（内科学专业论文）不同剂量glp1对iugr幼鼠胰岛β细胞的保护作用.pdf

目录 一、摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要3 二、英文缩略语5 三、论文 前言6 日i j舌o 材料和方法8 结果1 4 讨论1 9 结论一2 1 四、本研究创新性的自我评价2 2 五、参考文献2 3 六、附录 综述2 6 在学期间科研成绩3 4 致谢3 5 个人简介3 6 中文论著摘要 不同剂量g l p 1 对i u g r 幼鼠胰岛i j i 细胞 的保护作用 目的 研究生后早期皮下注射不同剂量的胰高血糖素样肽1 ( g l p 1 ) 对宫内发育 迟缓( i u g r ) 幼鼠的胰岛b 细胞的p d x 1 和b c l 2m r n a 表达情况，探讨g l p 1 对i u g r 幼鼠的胰岛d 细胞的保护作用，以及g l p 1 对i u g r 幼鼠胰岛p 细胞 的最佳保护剂量。 方法 普通系雌性w i s t a r 处女大鼠9 0 只，雄性1 5 只，体重2 2 0 2 5 0 克，按雌雄6 ：l ， 于前一天傍晚合笼。次晨取雌鼠阴道分泌物涂片，以显微镜下检出精子为妊娠第 1 天，并分笼单独饲养，选择自然分娩。胎仔i u g r 诊断标准：以对照组活仔平 均体重减去2 个标准差作为i u g r 的诊断标准。给予孕期i u g r 组母鼠喂养7 低蛋白饲料建立i u g r 幼鼠模型，哺乳期给予2 0 蛋白普通饲料喂养；对照组( c 组) 母鼠孕期及哺乳期全程给予2 0 蛋白普通饲料喂养。i u g r 幼鼠随机分为四 组：2 0 u g k gg l p 一1 皮下注射组( 简称i u g r 2 0 组) ；( 喜) 6 0 u g k gg l p 一1 皮下注 射组( 简称i u g r 6 0 组) ，1 0 0 u g k gg l p 1 皮下注射组( 简称i u g r l 0 0 组) ， i u g r 空白对照组，不进行任何干预( 简称i u g r 组) 。每组1 6 只i u g r 幼鼠。 于生后1 周和3 周取出胰腺，r e a l t i m ep c r 法检测新生幼鼠胰腺p d x 1 和b c l 2 m r n a 表达情况。 结果 1 、空腹血糖和血浆胰岛素：生后7 天和2 1 天，c 组、i u g r 组、i u g r 2 0 组、i u g r 6 0 组和i u g r l 0 0 组幼鼠的空腹血糖和血浆胰岛素较出生1 天时没有 显著性变化，无统计学差异( p 0 0 5 ) 。 2 、p d x 一1m r n a 表达：生后1 周时，c 组幼鼠胰腺的p d x 1m r n a 表达 显著高于i u g r 组、i u g r 2 0 组、i u g r 6 0 组和i u g r l 0 0 组( p 0 0 5 ) ；i u g r l 0 0 组与i u g r 组相比，明显升高( p o 0 5 ) 。生后3 周时，c 组幼鼠胰腺的p d x 一1m r n a 表达显著高于i u g r 组、i u g r 2 0 组、i u g r 6 0 组和i u g r l 0 0 组( p o 0 5 ) ；i u g r 6 0 组和i u g r l 0 0 组显著高于i u g r 组( p 0 0 5 ) 。 3 、b c l 2m r n a 表达：生后1 周时，c 组幼鼠胰腺的b c l 2m r n a 表达显 著高于i u g r 组、i u g r 2 0 组、i u g r 6 0 组和i u g r l0 0 组( p o 0 5 ) ； i u g r l0 0 组与i u g r 组相比，明显升高( p o 0 5 ) 。生后3 周时，c 组幼鼠胰腺的b c l 一2m r n a 表达显著高于i u g r 组、i u g r 2 0 组、i u g r 6 0 组和i u g r l0 0 组( p 0 0 5 ) ；i u g r 6 0 组和i u g r l0 0 组显著高于i u g r 组( p 0 0 5 ) 2 、p d x lm r n ae x p r e s s i o n ：7d a y sa f t e rb i r t h ，p d x - 1m r n a e x p r e s s i o no fi s l e t 1 3 - c e l l o fcg r o u pr a t sw a ss i g n i f i c a n t l y h i g h e rt h a ni u g rg r o u p i u g r 2 0 g r o u p ，i u g r 6 0g r o u pa n di u g r l 0 0g r o u p ( p o 0 5 ) ；p d x 一1r n r n ae x p r e s s i o no f i s l e tb - c e l lo fi u g r10 0g r