（内科学专业论文）抗smd1抗体在系统性红斑狼疮中的意义.pdf

目录 中文摘要1 英文摘要4 研究论文抗s m d l 抗体在系统性红斑狼疮中的意义 前言 “”一”一“8 月u 吾 一“”一”“”“芍 材料与方法9 结果 一”一1 3 附图1 7 附表1 8 讨 仑2 4 结论 2 8 参考文献 2 9 综述系统性红斑狼疮自身抗体检查进展3 1 致谢4 1 个人简历4 2 中文摘要 抗s m d l 抗体在系统性红斑狼疮中的意义 摘要 目的：系统性红斑狼疮( s y s t e m i c1 u p u se 叫t h e m a t o s u ss l e ) 是一种以 多种自身抗体伴多系统损害为特征的自身免疫性疾病。s l e 的临床表现复 杂，根据其临床表现难以进行诊断，所以必须借助自身抗体的检查。目前 系统性红斑狼疮的实验室检查主要有检测血清中的抗双链d n a ( d s d n a ) 抗体、抗s m 抗体、抗核小体抗体( a n u a ) 等，其中前2 项为s l e 的特异性指 标，但目前它们的检出率低。因此，寻找新的敏感性高、特异性强的系统 性红斑狼疮诊断标志物是自身免疫性疾病实验诊断领域所面临的挑战。抗 s m 抗体是由糖蛋白和核内小核糖核蛋白所组成的一组复合物，一直被认 为是s l e 的标志性抗体，是诊断s l e 的重要依据。但其致命性的缺点是在 系统性红斑狼疮中的阳性率仅3 0 左右，非常容易造成漏诊。已有研究表 明，s m 抗原是由u r n a 、b 、b 、n 、d 1 、d 2 、d 3 、e 、f 和g 等多种蛋 白质组成的，其中d 1 是主要的s m 抗原。以s m d l 多肽氨基酸序列( a a 8 3 1 1 9 ) 作为抗原，可极大地提高抗s m 抗体的检出率。本研究通过采用e l i s a 定量法检测4 8 例s l e 患者的抗s m d l 抗体水平，用欧蒙斑点法检测其抗s m 抗体及抗d s d n a 抗体，间接免疫荧光法分析检测其抗核抗体( a n a ) ， 同时用2 0 例其它结缔组织病患者及2 0 例正常健康人作对照，以评价抗 s m d l 抗体在诊断s l e 中的敏感性与特异性，及其与s l e 临床表现及活动 性的关系。 方法： 1 选取8 8 例实验对象，分为3 组：( 1 ) 系统性红斑狼疮组( a 组) ，为s l e 患者4 8 例。( 2 ) 其他结缔组织病组( b 组) ，为其他结缔组织病患者( 如 类风湿性关节炎、硬皮病、皮肌炎、干燥综合症等) 2 0 例。( 3 ) 健康对 照组( c 组) ，随机抽取健康志愿者2 0 例。 2 应用e l i s a 定量法检测三组的抗s m d l 抗体水平，用欧蒙斑点法检测其 抗s m 抗体及抗d s d n a 抗体，间接免疫荧光法分析检测其抗核抗体( a n a ) 。 同期记录患者的临床表现( 包括发热、新发皮疹、关节炎、脱发、口腔溃 疡、中枢神经系统损害) 、实验室检查( 包括血、尿、便三大常规，补体、 中文摘要 抗核抗体、抗双链d n a 抗体、抗s m 抗体、抗s m d l 抗体、心脏彩超、腹部 彩超、肺c t ) 、病情活动性积分等。 3 数据的统计学处理：本研究数据以均数士标准差表示，计量资料采用秩 和检验，计数资料采用卡方检验，变量间相关性采用s p e a m l a n 相关性分析。 取p 0 0 5 为有显著性差异。 结果： 1 抗s m d l 抗体、抗s m 抗体、抗d s d n a 抗体、抗a n a 抗体对于系统 性红斑狼疮诊断的敏感性分别为6 4 6 、1 8 7 、4 1 6 、9 5 8 ，特异性 分别为9 5 、1 0 0 、1 0 0 、7 5 。抗s i 山1 抗体的敏感性及特异性均较 高。 2 抗s m d l 抗体与抗d s d n a 抗体联合检测对于系统性红斑狼疮诊断的敏 感性为7 9 1 ，特异性为9 5 。 3 抗s m d l 抗体定量与系统性红斑狼疮的肾损害、发热、皮疹、胸膜炎有 显著关系。而与白细胞降低与否、血小板降低与否、抗核抗体是否阳性、 补体是否降低、有无口腔溃疡、中枢神经系统损害、血尿、脱发等无明显 关系。 4 抗s i 山l 抗体定量与系统性红斑狼疮病情活动积分呈正相关关系( p o 0 5 ) 。 结论： 1 抗s n d l 抗体有较高的敏感性和特异性，可作为诊断s l e 的参考指标。 2 抗s l n d l 抗体与抗d s d n a 抗体联合检测可以提高s l e 诊断敏感性。 3 抗s m d l 抗体定量与系统性红斑狼疮患者出现蛋白尿、新发皮疹、发热、 胸膜炎有显著相关性，而与白细胞降低与否、血小板降低与否、抗核抗体 是否阳性、补体是否降低、有无口腔溃疡、中枢神经系统损害、血尿、脱 发等无相关性。可以为进一步研究s l e 发病机制提供一定的依据。 中文摘要 4 抗s m d l 抗体定量与s l e d a i 呈正相关关系，抗s m d l 抗体对判断s l e 病 情活动有一定的参考价值。 