（作物遗传育种专业论文）农杆菌介导小麦遗传转化体系的建立及转基因研究.pdf

y s 0 7 s 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研 究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要 贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本 人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规 定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质 本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可 以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：撼 导师签名：掣孙7 日 期：逝i ：反幻 出末丧建太攀额学蕴谂震 攘簧 本研究以2 4 份小澎雒种( 髹) 为材料进行幼胚培养，对熊愈伤组纵 诱导释分铑蘸力避孬了爨鞍，势怒彩嫡黎伤缀绶分键畿力鹣溪索送露了 繇究。瓣舞选塞潦瓣馕藏基因鍪耱瓣，慕瘸揍繁g u s 基嚣麴n 1 0 5 p v e c t o r 表转鼙缓羧) 辩惑臻缀绥避好转鞭，璐究了遗传转纯辩澎璃溪素。谯 此基础上，利用携带n p t i i9 i ；i 选标记基因和胰蛋囱酶抑制基因的 l b 矗| 莲唾e l 每塞。蛀农姆蔼矮粒避行遗祷转纯骚燃缛靛奎鼹缝栗囊f ； i 、从农艺性状较好的2 4 份小麦赫稀( 系) 中，筛选蹴了愈伤组织 诱导攀薅且植拣褥燕熬力强靛基辫婺! 材辩出农9 9 5 6 0 4 黎f 2 8 1 。1 0 ，在越 基础上对影响愈绥缎级静分诧及较长孵闽保持分纯能力的因素避z 亍了礴 突。缭累表秘，襁愈爨续缓熬熬敢培券逡覆孛，在0 5 - 2 。o m g l 魏浓痰菠 围内，保持较黼浓廉的2 , 4 - i ) 。或对愈伤组织避行交替继代培养有利于较 长对阈保持其分化熊力。开花艨2 5 天取躲大龄坯，若仅挑取爨片组织遴 嚣接耱壤莽，逸w 戳获褥器量较薅鼹褥袅黪力较强熬塞嵇缓织。 2 、驻出农9 9 5 6 0 4 鹣秘疆愈臻魅绫为受侮，致揍繁g u s 蒸焱靛n 1 0 5 p v e c t o r 2 0 7 ( 农释静矮糨) 为载体辩愈伤组织溅行速传转化，并对农杆 菌介昂的遗传转化影响趿素进行了研究。绩暴袭明，藜浓艘0 1 3 6 0 0 = o ，6 移浸染器亨惩势融分鲒辩黪簧澎效率最离；在预墙葬帮共臻莽她程孛热入 适当浓度的a sw 以较好的提蹴转化效率。建嶷了较为优化的遗传转化 体系，转纯效率碍遮2 。8 6 。 3 、剿用建巍豹遗传转纯体臻，戮揍豢n p t l l 簿选标谗蒸觳鞠胰蛋鑫 酶捧铡鏊医鼹l b a 4 4 0 4 p b o k 2 ( 凝耔罄鞭辍) 避舒港传转键，获褥了三拣 含有胰畿白酶抑制熬圊的转基因小麦。通过p c r 扩增和s o u t h e r n 杂交检 测，逐甥了蛰添篓灏爨整会到了三撩转蒸嚣枣整基霾缀孛。获褥戆转蒸 嚣接棘农艺羹爨浚蠢笈垒饔显交辩，裁够委豢嚣慈绩实，黪翅爹表瑷彳 撬嬷交憨力! y 关键词：小麦组级辩养遗传转化缎杆筒转基嗣植糠 壅笪翌盆鳖! ：塞搂蓬登堡篓墨塑望皇塞整釜塑登塞 a b s t r a c t i m m a t u r ee m b r y o sf r o m2 4d i f f e r e n tw h e a tg e n o t y p e sw e r ec u l t u r e d ， c o m p a r i n gt h ee f f i c i e n c yo f c a l l u si n d u c t i o na n dr e g e n e r a t i o na m o n gt h e m a n dt h ef a c t o r si n f l u e n c i n gi n d u c t i o na n dr e g e n e r a t i o no f c a l l u sw e r es t u d i e d ， t h em a t e r i a l sw i t hh i g h e ri n d u c t i o na n dr e g e n e r a t i o nw e r et r a n s f o r m e dw i t h a t u m e f a c i e n sn t 0 5c o n t a i n i n gg u sg e n e ，s t u d y i n gt h ef a c t o r si n f l u e n c i n g t h ee f f i c i e n c yo ft r a n s f o r m a t i o nm e d i a t e db ya 。t u m e f a c i e n s 。