o u pt h e r ew a sh i g h e rt h a ni u g rg r o u p ( p 0 0 5 ) 21d a y s a f t e rb i r t h ，p d x - 1m r n ae x p r e s s i o no fi s l e t1 3 - c e l lo fcg r o u pr a t sw a ss i g n i f i c a n t l y h i g h e rt h a ni u g rg r o u p ，i u g r 2 0g r o u p ，i u g r 6 0g r o u pa n di u g r l 0 0g r o u p o o 0 5 ) ；p d x - 1m r n ae x p r e s s i o no fi s l e t1 3 - c e l lo fi u g r l 0 0g r o u pa n di u g r 6 0 g r o u pw a sh i g h e rt h a ni u g rg r o u p ( p 0 0 5 ) 3 、b c l 一2m r n a e x p r e s s i o n ：7c l a y sa f t e rb i r t h ，b c l 一2m r n ae x p r e s s i o no fi s l e t 1 3 - c e l l o fcg r o u pr a t sw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a ni u g rg r o u p ，i u g r 2 0 g r o u p ，i u g r 6 0g r o u pa n di u g r l 0 0g r o u p ( p 0 0 5 ) ；b c l 一2m r n ae x p r e s s i o no f i s l e t1 3 - c e l lo fi u g r l0 0g r o u pt h e r ew a sh i g h e rt h a ni u g rg r o u p ( p 0 0 5 ) 21d a y s a f t e rb i r t h ，b c l 一2m r n a e x p r e s s i o no fi s l e t 3 - c e l lo fcg r o u pr a t sw a ss i g n i f i c a n t l y h i g h e rt h a ni u g rg r o u p ，i u g r 2 0g r o u p ，i u g r 6 0g r o u pa n di u g r l 0 0g r o u p 0 0 0 5 ) ；b c l 一2m r n ae x p r e s s i o no fi s l e t1 3 - c e l lo fi u g r 10 0g r o u pa n di u g r 6 0 g r o u pw a sh i g h e rt h a ni u g rg r o u p ( p 0 0 5 ) c o n c l u s i o n s n e o n a t a lr a t sa r eh y p o d e r m i ci n j e c t e do fg l p 一1e a r l ya f t e rb i r t h ，c a n n o ta f f e c t b o d yw e i g h ta n dt h ew e i g h to ft h ep a n c r e a s n e o n a t a lr a t sa r eh y p o d e r m i ci n j e c t e d e n o u g hd o s eo fg l p 1e a r l ya f t e rb i r t h ，l a s t i n gf o ral o n gt i m e ，c a np r o t e c ti s l e tpc e l l o fi u g rr a t s k e y w o r d s g l p 一1 ；i u g r ；p d x 一1 ；b c l 一2 ；r a t ；i s l e l 3 c e l l ；p r o t e c t i v ee f f e c t 4 英文缩略语 5 中第一次分离出了哺乳类的胰高血糖素原c d n a ，其编码3 种胰高血糖素相关肽， 即胰高血糖素、g l p 1 和g l p 2 。g l p 1 是由胰高血糖素原基因编码，并由胰高 血糖素原转化而来。g l p 1 能够以葡萄糖依赖的形式促进胰岛素分泌并能抑制胰 高血糖素的释放，对2 型糖尿病( t 2 d m ) 起到了多重治疗效应【2 】。g l p 1 与其受体 结合后，促进葡萄糖依赖的胰岛素分泌、胰岛b 细胞增殖和分化，而且还可抑制 凋亡，延迟胃排空，增加外周组织对胰岛素的敏感性，但不引起体重增加和低血 糖，从而保护了胰岛b 细胞的功能。