5 抗d s d n a 抗体与s l e 病情活动有显著相关性，抗d s d n a 抗体对判断s l e 病情活动有明确的参考价值。 6 抗s m 抗体及抗核抗体与s l e 的病情活动无明显相关性。 诊断 关键词：系统性红斑狼疮；抗s m d l 抗体；敏感性；特异性；活动性； 一一叁查塑墨 s i g n i f i c a n c eo fa n t i - s m d la n t i b o d y i nd i a g n o s i s o fs y s t e m i cl u p u se r y t h e m a t o s u s a b s t r a c t o b i e c t i v e ：s y s t e m i c1 u p u se y t h e m a t o s u s i sat y p eo fa l j t 0 1 m m u n ed l s e a s e w i mm u l t i s y s t e m i ci m p a i m e n t s a n dm u l t i a u t o a n t i b o d i e s d u et 0 1 t s c o m p l i c a t e dc l i n i c a lm a l l i f e s t a t i o n s ，i t i sd i m c u l tt od i a g n o s em e r e l yb y d e p e n d i n gt h ec l i n i c a l m a n i f e s t a t i o n s 锄de x 锄i n a t i o no ta u t o 籼b o d y1 s n e e d e d u pt on o w ，t h el a b o r a t o r y e x a m i n a t i o n so fs l em a i n l y i n c l u d e 眦i d s d n aa n t i b o d y ，锄i s ma n t i b o d ya n da n t i - a n u a 锄t l b o d y e t c lh e f o r m e rt w oa r et h es p e c i 6 c i t ri n d e x e so fs l e ，h o w e v e r ，m ec u r r e n tr a t e so t s u c c e s s 向ld e t e c t i o nf o r 血o s et w oa r eb o t h1 0 w ：o n l yb e t w e e n5 t o3 o t h e r e f o r e ，i ti sac h a l l e n g ef o rm e f i e l do fl a b a t o 叫d i a g n o s l so 士r h e 硼a a t l s m t of i n dn e wd i a g n o s em a r k e r so fs l ew i t hh i 曲s e n s i t i v 时a n d s t r o n g s p e c i f i c i 谚t h ea n t i s ma n t i b o d yi sc o m p o u n d w h i c hi sc o n s t i 似t e db ya 铲o u p o fg l u c o p r o t e i n sa n ds m a l ln u c l e 2 u rm o n u c l e o p r o t e i n s ， a n dl tl s g e n e r a l l y r e c o g l l i z e da sa ni m p o r t a me v i d e n c et ot h ed i a g n o s i s o fs l ea n da 1 1i n d i c a t m g a m i b o d vo fs l e n e v e r m e l e s s ，a s e v e r ed e f i c i e n c yo ft h ea n t i s ma 1 1 t 1b o d y1 s t h a tt h em a s c u l i n er a t ei ns l ei so n l y3 0 印p r o x i m a t e l y s ot h a tl t1 s 印tt o r e s u l ti nw r o n gd i a g n o s i s a c c o r d i n gt ot h e 咖d yl i t e r 抛r e ，t h e a n t l 奄m a n t i b o d yi sc o m p o u n d e dw i t hm u l t i p r o t e i ni n c l u d i n gu - i 之n a ，b ，b ，n ，d 1 ， d 2 ，d 3 ，e ，fa n dge t c ，w h e r ed 1 i s t 1 1 em 勾0 ra n t i g e n i tc a n 伊e a t l yl i n p r o v e t 1 1 ed e t e c t i o nr a t eo fa n t i s ma n t i b o d yb ys u b s t i t u t i n g t h ew h o l e 锄1 。