a b a s e do n t h a t ，e m b r y o d e r i v e dc a l l u sf r o ms h a n n o n 9 9 9 5 6 0 4w e r et r a n s f o r m e dw i t h a t u m e f a c i e n sl b a 4 4 0 4c o n t a i n i n gn p t l la n dc p t i ，t h er e s u l t sw e r ea s f o l t o w s ： 1 、s h a n n o n 9 9 9 5 6 0 4a n df 2 8 t * 1 0 诵魄h i g h e r i n d u c t i o na n d r e g e n e r a t i o n f r e q u e n c y w e r eo b t a i n e df r o m2 4d i f f e r e n tw h e a tg e n o t y p e sw i t h g o o d a g r o n o m i ct r a i t s ，t h es t u d y o nt h ef a c t o r s i n f l u e n c i n gt h e i n d u c t i o na n d d i f f e r e n t i a t i o no f w h e a tc a l l u ss h o w e d ：k e e p i n gh i g h e r2 , 4 - dc o n c e n t r a t i o ni n s u b c u l t u r em e d i a , o ra l t e r n a t i n gs u b c u l t u r ew a sb e n e f i e i nt om a i n t a i nt h e h i g h e rr e g e n e r a t i o nf r e q u e n c yo fw h e a tc a l l u s 。g o o dc a l l u sw i 搬h i 曲e r r e g e n e r a t i o nc a p a c i t y c a r lb eo b t a i n e dw h e ns c u l t e mo fe m b r y o sa f t e r p o l l i n a t i o n1 5d a y sw a s c u l t u r e d 2 、s h a r m o n g f 9 5 6 0 4 w e r et r a n s f o r m e dw i t h a t u m e f a c t e n s n 1 0 5 c o n t a i n i n gg u sg e n e , t h e f a c t o r si n f l u e n c i n gt h e e f f i c i e n c yo f t r a n s f o r m a t i o n w e r es t u d i e d 。i ts h o w e d ：t h e h i 醢e re f f i c i e n c y w a s 、o b s e r v e dw h e n a + t u m e f a c i e n sc d ld e n s i t yw a s a d j u s t e dt oo d 6 0 0 = 0 6a n dt h ei n o c u l a t i o n d u r a t i o nw a s | h o u r ；t h ee f f i c i e n c yc a nb ei n e r 酬b y a d d i 驾a st ot h e m e d i ao fp r e c u l t u r ea n dc o - c u l t u r e ，t h et r a n s g e n i c s y s t e mm e d i a t e db y a + t u m e f a c i e n sw a se s t a b l i s h e d ，a n dt h ee f f i c i e n c yo ft r a n s f o r m a t i o ni nt h i s s y s t e mi s2 。8 6 。 t 3 、u s i n g t h e s y s t e mo f t r a n s f o r m a t i o n , s h a n n o n 9 9 9 5 6 0 4 辅饿t r a n s f o r m e d w i 魄a t u m e f a c i e n sl b a 4 4 1 nc o n t a i n i n gn p t i i a n dc p t i 。