在疾病早期应用此类药物后，受损的p 细胞 功能和b 细胞数量有逆转的可能。 1 、促进胰岛素释放 激活g l p 1 受体( g l p 1 r ) 后促进胰岛素分泌的途径相当复杂，有多种细胞 第二信使系统参与。g l p 1 受体是g 蛋白耦联受体，有7 个跨膜结构，它与激动剂 结合后通过g 蛋白激活腺苷环化酶增加细胞c a m p 浓度，后者通过蛋白激酶 a ( p k a ) 途径增：j i l l 型电压门控钙离子通道的钙离子内流和内质网钙离子释放而 活化钙调蛋白，最终胰岛素出胞作用增划3 1 ，这是一条主要途径。还有鸟苷酸转 化因子( g e f s ) 、磷脂酰肌醇3 激酶( p 1 3 k ) 和丝裂原活化蛋白激酶( m a p k ) 等途径也 参与其 t 4 , 5 】。g l p 1 可促使靠近细胞膜的分泌颗粒快速释放，提示g l p 1 有可能 帮助糖尿病患者恢复胰岛素的第一时相分泌。同时，g l p i 促胰岛素分泌作用是 葡萄糖依赖性的，上述促胰岛素分泌的基础是b 细胞内葡萄糖磷酸化后a t p a d p 比值升高。当血糖低于5 m m o l l ，g l p 1 不再有促胰岛素分泌作用【6 】。 6 2 、增加胰岛素的合成和分泌 研究表明，g l p 1 治疗2 4 d 、时后，胰岛细胞内胰岛素含量增加至基础的1 5 倍i ，与胰岛素基因的转录和胰岛素m r n a 稳定性增加有关，而这与g l p 1 激活 重要的核转录因子胰腺十二指肠同源盒i ( p d x 1 ) 是密不可分的【引。 3 、影响胰岛b 细胞凋亡、增殖和再生 一些体外或动物试验发现g l p 1 还可增加p 细胞数量，推测这与它增加胰岛 细胞增殖、减少细胞凋亡的作用有关。除前述p d x 1 是重要途径外，是否存在其 他多种作用途径，还需进一步研究明确 9 1 。f a r i l l a 【1 伽等还发现g l p 1 降低了凋亡 基因c a s p a s e 3m r n a 的转录水平及转录后活性，同时上调了抗凋亡基因b c l 一2 的表达水平。有研究发现g l p 1 胰岛细胞缺乏的动物模型也有治疗效果，并在胰 腺腺管区发现一些细胞可能产生胰岛素【1 1 1 。但由于没有确切的胰岛细胞干细胞 应有的细胞标记，对g l p 1 能否使胰岛细胞再生尚有争议。 4 、抑制胰升血糖素分泌 在体内和体外试验中都观察至u g l p 1 可减少胰升血糖素的分泌【1 2 】。但关于胰 岛a 细胞是否存在g l p 1 受体的研究结果尚不统一，大部分研究发现胰岛a 细胞 并无g l p 1 受体分布。推沥u g l p 1 抑制胰升血糖素分泌并不直接通过受体途径， 而可能是通过其他间接途径实现的。 5 、g l p 1 的胰外作用 除胰岛以外，g l p l 受体还存在于人类大脑、肺、肾脏、胃和心脏等组织1 4 1 。 这与g l p 1 减慢胃排空、抑制食欲和明显减轻体重的胰外作用相关。g l p 1 受体 分布在与食欲调节关系密切的下丘脑室旁核、垂体等处，激活受体可抑制食欲 【1 5 】。减慢胃排空可以增加患者的饱腹感和减慢食物吸收，与减轻体重和降低餐 后血糖有关。这些胰外作用对控制血糖及全身代谢紊乱也有益处。 二、宫内发育迟缓( i u g r ) 胎儿宫内发育迟缓( i n t r a u t e r i n eg r o w t hr e t a r d a t i o n ，i u g r ) ，又称为胎儿生长 受i ；t 是( f e t a lg r o w t hr e s t r i c t i o n ，f g r ) 是指出乍体重低于相应孕周胎儿乎均体重第1 0 百分位数或低于平均体重两个标准差。是围产期主要并发症之一。d e n o i s 等报道 发展中国家i u g r 的发病率达11 【l 酬。宫内发育迟缓( i u g r ) 不仅是造成围产儿死 亡和发病的重要原因之一，还会影响到患儿生后的正常生长发育，导致智力障碍、 7 身材矮小、胰岛素抵抗、代谢综合征、糖尿病和肥胖症等【切。s e a g l i a l e t l 8 1 研究 发现：大鼠在胎儿和新生期存在内分泌胰腺的结构改变，动态观察3 0 天内新生大 鼠胰腺发育，发现大鼠在胎儿和新生期也存在内分泌胰腺的重构。c h e r i f 等 1 9 】进 一步观察到母鼠营养不良可导致胎鼠d 细胞功能受损，胰岛素分泌减少。可见， 胎儿期和生后早期均是胰岛重构的关键时期，且这一时期对营养不良极其敏感， 此后胰岛的结构和功能将被“程序化”，对血糖的自稳态将产生终生的影响。当低 出生体重仔鼠饲养至2 6 周时，其胰岛d 细胞龟更是下降到不足正常大鼠的1 3 1 2 们。 尽管低出生体重仔鼠的相关研究已取得一些进步，但足国内尚缺乏关于生后早期 低出生体重仔鼠胰岛结构和功能方厩的研究。目前有多种建立i u g r 动物模型的 方法，如血管栓塞法、双侧子宫动脉结扎法、被动吸烟法、低蛋白饮食法等。