u m b e r s ：e s 4 9 0 6 4 3 - 4 9 1 2 9 5a n de y 3 9 6 0 0 3 3 9 6 11 9 ) m a n yo f t h ea b t a i n e dg e n e sw a st h ef i r s tr e p o r ti np e a n u t o n eh u n d r e dg e n e sw i t hm o r ei m p o r t a n tf u n c t i o n w e r es u b j e c t e dt ot w o w a ys e q u e n c i n ga n d51f u l l - - l e n g t hg e n e sw e r ea c q u i r e da r e rp r e l i m i n a r y a n a l y s i s 2 t h e18 2 7e s t sw e r ec l a s s i f i e da c c o r d i n gt ot h e i rf u n c t i o n ，t h e n4 0 8 d i f f e r e n tg e n e sw e r e f o u n d , a n d7 4g e n e sh a v ea tl e a s tt w oc o p i e so f s a m ef u n c t i o n ，o rh o m o l o g s ，o ri d e n t i t ys e q u e n c e s ， w h i c hm a d eu pt o12 2 0e s t s ，a c c o u n t i n gf o r6 6 7 o fa 1 1 s o m es t o r a g ep r o t e i n sg e n e sh a d h i g h l yd e g r e eo fh o m o l o g i cc o p i e s t h e s ef u n c t i o n a lg e n e sc o u l db ec l u s t e r e di n t o7c a t e g o r i e so f s e e ds t o r a g ep r o t e i n ，e n e r g ym e t a b o l i s m ，t r a n s p o r t , p r o t e i ns y n t h e s i sa n dd e g r a d a t i o n , p r o t e i n m o d i f i c a t i o n , s i g n a lt r a n s d u c t i o n , r e s i s t a n c e - r e l a t e dp r o t e i n s b a s e d0 1 1a n a l y z i n g m e t a b o l i c p a t h w a y ，1 2g e n e sw e r ef o u n di n v o l v e di nf a t t ya c i dm e t a b o l i s m ，1 0g e n e si n v o l v e di ne n e r g y m e t a b o l i s m ，4 0g e n e si n v o l v e di np l a n td i s e a s er e s i s t a n tg e n e sa n d2 2g e n e sp a r t i c i p a t i n gi n 3 福矬农林大学硕士学位论文 s t r e s s r e l a t e dr e s i s t a n c e 3 a f t e rr e m o v e dt h er e d u n d a n c ys e q u e n c e sf r o m18 2 7e s t s ，s s r ss e q u e n c e sw e r em i n e dw i t h s s r i ts e a r c hs o f t w a r e ，a n d1 9d i f f e r e n ts s rs e q u e n c e sw e r ef o u n d p r i m e rp a i r sw e r ed e s i g n e d f o rt h e19e s t - s s r ( c s s r ) t h