a sar e s u l t ，t h r e e t r a n s g e n i cw h e a tp l a n t sw e r eo b t a i n e d ，a n dt h e yw e r ep r o v e dt h a tf o r e i g n 2 露末衷建麦攀爨囊掌蓉谂交 d n ah a v eb e e n n 姆理g 则i n t ot h e i rw h e a tg e 觌o m e b yu s i n g p c r a m p l i f i c a t i o na n ds o u t h e r nb l o t t i n ga n a l y s i so ft h et h r e et r a n s g e n i ew h e a t p l a n t s ，t h e 幽黼t r a n s g e n i ew h e a t s a g r o n o m i ct r a i t sw e r e n o td i f f e r e mf r o m t h es a r a e g e n o t y p ew i t h o u th e m 蠢a n s f o r m e d 。 k e yw o r d s ：w h e a t ；t i s s u e c u l t u r e ；t r a n s f o r m a t i o n ；a t u m e f a c f e n s ； t r a n s g e n i cp l a n t s 。 农杆菌介导小麦遗传转化体系的建巍及转基因研究 a c e t y li s o e u g e n o l乙醒丁香嗣 c a n l i f l o w e rm o s a i cv i r u s3 5sp r o m o t e r s e q u e n c e c o w p e at r y p s i ni n h i b i t o r胰蛋白酶抑制基因 c e t y lt r i e t h y la m m o n i u m 十六靛基三擎基瀵键锭 d e o x y r i b o n u c l e i ca i c d脱氧核糖拨酸 d e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e脱襞挟营三璜酸 e t h i d i u mb r o m i d e 澳化乙锭 b h y l e n ed i a m i n et e t r a u c e t i e五= 胺四己酸 2 , 4 d i c h l o r o p h e n o x y a c e t i ca c i d。2 , 4 二氯苯飘乙酸 - g l u c u r o n i d a s ec o d i n gs e q u e n c e8 - 蔼莓耱蛰酸酶编码序 列 h y g r o m y c i np h o s p h o t r a n s f e r a s ec o d i n g 湖霉素磷酸转移酶编码 s e q u e n c e搿列 k a n b a c t e r i a lk a n a n y e i nr e s i s i t a n c e g e n e k tk i n e t i n 缩臆分襞索 l bm e d i u ml a r i a - b e r t a n i am e d i u m 细菌培养基 l b t - d n al e f tb o r d e r s e q u e n c et - d n a 左选界 m a r s m a t r i xa t t a c h m e n t r e g i o n s梭基质支架附着区 n o s 。p n o p a l i n es y n t h a s eg e n ep r o m o t e r 囊动子痔捌 s e q u e n c e n o s ”t n o p a t i n es y n t h a s e g e n ep r o m o t e r 终瘫子痔列 s e q u e n c e n l s n u c l e o l a rl o c a l i z a t i o ns i g n a l 羧 二定霞露萼 n p t l i n e o m y c i np h o s p h o t r a n s f e r a s e c o d i n g 新霉素磷酸转移酶编码 s e q u e n c e 黟列 4 蟋一黑淼髓=觚咻 出衷表韭文学醺圭学霞论文 p ip r i m e r l p 2 p r i m e r 2 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r b t - d n a r i g h tb o r d e rs e q u e n c e r n ar i b o n u c l e i ca c i d s d ss o r d i t l m d o d e c y ls u l p h a t e i - d n at r a n s f e r r e dd k a l 魏一 引物二 聚合酶链斌殷嫩 t - d n a 右边界 攘耱核酸 卡二蕊萋旗黢镳 转移d n a t i t u m o r i n d u c i n g撤瘤诱导( 蕊粒) 5 壅堑堕坌量塑! ：耋些垡鲎些堡至竺些! 鲨壁苎堕型塑一 l 引言 小麦作为世界上的主要粮食作物之一，有着最大的种植面积和总产 量。长期以来，育种工作者广泛开展了小麦的遗传改良研究，促进了小 麦生产的不断发展。