目 前临床试验中观察到，孕母营养不良仍然是胎儿i u g r 发生的主要原因之一。母 鼠孕期营养不良是研究i u g r 的经典模型，慢性蛋白质营养不良模型采用单一影 响因素，更好的模拟了人类营养不良的状态而且成模率较高，因此我们选用此种 方法建立模型。 实验材料和方法 一、实验材料 ( 一) 实验动物 1 、实验对象 普通系雌性w i s t a r 处女大鼠9 0 只，雄性1 5 只，体重2 2 0 2 5 0 克，( 由中国 医科大学附属盛京医院实验动物中心提供) 。适应性喂养两周，明暗周期为1 2 小时( 8 a m 8 p m ) ，饲养及实验室室温2 0 , - - - 2 5 ，光线适中，环境清洁安静。按 雌雄6 ：1 ，于前一天傍晚合笼，次晨取雌鼠阴道分泌物涂片，以显微镜下检出 精子为妊娠第1 天，并分笼单独饲养，选择自然分娩。胎仔i u g r 诊断标准： 以对照组活仔平均体重减去2 个标准差作为i u g r 的诊断标准。 2 、实验分组 将雌性w i s t a r 处女大鼠随机分为：低蛋白饮食实验组( 简称为i u g r 组) 和正 常蛋白饮食对照组( 简称为c 组) 。 正常蛋白饮食对照组( c 组) ，不进行任何干预。 8 低蛋白饮食i u g r 组幼鼠随机分为四组： ( 1 ) 2 0 u g k g g l p 一1 皮下注射组( 简称为i u g r 2 0 组) ； ( 2 ) 6 0 u g k g g l p 一1 皮下注射组( 简称为i u g r 6 0 组) ； ( 3 ) 1 0 0 u g k g g l p 一1 皮下注射组( 简称为i u g r l 0 0 组) ； ( 4 ) i u g r 空白对照组，不进行任何干预( 简称为i u g r 组) 。 每组1 6 只i u g r 幼鼠。产仔超过1 2 只和小于6 只的母鼠连同其幼鼠一起剔 除实验；每窝多余( 即超过8 只) 的仔鼠于出生l 天内即随机剔除实验；整个哺乳 期间保证每窝有6 8 只幼鼠。 然后通过r e a l t i m ep c r 检测新生大鼠7 天和2 1 天时的胰岛p 细胞p d x 一1 和b c l 2m r n 表达，以观察每一剂量组对胰岛b 细胞的保护作用。( 见图1 ) 图1 ，雌性w i s t a r 处女大鼠分组 3 、动物模型 ( 1 ) 低蛋白饮食法建立i u g r 鼠动物模型【1 5 】。低蛋白饮食组孕鼠孕期全程 喂养含7 低蛋白饲料喂养；哺乳期给予2 0 蛋白普通饲料喂养 ( 2 ) 正常对照组母鼠孕期及哺乳期全程给予2 0 蛋白普通饲料喂养。 4 、饲料配方 ( 1 ) 普通饲料：实验鼠普通标准饲料( 中国医科大学实验动物中心提供) ( 2 ) 低蛋白饲料：其配方为：大豆分离蛋8 7 ，淀粉3 6 ，蔗糖1 5 ，糊 精3 0 ，纤维素4 ，香油4 ，多维0 2 5 ，多矿3 5 和胆碱0 2 5 。( 由中国医 9 学科学院实验动物研究所配制) 。 ( 二) 主要试剂 异丙醇 氯仿分析纯 d e p c 水 d e p c 处理水 s v b r * p r i m e s c r i p t * r t - p c rk i t s y b r p r e m i xe xt a q t mi i ( 三) 主要仪器 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 t a k a r a 宝生物工程( 大连) 有限公司 瞰a r a 宝生物工程( 大连) 有限公司 t a k a r a 宝生物工程( 大连) 有限公司 t a k a r a 宝生物工程( 大连) 有限公司 无菌手术器械中国医科大学动物实验室 光学显微镜日本p l y m p u s 光化学公司 精密可调微量移液器 e p p e n d o r f 公司 d n a r n a 浓度测定仪法玛西亚公司 f a l6 0 4 s 电子天平上海天平仪器厂 p c r 扩增仪日本t a k a r a d u p o n ts u p e rt 2 1 型高速低温离心机 美国s o r w a l l 公司 t h e r m a lc y c l e rd i c e 荧光定量p c r 扩增仪h * t a k a r a 二、实验方法 ( 一) 标本采集 1 周龄幼鼠采用低温速冻法处死，3 周龄幼鼠采用颈部脱臼法处死，然后将 动物固定于手术台，剪开腹腔用弯形持物钳将胃翻起，除去胃和脾脏之间的薄膜， 见到下方有如树枝状的肉色组织，即胰腺。快速完整分离胰腺，称重，置于冻存 管投入液氮中保存，备做r e a l t i m ep c r 检测。 ( 二) 指标检测 采用r e a l t i m ep c r 方法检测胰腺p d x 1 、b c l 2m r n a 相对表达水平。 