e s es s r sc o u l db eu s e da sm o l e c u l em a r k e ri nt r a i t sm a p p i n ga n d g e n e t i cm a p c o n s t r u c t i o n 4 ag l y c i n ec a n e s c e n ss e e dm a t u r a t i o n p r o t e i nl e a4 - l i k eg e n ea n dag l y c i n em a x c a + 2 一b i n d i n ge fh a n dp r o t e i ng m p m l 3 一r e l a t e dg e n es e l e c t e df r o mt h ef u l l l e n g t hg e n e sw e r e e v a l u a t e df o rt h e i rs t r u c t u r ea n df u n c t i o np r e d i c t i o nb yb i o i n f o r m a t i cm e t h o d t h et w of u l l l e n g t h g e n ew e r e7 5 0b p sa n d1 2 5 0b p si nl e n g t h ，r e s p e c t i v e l y ，w i t hc o d i n gr e g i o n so f 5 1 5 b p sa n d6 7 8 b p s ，e n c o d i n gt w op r o t e i n so f17 2a a a n d2 2 5a a ，i nt h eo r d e r l e a 4 l i k ep r o t e i ni sad r o u g h t p r o t e c t i o np r o t e i nw h i c h c a l lb eu s e dt oi m p r o v ed r o u g h tr e s i s t a n c eb yg e n ee n g i n e e r i n g g m p m i 4 - r e l a t e dp r o t e i ni saa c i d i cc a l c i u m - b i n d i n gp r o t e i n ，h y d r o p h o b i cs t r o n g , c o n t a i n i n g a b u m d a n to fa - h e l i x , al o to fe x t e n d e ds t r a n d sa n dl a r g en u m b e ro fr a n d o mc o i l s ，w h i c hm a y d e m o n s t r a t e sab r o a dp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n s t h ea b o v ef i n d i n g sp r e l i m i n a r i l yr e v e a l e dt h ec o m p o s i t i o na n df u n c t i o no fe x p r e s s i o ng e n e s i nd e v e l o p i n gs e e d an u m b e ro fv a l u a b l eg e n e sw e r et h a nf o u n d ，e s p e c i a l l yf o rt h et w oi n d i v i d u a l g e n e sw i t hs t r u c t u r a la n df u n c t i o n a lp r e d i c t i o nm a d ei nd e t a i l t h i sp r o v i d e sab a s i sf o rf u r t h e r m o l e c u l a rb i o l o g ya n dg e n e t i ce n g i n e e r i n gs t u d i e si np e a n u t k e y w o r d s ：s e e d s ，e x p r e s s e ds e q u e n c et a g s ，f u n c t i o n ，c d n al i b r a r y ，b i o i n f o r m a t i c s a n a l y s i s 4 福建农林大学颂上学位论文 第一章：文献综述 花生( h r a c h i sh y p o g a e al ) 又名落花生、双子叶植物，含有大量的蛋白质 和脂肪，特别是不饱和脂肪酸的含量很高，具有很高的营养价值。