但是，社会经济的发展和人们生活水平的不断提高， 对小麦生产提出了更高要求，常规育种方法虽然在新品种的选育方面发 挥了重大作用，但在有效的实现现代育种目标方面存在较大局限性。以 遗传转化为核一1 5 , 内容的现代生物技术的应用，及其与常规育种技术的紧 密结合，为小麦遗传改良向更高水平发展展现了广阔的前景。目前，用 于遗传转化的方法主要有三种：基因枪法，花粉管通道法和农杆菌介导 法。 基因枪法是禾谷类植物研究中广泛采用的方法9 j ( 徐子勤，2 0 0 1 ) 该方法将d n a 通过c a “和s p e r m i d i n e 等试剂包被在金微粒或钨微粒内 做成微弹，这些含有d n a 的微粒通过基因枪装蹙的压力系统或高压氮气 来加速并射向目标材料，使外源d n a 整合到受体植物基因组中并得以表 达1 6 1 4 2 】( s a n f o r dj c ，1 9 9 1 ；k l e i n t m ，1 9 9 2 ) 。该法的优点是不存在基因型 限制，受体类型广泛，而且可以同时使用几个质粒进行转化【6 3 7 0 】( s p e n e e r t m ，1 9 9 2 ；r e g i s t e rjc ，1 9 9 4 ) 。它的主要缺点是转化率低( 与农杆菌转化 法相比) ，无法转化较大的基因片段，外源基因稳定遗传的比例小而且成 本较高 5 2 , 5 9 ( o wdw ，1 9 9 8 ：m e n d e lrr ，1 9 8 9 ) 。采用该方法近几年在禾本 科植物的转化研究中取得较大进展，迄今水稻1 1 3 , 9 4 ( c h r i s t o np ，1 9 9 1 ；z h a n g 1 9 9 6 ) 、大麦( w a nz 1 9 9 5 ) 、小麦1 8 7 , 7 4 1 ( w e e k sj t , 1 9 9 3 ；b e c k e r d 1 9 9 4 ) 、 小黑麦【9 5 l ( z i m n yj ，1 9 9 5 ) 、麦o ( b u n d o c k ，1 9 9 5 ) 均已获得可育转基因植 株。 花粉管通道法是利用在有性生殖的授粉过程中使外源d n a 沿着花 粉管通道进入胚囊，转化尚不具备细胞壁的卵细胞、合子或早期的胚胎 细胞。优点是避免了组织培养和诱导再生植株这系列的人工培养过程， 操作十分方便，而且可以任意选择生产上的主栽品种进行外源d n a 的导 入。缺点是这一方法的成株转化率比较低，影响因素多。 农杆菌介导法，其基本原理是当农杆菌与植物伤口接触时，携带外 山东农业大学硕士学位论文 源基因的t i 质粒上的t d n a 转移至受体细胞中，并整合到受体染色体 上。与基因枪法、花粉管通道法相比较，农杆菌介导法成本低，可以转 化较大片段的d n a 序列，单拷贝整合率高而且外源基因在转基因植株后 代中呈孟德尔遗传【8 , 1 3 , 3 0 1 ( h a m i l t o ncm ，1 9 9 6 ；b u n d o c kp , 1 9 9 5 ；c h r i s t o u e 1 9 9 1 ) ，但是这种方法的基因型依赖性很强，且操作较为复杂。 目前，利用农杆菌介导法转化双子叶植物已成为较为有效的方法， 如何将这一方法成功的用于包括小麦在内的单子叶植物是今后遗传转化 研究的重要内容。 1 1 农杆菌介导的遗传转化机理 农杆菌转化基本过程如图1 1 所示“( 李卫，2 0 0 1 ) 。 图1 1 农杆菌介导植物细胞转化过程示意图 农杆菌介导小麦遗传转化体系的建立及转赫囡研究 野生型根癌农杆荫能够将自身的一段d n a 转入到植物细臌中。因为转入 昭这一段d n a 含蠢一些激素合成基因，麸瑟导致转他缨腿叁身激素戆不 平衡而产生冠瘿瘸，这些致瘤菌株都含有一个约2 0 0 k b 的环状质粒，被称 为t i 质糖，它包撬毒性送( v i r 区) 、接合转移嚣( c o n 嚣 、复铡筵始区 ( o r i 区) 和t - d n a 区4 个部分。其中与冠瘿瘤生成有关的是v i r 区和 t d n a 区，前者大小为3 0 k b ，含窍v i r a j 等至少l o 个搽级予，决定了 t - d n a 的鸯口工和转录过程。t 书n a 可以将携带的任何基因羧合到植物基因 组中，但这些基因本身与t - d n a 的转移与整会无关。仅庄右两端务2 5 b p 的丽商羹复序弼为其加工所必需，其中1 4 b p 是完全保守的，分为l o b p 和4 b p 不连续的两组，两边界中以右边界更为重凝”1 ( z u p a nj ，2 0 0 0 ) 。 转纯过程中v i r a 蛋白接受损伤檀秘细胞分泌物的诱静，自身磷酸化 飚进一步磷酸化激活v i r g 蛋白，质者是一种d n a 转录活化子，被激活后 露以翡异筏结合戮其它v i r 基强穗动子鏊上游酌一个嘲v i r 框( v i r 嘶x ) 的序列，启动这些基因的转录。