l 、实验用仪器及试剂 ( 1 ) 经i o d e p c 水处理的e p p e n d o r f 管( 1 5 m l ，0 s m l ，2 0 0 u 1 ) 和r i p 头( 2 0 u l ， 2 0 0 u l ，1 0 0 0 u 1 ) 若干，高压灭菌后备用 l o ( 2 ) 异丙醇( 分析纯) ，标明“r n a ”专用 ( 3 ) 氯仿( 分析纯) ，标明“r n a ”专用 ( 4 ) 7 5 酒精( 分析纯) ，用d e p c 处理水配制 ( 5 ) r n a i s o t m p l u s ( 6 ) s v b rp r i m e s c r i p t 固r t - p c r 瞄t ( 7 ) s y b r p r e m i xe x 嘲喇i i ( 8 ) d u p o n ts u p e rt - 2 1 型高速低温离心机 ( 9 ) d n a r n a 浓度测定仪 ( 1 0 ) p c r 扩增仪 ( 11 ) t h e r m a lc y c l e rd i c ，荧光定量p c r 扩增仪 2 、胰腺组织总r n a 提取步骤 ( 1 ) 取5 0 - - 1 0 0 m g 的胰腺组织，加入l m lr n a i s o 刑p l u s 试剂，充分匀浆 ( r n a i s o t m p i u s 先放子冰上1 。 ( 2 ) 将匀浆室温放置5 m i n 。 ( 3 ) 1 2 0 0 0 r p m ，40 c 离心5 m i n ，上清转移至新的1 5 m l t u b e 中。 ( 4 ) 加入1 5r n a i s o t m p l u s 体积量的氯仿剧烈震荡混匀3 0 s ，室温静置 5 m i n 。 ( 5 ) 1 2 0 0 0 r p m ，4 离心1 5 m i n 。 ( 6 ) 将上清液小心转移到新的1 5 m l 离心管中( 取4 0 0 p 1 ) ，加入等量体积 的异丙醇，上下颠倒几次混匀，室温下放置1 5 m i n 。( 此步中注意：不要吸取任 何中| 丑j 层物质，宁缺勿烂。) ( 7 ) 室温静置1 0 分钟。 ( 8 ) 1 2 0 0 0 r p m ，4 离心1 0 m i n 。 ( 9 ) 加入l m l d e p c 处理水配制的7 5 乙醇( 预冷) 洗涤1 次，将r n a 沉 淀弹起，漂沈。( 此时r n a 是不溶解的) ( 1 0 ) 1 2 0 0 0 r p m ，4 离心5 m i n 。 ( 1 1 ) 尽可能彻底地吸走上清，防止r n a 沉淀丢失。 ( 1 2 ) 放在室温下使乙醇完全挥发掉。 3 7 1 5 m i n ( 反转录反应) ； 8 5 5 s e e ( 反转录酶的失活反应) ； 将生成的e d n a 置于2 0 保存。 5 、r e a l t i m ep c r 反应 ( 1 ) 引物设计与合成根据n c b i 基因文库中大鼠基因d n a 序列，应用 o l i 9 0 5 0 软件设计符合引物标准的引物序列，全部引物及内参照g a p d h 由 t a k a r a 公司合成。 1 2 r e a lt i m ep c r 引物序列 ( 2 ) p c r 反应体系总体系1 0u l ，包括 试剂加样量 s y b r p r ei p r e m i xe xt a q 刑i i -_ p c rf o r w a r dp r i m e r ( 5 u m ) p c rr e v e r s ep r i m e r ( s u m ) d n a 模板( r t 反应液) d h 2 0 ( 灭菌蒸馏水) 5 u l 0 5 u l 0 5 u l 1 u l 3 u 1 ( 3 ) 扩增反应条件如下： 两步法p c r 扩增标准程序： s t a g el ：预变性 r e p e a t ：1 9 5 3 0 秒 s t a g e2 ：p c r 反应 r e p e a t ：4 0 9 5 5 秒 6 0 3 0 秒 s t a g e3 ：溶解曲线分析 9 5 o r ) 2 0 秒 6 5 1 5 秒2 0 秒 9 5 0 秒o 1 秒 6 、结果计算 a a c t = ( 实验组c t - 内参c t ) ( 对照组c t - 内参c d 目的基因表达量= 2 ( a a c t k ) 7 、结果分析 1 3 采用s p s s l l 0 统计软件在计算机上进行统计分析，所有数据用均数士标准差 表示，两组间均数采用t 检验，多组间样本均数的两两比较采用单因素方差分析 ( a n o v a ) d p 的最小显著差异法( l s d ) ，p 0 0 5 为显著性差异。 实验结果 一、动物模型比较 本实验通过母鼠孕期全程低蛋白饮食法成功建立了宫内发育迟缓( i u g r ) 幼鼠模型。生后1 天时，宫内发育迟缓幼鼠较正常对照组幼鼠明显瘦小；生后7 天时，宫内发育迟缓幼鼠较对照组幼鼠仍然明显瘦小，对照组幼鼠绒毛较浓密， 宫内发育迟缓幼鼠绒毛较稀疏；生后2 1 天时，对照组幼鼠皮毛浓密，毛色有光 泽，宫内发育迟缓幼鼠皮毛稀疏，毛色无光泽，较对照组仍然明显瘦小。 