花生是我国重 要的油料作物和经济作物，种植面积约4 5 0 万公顷，其产量占油料作物总产量的 1 2 ，占世界花生总产量的4 0 以上，已达1 5 0 0 万吨左右。多年来，花生一直是 我国出口创汇额最高的油料作物。 在我国花生产业发展的过程中，花生科研工作起到了基础性、决定性作用。 正是由于建国以后在花生遗传育种、栽培生理、植保技术等领域取得的一系列成 就，才使得我国花生生产在世界处于领先地位。其成就主要体现在以下几个方面： 搜集、整理并利用了一批花生种质资源；在育种、栽培理论上取得了一系列突破； 在育种、栽培方法和技术上取得了成就；选育并推广了一批良种；病虫害防治技 术研究取得成效。不难看出，所取得的这些成就都直接或间接与花生育种有着很 大关系，可见花生遗传育种在花生科研工作起了决定性作用，其最终目标都是获 得高质量的花生种子。但是由于受技术手段、遗传基因狭窄等因素的限制，致使 花生传统育种中存在着育种方法单一，研究手段落后，品种资源重复利用，优质 专用型品种缺乏等，这些问题目前严重制约着我国花生产业化的进程。 最近几年功能基因组学和生物信息学的迅速发展为植物从传统育种到分子 育种的飞跃作出了巨大贡献，再一次拓宽了优质育种、抗性育种、早熟育种的研 究领域，从而使生物技术作为创造花生新种质的一项技术手段在育种中的作用越 来越大，并在花生转基因，分子标记等方面得到了利用。 本实验即是在花生种子e d n a 文库的基础上，利用生物信息学技术对花生种子 中已知和未知基因表达情况进行分析，研究，然后再归纳和总结，最终为通过能 基因组学途径改善花生育种提供理论基础。现就相关方面的研究综述如下。 1 花生遗传育种研究进展 1 1 花生常规育种方法及进展 长期以来，花生育种主要是使用常规杂交手段培育新品种，随着科学技术的 不断发展，借鉴世界各国的先进经验同时结合本国的实际情况，运用生物学及其 他学科的新技术新方法对花生品种进行遗传改良，将在今后花生育种研究中起到 决定性的作用。 福建农林大学硕士学位论文 1 杂交育种：虽然是目前应用最广泛、效果最突出的花生新品种选育方法。 但是杂交育种育成一个品种则要耗费大量的人力和物力，且时间较长，如果要培 育适合本地区的优质专用花生新品种，仍要继续坚持杂交育种工作。在工作过程 中，要注意以下两点：( 1 ) 广泛搜集种质资源，丰富遗传基础。采取多种渠道、方式和 方法收集国内外花生种质资源，特别是注意引进一些高蛋白含量、高脂肪、高油 酣亚油酸比值的育种材料。同时，做好与相关科研单位开展相互交换资源材料工 作；( 2 ) 选择配合力高的品种作亲本。但这些又给育种工作带来难度，杂交育种成 败的关键在于亲本的选择。除了注意选用生态类型差异大和亲缘关系较远的材料 作亲本外，同时要选择一般配合力高的品种作亲本。亲本之一最好是当地适应性 广、综合性状优良的品种作母本，以优质( 高蛋白、高油、高油酸亚油酸比值) 品 种作父本，而第二个亲本必须能够补偿第一个亲本在品质上较差的性状。 2 远缘杂交：远缘杂交在一定程度上打破了物种间的界限，人为地促进不同 物种的基因渐渗和交流，从而把不同生物类型各自所具有的独特性状，程度不同 地结合于一个共同的杂种个体中，创造出新的品种。这是农作物品种改良的重要 途径之一。当一个种内各品种问存在不可弥补的缺点或现有品种资源无法满足日 新月异的育种目标要求时，引入异属、异种的有利基因，可培育出具有优异性状 的新品种，尤其是在培育高产、优质、早熟和高度抗逆等突破性品种时，更具有 重要作用。然而远缘杂交却有很大的局限性，( 1 ) 自然界的各种生物类型都是在 长期历史发展过程中所形成的，是一个独立的生存单位。为保持各物种的独立性， 一般都存在种间生殖隔离，这是远缘杂交不亲和性的关键所在。( 2 ) 杂种天亡和 不育：杂种夭亡、不育的原因自然界各个物种之所以能够按其特定方式繁衍后 代并保持其种性，是因为它们的生长发育都是严格地受一定的遗传因素所控制。 在长期进化过程中，这些遗传因素已形成一个完整、平衡与稳定的遗传系统。如 果这一遗传系统遭受任何破坏，都会影响其个体的生长发育。