s m a n t i b o d vw i t hs md 1a m i n oa c i ds e q u e n c e ( a a 8 3 _ 1 19 ) a sm ea n t l g e n l nt h l s s t u d y ，4 8c a s e so fs l ep a t i e n t sw e r ec h o s e n2 u n 【d m e i rl e v e l so fa m i - s m d 1 a n t i b o d vw e r ed e t e c t e db yq u a n t i t a t i v ee l i s aa s s a y ，a n t i - d s d n a a n da n ! t i - s m a n t i b o d i e s w e r ed e t e c t e db y i n d i r e c ti n l m u n o n u o r e s c e n c e a sw e ua s a 矾眦c l e a ra n t i b o d y( a n a )b y i m m u n o n u o r e s c e n c ea n a l y s l s a tt h e m e a n t i m e ，c o m p 撕s o nw o r kw a sa l s o c o n d u c t e db e 眦e e nt h es e m mo 士2 u c a s e so fp a t i e n t sw i mo m e rc o r u l e c t i v et i s s u ed i s e a s e sa n da n d t h es e m mo 士2 0 英文摘要 c a s e so fh e a l t h yp e o p l e t h ep u 巾o s eo ft h i ss t u d yi st oe v a l u a t et h es e n s i t i v i t y a n ds p e c i f i c i t yo ft h ea n t i s m d1a m i b o d yi nt h ed i a g l l o s i so fs l ea sw e l la si t r e l a t i o n s h i p sw i t hc l i n i c a lm a n i f e s t a t i o n sa n dr e a c t i v e n e s s m e t h o d s ： l8 8s e r u ms 锄p l e sw e r ec h o s e na n dt h e yw e r ed i v i d e di n t ot h r e eg r o u p s ：( 1 ) s y s t e m i c1 u p u se r y t h e m a t o s u s 铲o u p ( g r o u pa ) ，i e 4 8c a s e so fs l ep a t i e n t s ； ( 2 ) o t h e rc o r u l e c t i v et i s s u ed i s e a s eg r o u p ( g r o u pb ) ，i e 2 0 c a s e so fo t h e r c o n n e c t i v et i s s u ed i s e a s e sp a t i e n t s ( s u c ha sr h e u m a t o i d 础i t i s ，s c l e r o d e m a ， d e r m a t o m y o s i t i sa n dd r y n e s ss y n d r o m ee t c ) ；( 3 ) h e a l t h yc o n t r o lg r o u p ( g r o u p c ) ，2 0s 锄p l e sb ys e l e c t i n gr a n d o m l y 行o mh e a l n l y v o l u n t e e r s 2i nt h i ss t u d y ，t h el e v e lo fa n t i - s m d1a n t i b o d yw e r ed e t e c t e db yq u a n t i t ：a t i v e e l i s aa s s a