二、指标检测结果比较 1 、体重和胰腺重量变化 生后1 、7 和2 1 天，对照组幼鼠体重和胰腺重量显著高于i u g r 组、i u g r 2 0 组、i u g r 6 0 组和i u g r l0 0 组( 宰p 0 0 5 ) 。 ( 见表1 ，2 和图2 ，3 ) 。 与c 组相比，枣p o 0 5 1 4 6 0 5 0 ，、 4 0 栅 3 0 捡 2 0 l o o l7 与c 组相比，p 0 0 5 图2 ，生后1 、7 和2 1 天，各组幼鼠体重 日龄 表2 ，生后1 、7 和2 1 天，各组幼鼠胰腺重量的比较( m 曲 与c 组相比，p o 0 5 ) ( 见表3 ，4 ) 。 表4 ，生后1 、7 、2 1 天，各组幼鼠的血清胰岛素的比较( p m o l l ) 二、p d x - 1m r n a 和b c l 2m r n a 的表达 1 生后7 天时，c 组幼鼠胰腺的p d x 1m r n a 表达显著高于i u g r 组、 i u g r 2 0 组、i u g r 6 0 组和i u g r l 0 0 组( 宰p o 0 5 ) ；i u g r l 0 0 组与i u g r 组相比， 明显升高( j | j p 0 0 5 ) 。( 见表5 和图4 ) 。 表5 ，生后7 天，各组幼鼠胰腺p d x 1m r n a 的表达 与c 组相比，p 0 0 5 ，与i u g r 组相比，群p 0 0 5 1 6 c 组 i i j g ri u g r 2 0i u g r 6 0 i u g r l 0 0 分组 与c 组相比，幸p 0 0 5 ，与i u g r 组相比，撑p 0 0 5 图4 ，生后7 天，各组幼鼠胰腺p d x 1m r n a 的表达 2 生后2 l 天时，c 组幼鼠胰腺的p d x 1m r n a 也同样显著高于i u g r 组、 i u g r 2 0 组、i u g r 6 0 组和i u g r l 0 0 组( p o 0 5 ) ；i u g r 6 0 组和i u g r l 0 0 组显 著高于i u g r 组( 拌p 0 0 5 ) 。( 见表6 和图5 ) 。 表6 ，生后2 1 天，各组幼鼠胰腺p d x 1m r n a 的表达 c 组 i u g r 组i u g r 2 0 组i u g r 6 0 组 i u g r l 0 0 组 p d x 1 m r n a ( ) 一 7 9 3 6 士7 8 73 6 1 2 士3 3 8 4 2 3 6 士4 4 7 6 0 4 6 士6 2 4 哗6 8 5 3 ：t = 6 5 5 噌 与c 组相比，p 0 0 5 ，与i u g r 组相比，群p 0 0 5 金 金 芝 7 蓉 e z 管 一 山 e - - , 山 c 组 i i j g ri i j g r 2 0i i j g r 6 0i i j g r l 0 0 分组 与c 组相比，p 0 0 5 ，与i u g r 组相比，撑p o 0 5 图5 ，生后2 1 天，各组幼鼠胰腺p d x - 1m r n a 的表达 3 生后7 天时，c 组幼鼠胰腺的b c l 2m r n a 表达显著高于i u g r 组、 1 7 舌；舯加印的如埔0 4 生后2 1 天时，c 组幼鼠胰腺的b c l 2m r n a 表达显著高于i u g r 组、 i u g r 2 0 组、i u g r 6 0 组和i u g r l 0 0 组( 毒p 0 0 5 ) ；i u g r 6 0 组和i u g r l 0 0 组显 著高于i u g r 组( 群p 0 0 5 ) 。( 见表8 和图7 ) 。 表8 ，生后2 l 天，各组幼鼠胰腺b c l 2m r n a 的表达 与c 组相比，掌p 0 0 5 ，与i u g r 组相比，挣p 0 0 5 1 8 c 组 i u g ri u g r 2 0i u g r 6 0 i u g r l 0 0 分组 与c 组相比，宰p 0 0 5 ，与i u g r 组相比， fp 0 0 5 图7 ，生后2 1 大，各组幼鼠胰腺b c l 2m r n a 的表达 讨论 宫内发育迟缓胎j i , ( i u g r ) 是一种常见的妊娠并发症，它不仅影响胎儿的发 育，也影响儿童期及青春期的体能与智能的发育。近年来的流行病学统计和实验 研究均提示：i u g r 是造成胰岛素抵抗、2 型糖尿病、代谢综合征及心血管疾病 的重要原斟2 1 ，2 2 1 。 本实验通过低蛋白饮食建立了i u g r 模型，并对i u g r 组小鼠出生后进行 了不同剂量的g l p 1 的治疗干预。g l p 1 是一种主要由远端回肠、直肠和结肠 的l 细胞分泌的一种生理性多肽激素其有促胰岛素分泌作用最强，g l p 1 具有 葡萄糖依赖性促进胰岛素分泌作用【2 3 】，并且低剂量持续性注射g l p 1 可使d 细胞对葡萄糖的反应性恢复正常【2 4 】。 