远缘杂交后，打破 了各个物种原有的遗传系统，必然会影响其后代个体的生长发育甚至导致其死亡 或不育。所以，远缘杂种天亡和不育的根本原因是由于其遗传系统的破坏。( 3 ) 分离规律不强，种内杂交时，很多质量性状的分离，基本上都符合一定的比例， 上下代之间一般也有规律可循。但远缘杂交时，来自双亲的异源染色体缺乏同源 性，导致减数分裂过程紊乱，形成具有不同染色体数目和质量的各种配子。因此， 6 福建农林大学硕士学位论文 其后代具有极复杂的遗传特性，性状分离复杂且无规律，上下代之间的性状关系 也难于预测和估算。分离类型丰富，并有向两亲分化的倾向远缘杂交后代，不 仅会分离出各种中间类型，而且还出现大量的亲本类型、亲本祖先类型、超亲类 型以及某些特殊类型等，变异极其丰富。分离世代长、稳定慢远缘杂种的性状 分离并不完全出现在f 2 ，有的要在f 3 或更高世代才有明显表现。同时，在某些 远缘杂交中，由于杂种染色体消失、无融合生殖、染色体自然加倍等原因，常出 现母本或父本的单倍体、二倍体或多倍体：在整倍体的杂种后代中，还会出现非 整倍体。这样，性状分离会延续多代而不易稳定。 3 突变育种：在2 0 世纪5 0 年代末到7 0 年代初在美国得到了广泛应用，但 现在很少使用。辐射诱变育种成败的关键是采取适当的辐射剂量，即达到有较多 的变异，又不致过大地损伤植株。经长期实践认为，一般剂量的选择通常采用半 致死剂量或临界剂量。诱变育种的局限性在于如何以有效的手段鉴定和选择优良 突变体。7 0 年代以前只是用常规的农艺形状判断，7 0 8 0 年代以来则采用染色 体压片观察其细胞水平上的变异及亚分子水平上的同工酶检测，9 0 年代以来分 子标记技术不断发展，c a c t a n o - a n o l l e s 等在农作物上利用分子标记，对二些突变 体进行分析，区别真伪突变体，利用与分子标记连续的关系对突变基因加以挂标。 辐射诱变育种，突变频率高，但有利变异的机率较低，故辐射后代群体大，人力、 物力、土地消耗大，发现、鉴定和选择困难。射线和植物的不同，效应难料，多 为无目的的变异，难以做到定向控制突变过程。 1 2 花生常规育种成就和存在问题 1 2 1 主要成就 ( 1 ) 高产育种 通过培育高产品种或改变花生基因型来这到提高花生单产的目的，是世界花生 高产育种的主要目标之一。 ( 2 ) 早熟育种 由于花生是干旱、半干旱地区的主要经济作物，其早熟性不但能充分利用这些 地区的汛期季节，避开干旱，而且还能提高有些地区的复种指数。因此，早熟育 种也是重要的目标。 ( 3 ) 抗性资源筛选和育种 7 福建农林大学硕士学位论文 对病虫有综台抗性的材料有i c g s 6 0 和i c g l 6 9 7 ；对叶部病害有综合抗性的有 i c g s 2 2 7 1 ，5 0 4 0 ，5 0 4 3 ，5 0 4 4 ，5 0 4 5 ，i c g v 8 6 0 1 5 和8 7 1 7 7 ；抗蚜材料有i c g 5 2 4 0 和5 7 2 5 ，其中i c g 5 2 4 0 的抗性比对照i c g 2 2 1 高5 0 ，抗病毒病材料有i c g v 8 6 3 8 8 。 我国初步筛选出了抗花生根结线虫病( m h a p l a ) 的种质资源n 0 0 1 和n 0 0 2 。印度 也筛选出了一批抗叶斑病和锈病的材料。 1 2 2 存在问题 我国的花生种植面积和总产量逐年增加，但也面临着一些重大问题，严重影 响我国花生产业的可持续发展，主要问题有两个方面： 一育种存在的问题主要有： 1 育种方法单一，研究手段落后 多年来各育种单位多采用杂交选育的常规育种方法，生物技术等在花生育种 上应用较少，育成的新品种绝大多数是采用常规的杂交育种方法选育而成。 2 品种资源重复利用 我国花生育种目前已经达到了较高的水平，产量和美国相比已不相上下，国 内好的亲本资源如伏花生等已被多次重复利用。受技术手段、遗传基因狭窄等限 制，育成的新品种要在产量和品质方面取得大的突破有相当大困难。 3 优质专用型品种缺乏，制约了花生产业化的进程 一是我国花生育种虽然取得了巨大的成就，但是育成品种不能完全满足日益 变化的生产和市场需求，优质专用型品种缺乏，制约了花生产业化进程；二是花 生用种量大，购买种子投入资金较多影响了品种更新；三是优质新品种选育和优 质花生生产缺乏足够的资金和科技投入，品种多乱杂、化肥、农药、生长调节剂 污染较重，加上混收、混加工使花生质量不稳定、一致性差，严重影响了花生的 种植效益和企业的加工生产成本。 二生产存在的问题主要有： 1 黄曲霉毒素污染：我国的花生特别是高温高湿的花生产区黄曲霉毒素 污染严重，黄曲霉毒素污染是花生油和花生食品的重大问题。