其中，v i r d 基因产物对t - d n a 进行剪切， 产生t - d n a 萃镳，然嚣淡类钕予缀菌接念转移过程静方式将t - d n a 与 v i r d 2 组成的复食物转入植物细胞o ”( f u l n e rkj ，1 9 9 6 ) ，在那鞭与许 多v i r e 2 爨鑫分子凝结会，形成警链复会魏拉皇”1 ( s u n b e r gc ，l 眄s ：l e el y ，1 9 9 9 ) ，在此过糨中v i r e l 作为v i r e 2 的一个特殊的分乎伴侣具脊协助 v i r e 2 转遮藏疆止它与t - d n a 链缝合懿功能溉7 8 d e n g 魏1 9 9 9 ；s u n b e r g ， 1 9 9 9 ) 。实验表明，转基因植物产缴的v i r e 2 蛋白分子也能在植物细胞内 与v i r d 2 一t d n a 形残t 链复合貔( g e l v i nsb ，1 9 9 8 ) ，遮一复会物在 v i r d 2 和v i r e 2 梭定位信号( n l s ) 引导下以v i r d 2 为先导被转运进入细 胞核。转入细胞核购t - d n a 以单戏多拷贝瓣形式醛援整会裂植兹絷笆体 上。研究袭明t - d n a 优先艇合到转录活跃区，而鼠在t - d n a 的同源区与 d n a 的高度重复区t - d n a 的繁合频零也比较离汹侧( z a r a b r y s k ip c ，1 9 9 2 ；m a y e r h o f e r ，i 9 9 1 ) ，整合滋植物基因组的t d n a 也有一定程度的 缺失、重复、填充和超界等现象发生嘞。嘲( n a r a 王1 9 9 9 ；d e n gw ，1 9 9 8 ) ， 髑魏在爝囊空渗透法转纯瓤南芥巾有6 6 蹦现超界现象，甚至有整个t i 质粒整合进植物基因组的报道( w e n c ka ，t 9 9 7 ) 。t - d n a 越界转移现象 豹梳理囊不完全清楚，可裁与萁左这界褥遮序弼有荚叭嘲( 玉关林，1 9 9 8 ： 山东农业大学硕十学位论文 h i e i ，1 9 9 7 ) 。 1 2 农杆菌与小麦的遗传转化 1 2 1 农杆菌介导小麦遗传转化的发展历程 转化植物细胞的农杆菌有两类，即根癌农杆菌( a g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n s ) 和发根农杆菌( a g r o b a c t e r i u mr h f z o g e n e s ) 。前者含t i 质粒， 后者含融质粒，其中对t i 质粒的研究比较详细，而且应用广泛。根癌 农杆菌是革兰氏阴性菌，能够感染大多数双子叶植物的受伤部位，并使 之产生冠瘿瘤( g r o w g a l l t u m o r ) 。5 0 年代中期，人们在冠瘿瘤组织中发 现了冠瘿碱( o p i n e ) ，冠瘿碱可以为根癌农杆菌的生长提供碳源和氮源。 1 9 7 4 年，人们发现根癌农杆菌在感染植物时，可以将其环状t i 质粒l 的 一段d n a 插入到植物基因组中，并引起植物遗传特性的改变。这一发现 激起了人们利用农杆菌进行遗传转化研究的兴趣，1 9 8 3 年，第一株通过 农杆菌介导法获得的转基因植株问世，很快这一方法就成为双子叶植物 遗传转化的主导方法。能否将这一方法应用到包括小麦在内的单子叶植 物的遗传转化中，成为随后争论的焦点。一种倾向性的观点认为，单子 叶植物不是农杆菌的天然寄主，利用农杆菌介导转化单子叶植物几乎不 可能或没有可能性【6 8 3 ( b t n n sa ，1 9 9 0 ；v i i a y a c b a n d r ak ，1 9 9 5 ) 。这种观点的 代表人物是曾在禾谷类作物组织培养与遗传转化方面卓有建树的瑞二i 二科 学家p o t r y k u s ，他在国际权威杂志“b i o t e c h n o l o g y ”和“n a t u r e ”上都发 表了他的悲观论点 6 0 , 6 1 ( p o t r y k u s ，1 9 9 0 ；p o t r y k u s ，1 9 9 2 ) 。其中，主要提到了 以下几个原因：( 1 ) 多数单子叶植物的细胞缺少农杆菌的附着位点，使 农杆菌难以附着到细胞表面；( 2 ) 单子叶植物缺乏诱导v i r 区活化的因 子，限制了t - d n a 向植物细胞的转移；( 3 ) 单子叶植物伤口处的细胞易 木质化或死亡。与此同时，也有一些科学家专门为验证农杆菌转化单子 叶植物的可行性而设计了农杆菌的感染实验，结果分别证明了玉米细胞 和小麦细胞的可转化性【2 7 3 2 5 3 ( o r i m s l e yn ，1 9 8 9 , h e s s ，1 9 9 0 ：m o o n e v e 1 9 9 1 ) 。而农杆菌介导法的石刁柏转基因植株的获得9 1 饵v t e b i e r , 1 9 9 3 ) 特别是农杆菌介导的转基因水稻3 4 ( c h a r t ，1 9 9 6 ；h i d ，1 9 9 4 ) 和转基因玉 山东农业大学硕士学位论文 p 1 9 9 6 ：n e g r o t t od ，2 0 0 0 ：w r i g h t ，2 0 0 1 ) 、绿色荧光蛋白基因( g f p ) 。” ( h u w ，1 9 9 5 ：b i a om a ，2 0 0 0 ) 和核糖醇操纵子基因( r t l ) “”( l a f a y e t t epr ， 2 0 0 1 ) 等，这类基因与常规基因不同，这类标记基因没有抗生素和除草剂 抗性，相对来说对生物是安全的，因此被称为生物安全标记基因。