1 g l p 1 干预对g r 小鼠的体重及胰腺发育的影响 结果显示无论是出生后一周还是三周g l p 1 干预组大鼠的体重和胰腺的重 量均较对照组低( p o 0 5 ) ，这说明低蛋白饮食对胎儿的发育和胰腺的发育产生了 严重影响。陈璐f 2 5 】等对i u g r 新生大鼠生长发育情况观察发现，不仅其体重低 于正常组，且胰重和胰重体重比值也都明显低于正常组，提示营养不良状况，他 们对新生大鼠胰腺组织作了免疫组化，染色切片分析发现，i u g r 组胰腺组织中 胰岛的面积、数量及胰岛素染色所占阳性率均小于正常新生大鼠，说明i u g r 组 胰岛p 细胞群数目明显减少，与胰腺重量下降的变化一致。可见，妊娠晚期母体 1 9 5：舳加加m o 2a乳on，一uvz篮叠釉，lu 的宫内状况对子代胰腺组织的发育至关重要，这也印证了“节俭表现型”假说中 所提出的宫内“程序化”发育理论。v a h lt p 等实验也发现【2 6 】，g l p 1 的g 蛋白受体 被激活后，g 蛋白b 、y 亚基通过磷脂酰肌醇3 激酶( p 1 3 k ) 及其下游激酶一细 胞外信号调节激酶( e r k ) i 2 、p 3 8 丝裂原活化蛋白激酶( m a p k ) 的信号通路，诱 导b 细胞的增殖和分化。在g l p 1 促进p 细胞增殖的机制中p 1 3 k 可能起关键作 用。 本实验同时发现即使出生后使用g l p 1 进行注射干预，仍然无法使胰腺和 体重恢复至正常水平。尽管，在啮齿类动物和人类胰岛细胞的体外研究中发现，g l p 1 可以通过促进p 细胞生长和抑制p 细胞凋亡，可提升d 细胞质量。但是却无 法完全恢复胰腺的正常形态和大小。 s c a g l i al t 掩1 等研究表明胰岛在围生期发 育过程中会发生重构，胎儿期和生后早期是胰岛重构的关键时期，种属不同，胰 岛的重构及时间也不同，低蛋白饮食会影响胰腺的发育从而进一步影响胰腺功能 而导致糖尿病的发生。这也提示宫内环境，甚至生后早期环境，会对维持发育期 胰岛的正常形态乃至功能产生重要影响。 2 g l p 1 对i u g r 小鼠胰腺功能的影响 出生后7 天，i u g r l 0 0 组与i u g r 各组相比，p d x 1m r n a 表达和b c l 2 m r n a 表达均明显升高。而i u g r 2 0 组、i u g r 6 0 组和i u g r 组之间p d x 1m r n a 和b c l 2m r n a 的表达，却无明显统计学差异，这说明尽管注射g l p 1 胰腺的 重量并未发生变化，但是应用足够剂量的g l p 1 对胰岛功能却产生了影响，因 此，g l p 1 对出生后i u g r 小鼠的胰腺功能的恢复是有效的。适当的增大g l p 1 的剂量可以促进胰岛功能的恢复。 v a h lt p 等【2 6 1 研究也同样发现，g l p 1 可促使肥胖的高血糖大鼠出现胰岛的 生长，增强b 细胞的增殖。对胰岛细胞系大鼠胰岛细胞瘤来源的胰岛素分泌细胞 系，g l p 1 具有生长因子样作用，可以剂量依赖性地增加d n a 合成 2 7 1 。此外 f a r i l l a t l o 】等还发现g l p 1 降低了凋亡基因c a s p a s e 3m r n a 的转录水平及转录后 活性，同时上调了抗凋亡基因b c l 2 及b c l x l 的表达水平。可见g l p 1 能够刺激 p 细胞增殖和分化，而且还可抑制凋亡从而起到保护胰岛p 细胞的作用。 出生后2 1 天，i t 6 0 组和i t l 0 0 组与i t 0 组相比，p d x 1m r n a 的表达和 b c l 2m r n a 的表达均明显升高，而i u g r 2 0 组和i u g r 组之间p d x 1m r n a 和 b c l 2m r n a 的表达，却无明显统计学差异。i u g r 6 0 组与i u g r 组相比，p d x 1 m r n a 和b c l 2m r n a 的表达在生后1 周时无明显差异，而在生后3 周时明显 升高，这说明随着时间的延长，g l p 1 对出生后i u g r 小鼠的胰腺功能的恢复是 有效的。因此可见生后2 1 d 内这个胰岛重构的关键时期用足够剂量g l p 1 进行 干预，能够从一定程度上能够对i u g r 仔鼠的胰岛p 细胞功能有积极作用。同样 的f a r i l l 等【1 0 】利用z d f 大鼠模型，对实验鼠持续2 天注射人重组g l p 1 ( 3 0 p m o l k g 1 0 m i n 一1 ) 后发现，g l p - 1 处理组大鼠糖耐量改善，胰岛素分泌急性时 相部分恢复，胰岛细胞体积增大，增殖增加，这和本实验的结论是一致的。 但是我们也同样看到，尽管g l p 一1 对恢复胰岛功能有一定帮助，但是无论 是出生后7 天还是出生后2 1 天的i u g r 小鼠的p d x 1m r n a 和b c l 2m r n a 的表达，均显著低于对照组，这也说明，由于孕期低蛋白饮食能产生不可逆的新 生鼠胰岛细胞损伤，即使给予皮下注射g l p 1 及正常饮食，虽能增加其胰岛b 细胞增殖，和部分恢复胰腺功能但却并不能使胰岛功能恢复至完全。 