而当前世界上所 有的花生种质均会感染黄曲霉，常规育种很难解决。因此，采用高新技术彻底 解决黄曲霉毒素污染问题成为我国和世界花生产业的迫切需要。 福建农林大学硕士学位论文 2 油酸含量偏低。我国花生品种的油酸亚油酸比值大多在1 1 1 5 之间， 较低的油酸与亚油酸比值缩短了花生油和花生制品的货架寿命，容易发生酸 败，产生有毒物质。 3 花生蛋白质中人体必需氨基酸含量和比例与人体需要有一定差距。特别 是赖氨酸、蛋氨酸和苏氨酸含量较低，有待改良提高。 4 我国许多地区的花生栽培还不同程度存在产量低、品质差、抗病抗逆性 低等缺点，严重地制约当地农民的增产增收。因此，生产上急需一批能够适应 不同地域条件的花生优良品种。 传统的花生育种已难以或需耗费大量的时间和力量来解决上述问题，这对 生物技术尤其是功能基因组的研究提出了急切的要求，以适应当今及未来生产 实践的需要。 1 3 基因工程在育种方面的研究 花生生产一直受多种病虫害和黄曲霉的危害，导致产量和品质下降。进行花 生遗传改良，培育新的抗性品种具有重要意义。虽然常规育种技术在抗性品种选 育中发挥了重要作用，但花生栽培品种中缺少抗主要病虫害的种质基础，而野生花 生抗性资源受种间杂交不亲和及与不良性状连锁等原因而难以利用。利用基因工 程技术将外源抗性基因导入花生基因组，可达到种质改良的目的。与多数豆科植 物一样，花生外源基因导入难度大，花生基因工程很大程度上取决于高效再生系统 的建立。花生基因转化主要通过农杆菌介导和微弹注射两种方法。已报道的转化 系统普遍存在转化效率低、有基因型特异性、转基因植株不育及外植体可用性等 问题。缺乏不受基因型限制的高效植株再生系统，是限制花生基因工程主要因素。 此外，尚有不经组织培养的转化方法，如m e k e n t l y ( 1 9 9 5 ) 在r 8 期花生种子的胚轴部 位制造伤口，置含b a 和农杆菌的m s 液体培养基中暗培养7 2h ，种植于灭菌土中， 获得了转化植株。r o h i n i ( 2 0 0 0 ) 用浸泡在农杆菌中的针刺伤成熟种子的子叶，并在 此过程中添加烟草叶提取物，经1 6h 共育，移入灭菌土中，获得了转基因植株。 1 农杆菌介导的基因转移：农杆菌介导的基因转化是植物基因工程最有效的 方法之一。m c k e n t l y ( 1 9 9 5 ) 对4 个花生品种和5 个野生型农杆菌菌株的相互作用 进行了研究，指出不同花生品种对不同农杆菌菌株的敏感性不同。近期研究表明， 农杆菌一般只能转t - d n a , 由它介导的基因转移的复杂性比微弹法小得多，因而 9 福建农林大学硕士学位论文 有更广泛的应用前景。使用高侵染力的菌株和双元载体系统，针对不同植物品种 寻找匹配的农杆菌菌株，可有效提高转化率。m a n s u r ( 1 9 9 3 ) 对影响基因转化的因素 进行了系统的研究，认为花生的基因型、外植体类型和发育时期、共培养时间、 共培养基等对转化率有显著影响；农杆菌的培养基及其p h 、接种浓度等也有一定 影响：在很多植物的转化中，农杆菌经乙酰丁香酮预培养可提高转化率，但在花生 基因转化中并非如此；农杆菌培养物离心后再经m s 培养基悬浮可提高转化率。 使用强侵染力的农杆菌菌株、共育过程中添加烟草叶提取物等，解除寄主与农杆 菌间相互作用的抑制，可提高转化率。o l h o f l ( 2 0 0 1 ) 报道，在大豆基因转化中添加不 同硫醇化合物，可提高转化率。硫醇的作用可能对其他豆科植物也有效。 2 微弹法基因转移：微弹法基因转移效率主要与微弹特性及动力有关，但其他 物理和生物因素也有一定影响，选择合适的操作方法和恰当的载体系统可提高外 源基因的表达率。d n a 微弹的制备是微弹法的关键，d n a 含量及基因拷贝数是 影响外源基因表达的重要因素。多数报道采用高压氦气为加速动力，将被钨粉或 金粉包裹的d n a 微弹利用火药产生的冲击力射入受体。l i v i n g s t o n e ( 1 9 9 9 ) 认为 在轰击胚性愈伤组织前后，将其置渗透压培养基中预培养4h ，可提高g u s 基因表 达率。渗透压培养基处理的目的是造成体细胞胚部分干燥，提高再生率。 d u r h a n ( 1 9 9 2 ) 认为渗透压培养基提供了方便、易控制且利于再生的干燥方法。 d e n g ( 2 0 0 1 ) 采用该预处理方法，利用微弹法将h p h 和g u s 基因导入花生。 3 可育转基因植株及外源基因：表达转基因花生普遍存在不育性。 