它们 通过调控植株的新陈代谢，仅使有目的基因表达的植株保留下来，而不 含有目的基因或者目的基因不表达的植株因不能进行正常的新陈代谢而 死亡啡3 ( n e g r o t t od ，2 0 0 0 ) 。( 2 ) 利用分别带有目的基因和筛选基因的两 种质粒进行共转化，由于这两种基因分别位于不同的质粒，遗传距离较 大，这样就可以利用它们在自交后代中的性状分离而达到去除筛选标记 的目的。( k o m a r it ，1 9 9 6 ) ；( 3 ) 在筛选结束以后，将染色体中的标记基 因进行基因敲除”3 ( z a b k oe ，2 0 0 0 ) ；( 4 ) 避免使用标记基因，直接利用 分子生物学的方法进行筛选，目前这一方法只停止在理论上。其完整的 筛选程序尚未见报道( h o l g e rp ，2 0 0 0 ) 。 1 2 2 影响农杆菌介导小麦遗传转化的因素 影响农杆菌介导小麦遗传转化的因素有很多，如愈伤组织的分化能 力，转化条件，载体的构建等，下面就其主要影响因素作简要概括。 1 2 2 1 小麦坯性愈伤组织的诱导及檀株再生技术体系的建立 诱导产生胚性愈伤组织，建立高效的植株再生体系，从而提高愈伤 组织的分化能力是农杆菌介导小麦遗传转化成功的前提之一，它受基因 型、外植体来源、培养基及各种组培技术的影响( k a p i l a r k ，1 9 9 3 ) 。 基因型与小麦愈伤组织的分化能力有着密切的关系。不同基因型之 间，其出愈率没有显著差别，而愈伤组织的再生能力随基因型不同差异 却较大w ( 王常云，1 9 9 9 ) ，不同基因型愈伤组织分化能力的差异，在仞期 表现不明显，只有当长期培养后才表现出来【1 2 3 】( 于晓红，1 9 9 9 ) 。叶兴 国等”“1 ( 叶兴国，2 0 0 0 ) 以2 5 个小麦品种的幼胚为材料，对其培养力 进行比较，结果表明：所有基因型的幼胚出愈率均很高，基因型之i 、自j 没 有显著差异，但愈伤组织的质量在基因型之间存在显著差异，愈伤组织 的质量与愈伤组织的再生能力赢度正相关。小麦幼胚的愈伤组织，特别 是胚龄为1 5 天左右的幼胚及胚性愈伤组织具有较强的植株再生能力，它 农杆荫介导小麦遗传转化体系的建立殷转基因研究 是迄今为正夺麦遗传转繇二鞠烹要受体。然蔼麓未残熬耱再生蘸的遥程魄 较慢，且常常因胚轴的早期萌发而使樽生过程变得复杂，因此，在培养 之蓠貉羟辘觚灌片缓缎孛除去，采蠲分离静嚣片缓纸篓荔获褥小麦豹蕊 效再生体系【3 l 】( h a r v e ya ，1 9 9 9 ) 。 撼物激素怼予缓织培莠中豹器窝藏坯教髂缮残爨毒重要豹调节俸 用。组织培养中生长綮和细胞分裂索两类物质的相对浓度控制着根、瞽 分化款模式1 7 6 l ( t r o t t i e rm ，1 9 9 3 ) ，鄂较高浓度黥生长素 a a 、i a a 、2 ， 4 d 1 肖利于根的形成而抑制势的形成：相反，较高浓度的细胞分裂索 ( k t 、t d g ) 商剥予棼的形成蕊掇焦4 根的形成。在以势分纯荛兰要基的 的分化培养萋上，一般要去撺2 , 4 d ，添加细臆分裂素t d z 或k t ，浓度 为1 o m g l 为畿【l ”j ( 予晓红，1 9 9 9 ) 。t d z 具有明显的促进生芽的效果， 但对生根可能有一定稚度的抑制。在以报分他为主要瞬的的分化培养蒸 上应加入适宜浓度的n a a 或i a a 。n a a 及i a a 都有促进芽生根的作用， 僵n a a 乍鬲辩闻长，不易分解，易使泻生根系中的裰过分生妖褥导致培 养基消耗过快，不利于其移入土中栽培的炼菌，而i a a 易于分解，其降 解餍麓较短，在诱导象校嚣，+ 佼爵生穰在不禽乡 源激索的条件下生氏， 再生槭株正常。研究认为宣在生根培养基中加入低浓度n a a 溅用 a a 取饯n a a 诱鼙釜裱 1 2 3 ( 予貉缝，1 9 9 9 ) 。闻辩，兔提嵩愈伤缓绞豹质蠹， 在继代培养基中，可加入一定浓度的a b a 和2 , 4 - d 。不同基因型出愈率 不受2 , 4 - i ) 浓凌大夺袋翱，毽分傀率帮举夏。不弱基因受其分铯攀涟2 , 4 d 浓度变化程度也不一样，总趋势是随着2 ，4 - d 浓度的增加，分化率均量 单蜂裁线交l 蛰u 趣( 王嚣云，2 0 0 0 ) 。 、 愈伤组织在转到分化培养基前经遁当时间的干燥处理，可以明显的 提毫撼拣再生频率，缎如果楚毽嚣惩趱长，愈伤组织失承过多，暑致一 些细胞歹e 亡，分化能力反而降低。对太小不同的愈伤组织，进行干燥处 理的持续时间也有所不同f 州( w a l d e nr ，1 9 9 5 ) 。另多 ，妨坯嚣黠教鬟方 向对愈伤组织的再生攀也有一定的影响，盾片向上放鬣可以获得更多弼 生茁及j e 性系后代0 】f 正常云，1 9 9 9 ) 。 1 2 。2 2 寝达袭体的祷建与农秆蕾株系的选择 转基因植物外源懿因的表达直接受表达载俸的表达效率影响，为了 幽查查些盔鲎堡：竺! 