本研究通过母鼠低蛋白饮食法成功建立了宫内发育迟缓仔鼠模型，并通过对 出生后小鼠给予g l p 1 以求恢复胰岛的功能。结论显示，适当增大g l p 1 的剂 量及注射的时间对胰岛功能的恢复是有帮助的。但是多大剂量是最佳剂量，需 要注射多长时间，这些都有待于进一步的实验去研究。 结论；口匕 对i u g r 幼鼠生后早期皮下注射g l p 1 ，并不能影响小鼠体重和胰腺的重量， 适当增大g l p 1 的剂量及注射的时间，对宫内发育迟缓幼鼠的胰岛d 细胞有保护 作用。 2 1 本研究创新性的自我评价 胰高血糖素样肽1 ( g l p 1 ) 是一种肠促胰岛素，新近的研究发现g l p 1 不 但能刺激p 细胞增殖和分化，而且还可抑制凋亡从而起到保护p 细胞的作用。大 量人类流行病学研究和动物实验证实宫内发育迟缓胎儿与成年期疾病密切相关， 现组织学和功能上已证实了宫内发育迟缓( i u g r ) 胎儿在出生时胰岛d 细胞数 量和功能受损，研究g l p 1 是否对i u g r 仔鼠胰岛p 细胞早期有保护作用，将为 从生命源头或生命早期进一步探讨预防措施提供了理论基础。目前国内尚未见有 关g l p 1 对i u g r 幼儿的胰岛d 细胞保护作用的研究，具有一定的创新性和特 色，对应用前景有促进作用。 参考文献 1b e l lt g l u c a g o n - l i k ep e p t i d e 1 ( g l p - 1 ) j 】n i p p o nr i n s h o ，2 0 0 0 ，6 2 ( 6 ) ：10 7 5 - 10 8 0 2f e h s ef c ，t r a u t m a n nm e ，h o i s tj j ，e ta 1 e f f e c t so fe x e n a t i d eo nf i r s ta n ds e c o n dp h a s ei n s u l i n s e c r e t i o ni nr e s p o n s et oi n t r a v e n o u sg l u c o s ei ns u b j e c t sw i t ht y p e2d i a b e t e s j d i a b e t e s c a r e ，2 0 0 4 ，5 3 ( 1 ) ：1 8 2 1 8 8 3l e s t e r l b ，l a n g e b e r gl k ，s c o rj d a n c h o r i n go fp r o t e i nk i n a s eaf a c i l i t a t e sh o r m o n e m e d i a t e di n s u l i ns e c r e t i o n j p r o cn a t la c a ds c iu s a ，2 0 0 7 ，9 4 ( 2 6 ) ：1 4 9 4 2 1 4 9 4 7 4h o l z g g e p a c ：an e wc a m p - b i n d i n gp r o t e i n i n s u p p o r t o fg l u c a g o n l i k e p e p t i d e - 1 r e c e p t o r - m e d i a t e ds i g n a lt r a n s d u c t i o ni nt h ep a n c r e a t i cb e t a - c e l l j d i a b e t e s ，2 0 0 4 ，5 3 ( 1 ) ：5 1 3 5l il x ，m a c d o n a l dp e , a h nd s ，e ta 1 r o l eo fp h o s p h a t i d y l i n o s i t o l3 - k i n a s e g a m m ai nt h e b e t a - c e l l ：i n t e r a c t i o n sw i t hg l u c a g o n - l i k ep e p t i d e - l 【j 】e n d o c r i n o l o g y ，2 0 0 6 ，1 4 7 ( 7 ) ：3 3 1 8 3 3 2 5 6g r o m a d aj , b o k v i s tk , d i n gw g ，e ta 1 g l u c a g o n - l i k ep e p t i d e 1 ( 7 3 6 ) a m i d es t i m u l a t e s e x o c y t o s i si nh u m a np a n c r e a t i cb e t a - c e l l sb yb o t hp r o x i m a la n dd