l i v i n g s t o n e ( 1 9 9 9 ) 只得到5 3 的可育转化植株，他认为缩短微弹轰击前胚性愈伤 组织的培养时间，能提高可育转化植株的获得率，不育现象在转基因大豆中也存 在。外源基因的表达水平通常是不可预测的，不同转化植株中外源基因的表达水 平差异很大。y a n g ( 2 0 0 1 ) 采用微弹轰击胚性愈伤和体细胞胚，得到了h p h 和西红柿 斑枯病毒( t s w v ) 外壳蛋白基因的转化植株，提出外源基因多拷贝整合的表达率 低于单拷贝整合。h a n s e n ( 1 9 9 6 ) 基于农杆菌转化机理结合微弹法创建了农杆枪 “( a g r o l i s t i c ) ”技术，用农杆枪轰击玉米悬浮细胞，序列分析显示整合位点与预期 的t - d n a 整合位点精确吻合，该方法集中了农杆菌介导法精确切割转移以及低拷 贝整合等特性和微弹法无基因型特异性的优点，是一种有发展前途的新思路。另 外，在目的基因构建过程中使用矩阵侧翼序歹j j ( m a r ) ，可增加目的基因表达水平并 1 0 福建农林大学顽士学位论文 降低基因表达的可变性，m a r 可降低植物基因组插入位点附近的增强子和其他 顺式调控因子的作用，是获得目的基因稳定表达的一个途径。相信，随着分子生物 学技术的发展，花生基因工程研究必将出现更大突破。 生物技术是花生育种的重要组成部分，其与育种结合广泛应用将有助于提高 花生遗传改良的效率，更准确地指导品种选育。建立常规技术与生物技术相结合 体系，创建新的种质与特异基因资源的分子标记为育种服务。新世纪生物技术可 望通过转基因技术育成抗虫花生品系( 种) 、高油酸亚油酸比值的花生品系( 种) 以 及在抗真菌侵染、抗各种非生物胁迫、提高蛋白含量、含油量、降低含油量方面 取得重大突破。但设备与人员的技术水平等因素的制约影响了生物技术在花生育 种上的广泛应用，从而也影响了花生育种水平再上新台阶。因此我们应该增加投 入，购置设备，创造条件，提高育种人员专业技术水平，从而把生物技术育种研 究提高到一个新水平。 2 植物基因组研究进展 2 1 模式植物全基因组测序研究进展 随着人类基因组图谱及其初步分析结果的报道，以及多种模式生物、重要生 物基因组全序列的完成，基因组学的研究已经从结构基因组学开始过渡到功能基 因组学后者又被称为后基因组研究。基因组研究是生物科学十几年来的研究热 点，植物基因组学的研究主要集中在拟南芥和水稻两种模式植物上。拟南芥等模 式植物和水稻等作物的基因组序列测定工作相继完成，大量新基因和功能未知基 因的功能有待鉴定。例如，拟南芥是第一个完成基因组测序的开花植物，但其中 9 0 以上的基因的功能仍未知。( 徐平丽，张传坤，2 0 0 6 ) 。拟南芥作为一种模式 植物，具有其它植物无法替代的优点。通过对拟南芥基因组的研究，推动了许多 其它植物相关基因的研究。完成拟南芥的基因图谱仅仅是基因组计划的第一步， 拟南芥属还有3 0 0 , 6 的基因的功能是未知的。蛋白组学研究”重大国际合作项目， 2 0 0 4 年3 月，研究取得了重要进展：共克隆了4 4 个基因，获得了拟南芥所有已 知和预测的18 6 4 序列，利用微阵列芯片，8 5 以上有一定量的蛋白质表达。 在水稻基因组测序方面，项目完成了籼稻9 3 1 l 的基因组草图和精细图以及 粳稻日本晴4 号染色体的精确图，并首次测定了水稻4 号染色体的着丝粒序列； 在重要功能基因克隆方面，完成了以m o c l 为代表的功能和应用前景明确的基 福建农林大学硕士学位论文 因1 2 个以及一批有潜在应用价值的功能基因；在功能基因组研究方面，完成了 2 5 万余个独立的水稻t - d n a 转化株系，构建了含有1 万多条水稻独立e s t 的 e d n a 芯片技术平台，鉴定了与水稻传粉授精、组织器官、激素应答和环境胁迫 等密切相关的基因表达谱，发现了一批重要的功能候选基因，初步建立了水稻蛋 白质组研究平台，鉴定了与水稻花粉萌发的蛋白质组。 杨树就成为继拟南芥和水稻之后第三个测定全序列的植物，并且是第一个测 定全基因组序列的多年生木本植物。现在杨树已被广泛地接受作为研究多年生植 物基因组的模式物种。杨树全基因组全序列用“鸟枪法测定”，序列库中共含有 7 6 4 9 9 9 3 个序列片段。目前对序列拼接的组装已完成了4 8 3 m b ，占杨树基因组物 理全长的9 0 以上，基本覆盖了杨树基因组常染色体。 2 2 表达序列标签( e s t s ) 研究进展 近几年，e 弧发展的趋势是应用在生物信息学中分离、克隆新基因和基因 定位以及基因功能研究等方面。