照造壅 键高表运载俸静表达效率，久们对纂困调控序列的辑究不断深入，嚣翦， 对表达载体的研究主要集中在以下几个方筒：( 1 ) 通过选择强启动子和 嚣缰成型囊动子来罐离表达效率。在不同熬转萋嚣 耋餐审，来源不溺翡 启动子表达效率有明显差异，通常来自于单子叶槭物的启动子，农单子 时檀物中鹣表达效率滋在黢子竹稳物中离豹多，爱之亦然”# q ( t a y l o r m g ，1 9 9 3 ；a u e m i t a 1 9 9 8 ) 。来自于单子叶植物的a c t l 和u b i l 启动予是目 蘸小麦转蒸因中疲耀最罄遽夔缰戏翟癌动予，它致表达远逡裹手谯双予 叶植物中被广泛应用的c a m v 3 5 s 启动子。另外，由于非组成型扁动子 可以避免羚源基嚣持续表达爨造或数缀腿能量的浚费窝基越造成豹对细 胞正常生理活动的干扰，促进外源基因的商效表达，从而越来越引起人 们的重视。到目煎为止，这类基因已被成凌运臻予基嚣工糙雄性不育小 轰的获得w 8 ”( a l v a r e zml ，2 0 0 0 潮z em ，1 9 9 ；t a k u m is ，1 9 9 9 ) 。( 2 ) 利用内 含子和增强子增强启动子的表达效率。有研究证明，在启幼子和报告基 闲之间插入单子盼植物基阂的内禽予。可以大大掇高基因在单子时植物 中的表达效率 1 4 , 1 9 l ( c l a n c ym ，1 9 9 8 ；d e m e k et , 1 9 9 9 ) 。c h e n g 等【1 2 】( c h e n g , 1 9 9 7 ) 弱焉c a m v 3 5 s 癀韵予和h s p 7 0 内含予构建的农秆菌表达载体在小 麦上得到了高达4 3 的转化效率。另外，增强子捅入到扁幼予附：j 醺也能 爨赢表达效率 3 , 6 2 1 ( b a l l an ，1 9 9 7 ，p r e u s ssb ，1 9 9 9 ) 。( 3 ) 胃滋翻焉对感动子 区的加倍来增加奠表达效率。一些研究表明，c a m v 3 5 s 商幼区加倍可明 篡箍毫基瓣表达拳平l 引l ( k a yr ，1 9 9 7 ) 。郭焱寨等【1 髓鼋彝鼗窳，1 9 9 7 ) 以4 , 麦为材料进行研究，结果袋明，不同启动予串联聪也可促进外源熬因的 表达。另终，不羁物理形态矮粒d 黻瓣转纯效果穗鸯一定蠹馨彰确。荦链、 线性双链和环状双链质粒d n a 均可以得到转基因小麦植株，但是，在瞬 趣表达中，交牲鲶理豹袋装d n a 熬转纯效率明基低予黢链。d n a “”3 ( r o d e n b u r yk ，1 9 8 9 ：f u r n e ri ，1 9 8 9 ) ，而线性质j | 馥d n a 的转化效率较之 环状质粒d n a 要燕 a i np ，1 9 9 3 ) 。 农秆菌株系的类型和浓度对转化率也有很犬的影响。适当选用 e h a l 0 5 ，m o g l 0 1 ，a b i ，a g i 等糍毒性农拇蓉鹫太大提糍农抒麓的镘 梁力“( g u ogm ，1 9 9 8 ；u z em ，2 0 0 0 ) 。同时，适宜的农杆黼浓度c 照是必 需的，若浓度过低，转化效率过低，若浓度过寒，则造成细胞损呋 - 分 农杆菌介导小麦遗传转化林系的建立及转基因研究 严重，导致相当一部分细胞死亡或失去分化能力，适宜浓度为1 0 8 m l “2 ”j f 王景雪，1 9 9 9 ；刘庆法，1 9 9 8 ) 。 1 2 2 3 转化条件 关于农杆菌介导的小麦遗传转化条件的研究报道较少，目前还没有 比较深入和系统的研究，但其中部分环节已有报道。有研究表明，渗透 处理可以增强瞬间表达和稳定转化效率口j ( b r e t t s c h n e i d e r r l 9 9 7 ) ，原因 是较高的渗透压下植株表现较高的脱落酸( a b a ) 生物合成活性，而a b a 可促进小麦的胚胎建成。研究表明，乙酰丁香酮是有效的诱导物质，它 可以诱导v i r 基因的表达，从而促进t d n a 向植物细胞的转移，是禾谷 类和其他单子叶植物转化的必要条件之一【3 8 - m l ( j e a ng ，1 9 9 1 ：李宝健， 1 9 9 0 ) 。乙酰丁香酮的作用效果有一临界浓度，其诱导作用并非随着浓度 的增加而加强【l ”】( 刘庆法，1 9 9 8 ) ；也有研究表明，由于不同作物或基 因型所含的v i r 基因诱导物的种类和数量不同，因此被农杆菌侵染的难 易程度也不同“( m o o n e y ，1 9 9 1 ) ；选择适当的基因型及对转化和再生都 处于感受态的外植体”“”1 ( g u og ，1 9 9 8 ：x i agm ，1 9 9 9 ) ，并对转化材料进 行适当的受伤处理可大大提高转化效率“。“哪( n e e t as ，1 9 9 9 ；明小天， 2 0 0 1 ) 。另外，表面活性剂t w e e n 2 0 在0 0 l 咖0 5 浓度范围内可提高 t - d n a 的转化效率，但并非转化所必需。 1 2 3 转化体的筛选 针对表达载体所构建的标记基因，选用有效的选择剂，施加适宜的 选择压是筛选转化细胞，获得抗性愈伤组织，最终获得转基因小麦的关 键步骤。