y ，a n t i - d s d n aa n da n t i s ma n t i b o d i e sw e r e ( 1 e t e c t e db yi n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n c e a sw e l la sa n t i n u c l e a r a n t i b o d y( a n a )b y i m m u n o f l u o r e s c e n c ea n a l y s i s d u r i n gt h i sp e r i o d ，t h ec l i n i c a lm a n i f e s t a t i o n s ( i n c l u d i n gf e v e r ，e m e 玛i n gr a s h ，a “h r i t i s ，h a i rl o s s ，m o u t hu l c e r s ，c e n 讹l n e o u ss y s t e md a m a g e )w e r er e c o r d e d ， a l s o ，t h el a b o r a t o 巧e x m i n a t i o n r e s u l t s ( i n c l u d i n gb l o o d ， u r i n e ， s t 0 0 1 e x 锄i n a t i o n ，a l e x i n e ， a n t i n u c l e a r a m i b o d y a n t i d s d n aa n t i b o d y ，a n t i - s ma n t i b o d y ，枷i - s m d 1 a n t i b o d y e c h o c a r d i o g r a p h y ， a b d o m i n a lu l t r a s o n o g r a p h y ，l u n gc t ) a n dt h ed i s e a s e a c t i v i 谚p o i n t sw e r e 证c l u d e d ，a n d s oo n 3s t a t i s t i c a la n a l y s i so fd a t a ：t h ed a t ap r e s e n t e da sx 士s t h em e a s u r e m e n t d a t aw e r ea n a l y z e dw i mr 砌( 一s u mt e s t t h ee n u m e r a t i o nd a ：t aw e r ea n a l y z e d w n c h i - s q u a r et e s t t h ec o r r e l a t i o nb e 似e e nv 撕a b l e sw e r ea n a l y z e dw i t l l s p e 锄n a nc o r r e l a t i o na n a l y s i s t a | d n gp o 0 5a sm er a n g eo fs i g n i f i c a n t d i 仔e r e n c e r e s u l t s ： 1n l es e n s i t i v i t i e so fa n t i s m d1a n t i b o d y ，a n t i s ma n t i b o d i e s ，础i d s d n a a n t i b o d y ， a n t i a n aa n t i b o d i e si nm e d i a g n o s i s o f s y s t e m i c1 u p u s e r y t h e m a t o s u sw e r e6 4 6 ，18 7 ，41 6 ，95 8 ，r e s p e c t i v e l y ；s p e c i 6 c i t i s e w e r e9 5 ，1 o o ，1o o ，7 5 b o t l lt 1 1 es e n s i t i v i t ) ，a n dt h es p e c i f i c i 够o f a n t i s m d1a n t i b o d i e sw e r eh i 曲 英文摘要 一 2t h es e n s i t i v 耐o fa n t i s m d1a n t i b o d ya n da n t i d s d n aa n t i b o d yj o i n t e d d e t e c t i o nf o rt h ed i a g n o s i so fs l ew a s7 9 1 a n dt h es p e c i f i c i 够w a s9 5 3t h ea n t i s m dl 觚t i b o