新基因的分离和克隆主要两条途径，一是通过基 因组克隆，另一个就是通过c d n a 或e s t s 克隆，而c d n a 或e s t s 是最有效的 方式，因为c d n a 或e 弧包含和代表了结构基因编码区的重要信息。e 弧或 c d n a 克隆新基因的方法是把文库测序获得的大量e s t s 序列通过生物信息学组 装和拼接成大的片段重叠群( c o n t i g s ) 或者单个克隆子( s i n g l e t o n s ) ，然后通过比 对和基因预测程序等电子克隆某个基因，然后通过分子生物学试验验证，进而确 定预测基因的真实性和精确性。通过e s t s ( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ， s n p s ) 主要是通过e s t s 的重叠和同源性或相似性比较，发现序列当中的差异碱 基，并将其作为候选s n p s ，然后通过分子生物学技术和方法进行确证。当然这 种方法由于e 弧测序质量问题与e 弧和基因序列的错位问题等有一定的风险 性，甚至丢失真正的s n p s 位点，但通过提高e s t s 测序质量和比对的精确性以 及试验的验证等，就可以把它作为一种快速分离和鉴定候选s n p s 的有效方法， 利用双倍扫描方案在鸡的2 3 4 2 7 条e s t s 中顺利地分离和鉴定了1 0 8 个s n p s 位 点。d a n t e c 等( 2 0 0 4 ) 利用3 种d n a 分析程序( p h r e d ，p h r a p 和p o l y b a y e s ) 从海松 树的1 8 4 9 8 条e s t s 中成功地鉴定出了1 4 0 0 个候选s n p s ( k i s s i n g e r 等，2 0 0 3 ) 建 立了弓形虫基因组数据库( t o x o d b ：h t t p ：- l - o x o d b o r g ) ，并就e s r s 与s n p s 的鉴 定关系以及e s t s 与蛋白组学、功能基因组学的关系作了较为详细的描述和分析。 1 2 福建农林人学顾士学位论文 这些试验研究都充分利用了生物的e s t s 序列信息来为基因多态和基因功能研究 奠定了重要的基础。 2 3 表达序列标签( e s t s ) 及其应用概况 表达序列标签( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g s ，e s t s ) 的概念是由美国国立卫生 研究院( n a t i o n a li n s t i t u t e so fh e a l t hn i h ) 生物学家v e n t e ：及其研究小组首先 提出的，它是伴随着人类基因组计划而诞生的概念( a d a m s e ta 1 1 9 9 1 ) ，是人们 在想全面或者更多地了解人类基因的真实状况而又尽量少花费时间、金钱和精力 的情况下作出的一个明智而高效的选择。但自从e s t s 计划开展和实施以来，e s t s 迅猛的发展速度达到了令人吃惊的地步，这是人们始料未及的( 图i - i ) 。另外， 美国国家信息中一i 已, ( n a t i o n a lc e n t e ro fb i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o n n c b i ) 的 g e n b a n k数据库内成立了专门的 e e l s 数据库 ( h t t p ：l l w v a m n c b i n l m n i h 。g o v d b e s t o 截至到2 0 0 8 年3 月2 1 日，该数据库 共收集了8 0 0 多种生物的2 6 ，0 3 3 ，1 3 6 条e s t s 序列，其中花生的e s t s 序列为q o ， 7 4 4 ，这些大量的e s t s 序列对发现、克隆和定位新基因、研究基因表达、功能和 关系是非常有价值的资源( h a r u s h i m ae ta 1 ，1 9 9 8 ；e w i n ge ta 1 ，1 9 9 9 ：b r e n t e ta 1 ，2 0 0 0 ：l i ue ta 1 ，2 0 0 s ) 。 福建农林大学硕士学位论文 d b e s t ：d a t a b a s eo f 。e x p r e s s e ds e q u e n c et a g s ” d b e s tr e l e a s e0 3 2 t0 8