研究表明，如果表达载体上有n p t i i 筛选标记基因，只能用g 4 1 8 作为选择剂，适宜用量为2 5 - - 5 0 0 m g 1 ，而不能用卡那霉素和新霉素， 因小麦愈伤组织对这两种抗生素具有很高的天然抗性侧( 0 r i t i zj 1 9 9 6 ) ；如果表达载体上有b a r 基因筛选标记，可用p p t 或b i a l o p h o s 作 为选择剂6 ”( n e h r ans ，1 9 9 5 ) ，适宜用量为3 5 i i i g l ；如果表达载体上 有h p t 筛选标记，可选用潮霉素，适宣用量为1 0 0 - - 1 5 0 m g 1 m 1 ( m c c o m a c ac ，1 9 9 8 ) 。 随着人们对转基因植物安全性的重视，以抗生素基因作为选择基因 将逐渐在小麦转基因中被取消，代之而来的是不同的抗除草剂基因，不 同糖类和激素类基因。明显易见而又对小麦有益的报告基因，如花色素 基因等将会得到较普遍的应用，转化效率也将会大为提高m s ( l i uy g ，1 9 9 9 ) 。 1 2 4 存在的问题与解决的方法 目前，在小麦遗传转化研究中存在的主要问题包括： 第一，基因型的依赖性。小麦组织培养中植株再生率低和基因型依 赖性很强的问题是限制转基因成功及大幅度提高转基因植株数量的重要 因素。目前，人们认识到，b o b w h i t e 等基因型的培养力高，转化效率好， 但其农艺性状较差，不能在生产中直接利用，已经着手于从现在推广的 小麦优良品种中筛选高培养力的基因型，作为小麦遗传转化的受体以 拓宽受体基因型。但是，就基因型的筛选来说，工作量相当大，既然愈 伤组织的质量及其植株再生能力对基因型有很强的依赖性，可以进一步 研究其遗传特点并建立与之相关的分子标记，这样可以避免大量的筛选 工作。有利于拓宽受体基因型。 。 第二，基因沉默现象，这是任何一种转基因植物实现产业化首先要 克服的的问题。与其它作物相比较，小麦为异源六倍体，其本身的遗传 背景较为复杂，基因沉默现象更为常见。随着包括农秆菌介导法在内的 小麦遗传转化体系的建立和完善，小麦中的基因沉默问题将会越来越受 到人们的关注。关于转基因沉默的分子机理，目前还不清楚。很可能存 在一种以上的作用方式，没有一种模式适合于所有的转基因沉默现象， 一例转基因沉默中也可能存在一种以上的作用模式。转基因沉默机理的 复杂性可能与植物中基因表达调控的复杂性有关，比较肯定的是很多转 基因沉默与同源序列有关。通过后代有性分离筛选单拷贝基因个体可以 降低转基因沉默的可能性。另外，构建含有核基质支架附着区的转化载 体可以有效的提高转基因的表达，抑制转基因的沉默，并且其整合具有 一定的方向性”“( v a i np 1 9 9 9 ) 。 另外，基因工程育种的前提和条件是必须克隆大量可供利用的功能 基因。在各种植物的转化体系日益完善的今天，可供利用的功能基因少 农杆菌介肆小麦遗传转化体系的建立及转撼因研究 这一问题将是今后限制植物遗传转化的关键所在a 羹3 本研究鳃誉的意义 目前世界上虽然已经有农杆菌转化小赘成功的报道，假转化效率均较 低，显在缀大理发上受到基嚣登游疆割，因蠢缀难说已经建立蒸了有效 的农杆菌介导小麦遗传转化体系。鉴于农杆菌介导法的诸多优点，对于 鏊疆组j 卷复杂瓣小麦穗言，遴一步辍强怼其转纯系统瓣研究鬟窍重要 意义。 本磺究斡星靛在于掇素影# 趣农抒蘩食导转化小麦懿鬟要嚣豢，完善 组培技术，建立高效的檬株再生体系，优化农杆菌转化小麦的各参数及 条 牛，为建立离效率的农枵菌禽譬的小麦遗传转织体系羹定基磷，羼封， 利用建立的转化体系进行小麦遗传转化研究。 2 。材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 植物试材 鼷柬甓纯终织壤养体系、薅遥霞炎蒺嚣墅鹣酱逶小麦( 7 r y t i c u m a e s t i v u m l ) 材料有：山农9 9 5 6 0 4 、山农7 9 2 、山农9 0 2 1 和山农1 1 t 9 8 5 2 9 均兔本实验室选嵩弱褰我晶系；瀵麦1 2 、爝表l 、翅辏1 8 8 , w 9 9 4 11 7 、 f 2 8 1 1 0 、花育8 8 8 、河北1 2 0 、河北2 1 5 、河北3 4 1 、豫燮1 8 、豫菠2 l 、 豫裹3 l 、攀谯4 努、兰考9 0 6 、孛佐9 5 0 7 髑s c ￥一3 4 一1 0 3 逶获謇蠹牧集 的材料，豳本实骏室种植保存：意大利小麦、l o c a lc h e c k 、c n 0 6 7 s o n 6 4 和v o r a n a h d 2 4 0 2 为国终弓l 进的葶孛震耪3 l l ； 。 在基潮型筛选研究的基础上，以高诱露率的基因型山农9 9 5 6 0 4 的幼 胚愈伤组织为遗传转化的受体，遴行遗传转纯体系豹研究。 2 1 2 黼株与质粒 + l 、n 1 0 5 、p v e c t o r 2 0 7 菌株n 1 0 5 由何道一老师提供，质粒p v e c t o r 2 0 7 由生科院郑成超老 爆提供。该度粒孛含毒g u s 摄餐萋嚣，荔予转纯鑫戆抉滚检嚣，糟j ： 1 6 山东农业太学硕士学位论文 遗传转稼体系静饶佬过稷。震粒络梅翔下： 2 、l b a 4 4 0 4 p r o k 2 菌株l b a 4 4 0 4