d i e sh a ds i g n i f i c a n tr e l a t i o n s h i p sw i t h t 1 1 ek i d n e y d a m a g e ，f e v e r ，r a s h ，p l e u r i s y ，a n dd i d n th a v e o b v i o u sr e l a t i o n s h i p sw i t ht h e w h i t eb l o o dc e l l s ，p l a t e l e t s ，a n t i n u c l e a ra n t i b o d y ，a l e x i n e ，m o u 也u l c e r ，c e n t r a l n e r v o u ss y s t e md a m a g e ，h a e m a t u r i a ，b a l d n e s s 4t h es e m ml e v e lo fa n t i s h l d la 瓶b o d i e sa n ds y s t e m i cl u p u se r y t h e m a t o s u s d i s e a s ea c t i v i t yi n d e xw e r ep o s i t i v e l yc o r r e l a t e d ( p o 0 5 ) f ：o n c h l s i o n s ： la n t i s m d1a n t i b o d yh a sh i 曲s e n s i t i v i t y a n di tc a nb eu s e d2 l sar e f e r e n c ei n d i c a t o r a n ds p e c i f i c i t yo fd i a j 驴o s i so fs l e 2n l ec o m b i n e dd e t e c t i o no fa n t i d s d n aa n t i b o d i e sa n da n t i s m d 1a n t i b o 。 d i e sc a ni n c r e a s et h es e n s i t i v 埘o f s l ed i a g n o s i s 3t h ea n t i s m d1a n t i b o d i e sh a ds i 印i j f i c a n tr e l a t i o n s h i p sw 曲t h el ( i d n e y d 锄a g e ，f e v e r ，r 2 u s h ，p l e u r i s ya n d d i d n th a v eo b v i o u sr e l a t i o n s h i p sw i t hm e w h i t e b l o o dc e l l s ，p l a t e l e t s ，趾t i n u c l e a ra n t i b o d y ，a l e x i l l e ，m o u 也u l c e r ，c e n t r a l n e r v o u ss y s t e md 锄a g e ，h a e m 撕a ，b a l d n e s s t h er e s u h sc o u l dp r o v i d es o m e b a s i sf o r u r n l e r 咖d yo ft h ep a 山o g e n e s i so fs l e 4t h eq u a n t i 觚o no fa n t i s m d la n t i b o d yw a sp o s i t i v e l yc o r r e l a t e dw i t h s l e d a ia n di tc o u l dp r o v i dac e r t a mr e f e r e n c ev a l u ef o rt h ed e t 咖i n eo f a c t i v i 够 5t h eq u 锄t i t a t i o no fa n t i d s d n aa 以b o d yw a sp o s i t i v e l yc o r r e l a t e dw i m s l e d a ia n di tc o u l dp r o v i dac e r t a mr e f e r e n c ev a l u ef o rm ed e t e m l i n eo f 英文摘要 a c t i v i 姒 6t h e r ew e r en o s i g n i f i c a n tr e l a t i o n s h i p sb e t w e e na n t i s ma n t i b o d y o r a n t i n u c l e a ra n t i b o d ya n dt h ea c t i v i t yo fs l e k e yw o r d s ：s y s t e m i c1 u p u se r y t h e m a t o s u s ( s l e ) ；a n t i - s m d 1 a n t i b o d y ； s e n s i t i v i t ) ，；s p e c i f i c i t y ；a c t i v i t ) ，；d i a g n o s i s 7 研究论文 抗s m d l 抗体在系统性红斑狼疮中的意义 上- - j o 剐舌 系统性红斑狼疮( s y s t e m i cl u p u se r y t h e m a t o s u ss l e ) 是一种以多种 自身抗体伴多系统损害为特征的自身免疫性疾病【l 】。在系统性红斑狼疮的 发病过程中，有t 细胞参与及b 细胞的高度活化。患者的血清中可以出现 多种自身抗体，从而引起自身多器官、多组织的以血管炎为特征的弥漫性 损害。s l e 的临床表现复杂，根据其临床表现难以进行诊断，所以必须借 助自身抗体的检查。目前系统性红斑狼疮的实验室检查主要有检测血清中 的抗双链d n a ( d s d n a ) 抗体、抗s m 抗体、抗核小体抗体( a n u a ) 等，其 中前2 项为s l e 的特异性指标，但目前它们的检出率低。因此，寻找新 的敏感性高、特异性强的系统性红斑狼疮诊断标志物是自身免疫性疾病实 验诊断领域所面临的挑战。 抗s m 抗体是由糖蛋白和核内小核糖核蛋白所组成的一组复合物，一 直被认为是是s l e 的标志性抗体，诊断s l e 的重要依据。但其致命性的 缺点是在系统性红斑狼疮中的阳性率仅3 0 左右，极易造成漏诊。已有研 究表明，s m 抗原是由至少9 种成分组成的共同核心，即：s m b ( b 1 ，2 8 k d a ) 、 s m b ( b 2 ，2 9 l a ) 、s m n ( b 3 ，2 9 5 l a ) 、s m d l ( 1 2 k d a ) 、s n d 2 ( 1 6 5 l ( d a ) 、 s m d 3 ( 1 8 k d a ) 、s m e ( 1 2 l ( d a ) 、s n 正( 1 l l ( d a ) 和s m g ( 9 l ( d a ) ，其中以s m d 和s m b b 为主要靶位点，而s m d 中又以s m d l 为主。d 1 的羧基富含甘 精氨酸，可以被所有的s l e 患者血清中的抗s m 抗体识别，是十分重要 的靶抗原。s m d l 的抗原位点主要集中在第8 3 1 1 9 氨基酸上【2 1 。以s m d l 多肽氨基酸序列取代整个s m 分子作为抗原，可极大程度提高s m 抗体的 检出率。 目前，临床应用仍以检测抗s m 抗体为主，但由于其靶抗原为九种成 分的混合体，检出率较低。国际上有些专家建议采用抗s m d l 抗体检测取 代抗s m 抗体，但是目前缺乏大规模的临床应用资料支持。本研究通过采 用e l i s a 定量法检测4 8 例s l e 患者的抗s m d l 抗体水平，用欧蒙斑点法检 测其抗s m 抗体及抗d s d n a 抗体，间接免疫荧光法分析检测其抗核抗体 ( a n a ) ，同时用其它结缔组织病患者及正常健康人作对照，以评价抗 研究论文 s m d l 抗体在诊断s l e 中的敏感性与特异性，及其与s l e 临床表现及活动 性的关系。 材料与方法 1 病例选择 所有病例都来自2 0 lo 年1 月2 0 1o 年1 2 月河北医科大学第二医院 免疫风湿科门诊及住院患者。按照每组的入选标准分为以下三组。 1 1a 组( s l e 组) ： 随机抽取系统性红斑狼疮患者4 8 例，其中男性3 例，女性4 5 例，平 均年龄3 1 5 士1 1 9 岁。均符合1 9 9 7 年美国风湿病协会s l e 诊断修订标准。 1 2b 组( 其他结缔组织病组) ： 对照组为随机抽取同期诊治的非s l e 的其他结缔组织病患者( 如类风 湿性关节炎、硬皮病、皮肌炎、干燥综合症等) 2 0 例，其中男性2 例，女 性18 例，平均年龄3 5 士1 4 1 岁，其中皮肌炎4 例，原发性干燥综合症3 例，类风湿性关节炎8 例，硬皮病2 例，系统性血管炎3 例，均符合各自 的国际诊断标准。 1 3c 组( 健康对照组) ： 健康志愿者( 均无肝、肾病史及结缔组织病) 2 0 例，其中男性2 例，女 性18 例，平均年龄3 0 5 士9 1 岁。 2 临床分析指标 记录s l e 患者临床表现( 包括发热、新发皮疹、关节炎、脱发、口腔 溃疡、中枢神经系统损害) 、实验室检查( 包括血、尿、便三大常规，补 体、抗核抗体、抗双链d n a 抗体、抗s m 抗体、抗s i 山1 抗体、心脏彩超、 腹部彩超、肺c t ) 。采用s l e d 触( s y s t e m i cl u p u se r y t h e m a t o s u sd i s e a s e a c t i v i t ) ，i n d e x ) 积分，对s l e 疾病活动作总体评价，o 4 分基本无活动，5 9 分轻度活动，1 0 1 4 分中度活动，1 5 分重度活动。评分标准见t a b l e1 。 3 病例采集 所有病例均在实验前采集清晨空腹静脉血2 m l ，收集血清标本，保存 在7 0 冰箱中，至实验时一次解融后测定。 4 主要仪器及试剂 研究论文 4 1 抗s m d l 抗体检测试剂盒购自德国i m t e c 公司，抗核抗体检测试剂盒、 抗s m 抗体试剂盒及抗d s d n a 抗体检测试剂盒购自欧蒙医学实验诊断有限 公司。 4 2 芬兰l a b s y s t e m 加样枪 4 3 芬兰雷勃生产的m k 3 型酶联免疫检测仪 4 4 美国生产的8 x 1 2 全自动洗板机 4 5 天津仪器厂生产的6 0 0 型电热恒温水箱 4 6 日本m k o n 公司生产的e c l i p s e 4 0 0 型荧光显微镜 5 实验方法 5 1 抗s m 抗体检测 5 1 1 实验原理 试剂盒中载片上每个反应区内固定了实验膜条上平行包被了纯化的 s m 抗原。第一次温育时，已稀释的病人样本与膜条上的抗原反应。如果 样本阳性，特异性的i g g 抗体( 也包括i g a 和i g m 抗体) 将与相应的抗 原结合。为检测已结合的抗体，加入酶标抗人i g g 抗体( 酶结合物) 进行 第二次温育，然后加入色原底物液以产生颜色反应。 5 1 2 实验步骤 ( 1 ) 实验前将待测血清解冻，于室温融化并恢复至2 0 2 5 备用。 ( 2 ) 待测血清以样品稀释液稀释至1 ：1 0 1 。 ( 3 ) 加样：滴加5 0 u 1 己稀释血清至加样板反应区，避免产生气泡。 ( 4 ) 温育( 第一次) ：将载片盖在加样板的凹槽里，反应即开始。确保 每个样本均与载片上的膜条接触。在3 0 0 印m 旋转摇床上室温温育3 0 分 钟。 ( 5 ) 清洗：将清洗缓冲液盛于烧杯中，流水冲洗载片后放入小杯中浸洗 15 分钟。 ( 6 ) 加样：滴加5 0 u l 已稀释的酶结合物于加样板的每个反应区。 ( 7 ) 温育( 第二次) ：从浸洗液中取出载片，擦干背部及四周后置于加 样板凹槽里。在3 0 0 印m 旋转摇床上室温温育3 0 分钟。 ( 8 ) 清洗：将清洗缓冲液盛于烧杯中，流水冲洗载片后放入小杯中浸洗 15 分钟。 ( 9 ) 加样：滴加5 0 u l 底物液于加样板的每个反应区。 研究论文 ( 1 0 ) 温育( 第三次) ：从浸洗液中取出载片，擦干背部及四周后置于加 样板凹槽里。在3 0 0 印m 旋转摇床上室温温育3 0 分钟。 ( 1 1 ) 清洗：用去离子水或蒸馏水冲洗载片，风干1 5 分钟。 ( 1 2 ) 结果判读：观察反应区内抗原带着色的深浅。无色：阴性。着色非 常弱：临界阳性。着色中到较强：阳性。着色与质控带强度相同：强阳性。 5 2 抗s m d l 抗体检测 5 2 1 实验原理 将s m d l 多肽抗原固定于微滴定板上，其后与s m d l 抗体结合。通 过过氧化物酶标记抗体( 抗人i g g ) 可检测此结合抗体。加入底物后，产 生颜色反应，所形成的色带的深浅和检测的抗s m d l 抗体的浓度和或抗 原亲和力成正比。加入终止液后，颜色由蓝色变成黄色。在4 5 0 m 处测 o d 值，抗s m d l 抗体浓度与o d 值成正比，可通过绘制标准曲线求出标 本中s m d l 浓度。 5 2 2 实验步骤 ( 1 ) 实验前将待测血清解冻，于室温融化并恢复至2 0 2 5 备用。 ( 2 ) 待测血清以样品稀释液稀释至1 ：1 0 1 。 ( 3 ) 每孔加入1 0 0 u l 血清稀释液、标准品和质控血清，空白对照用样品 缓冲液，塑料盖板封住微孔板；室温下孵育1 小时。 ( 4 ) 每孔用2 5 0 u l 洗涤缓冲液冲洗3 次；去除洗涤缓冲液，在滤纸上叩 干。 ( 5 ) 每孔加入1 0 0 u 1 酶标液，塑料盖板封板；室温下孵育3 0 分钟。 ( 6 ) 每孔用2 5 0 u l 洗涤缓冲液冲洗3 次；去除洗涤缓冲液，在滤纸或布 上叩干； ( 7 ) 每孔加入1 0 0 u l 底物；室温下黑暗中孵育1 0 分钟。 ( 8 ) 每孔加入1 0 0 u l 的终止液。 ( 9 ) 停止反应后3 0 分钟内，4 5 0 m 测定结果。 ( 1 0 ) 以吸光度o d 值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标作标准曲线。由 标准曲线可直接查出血清的抗体浓度。 标本的浓度= 标准曲线上查出的浓度1 0 1 ( 稀释倍数) 5 3 抗d s d n a 抗体检测 5 3 1 实验原理 研究论文 试剂盒中载片上每个反应区内固定了实验膜条上平行包被了纯化的 d s d n a 抗原。第一次温育时，已稀释的病人样本与膜条上的抗原反应。 如果样本阳性，特异性的i g g 抗体( 也包括i g a 和i g m 抗体) 将与相应 的抗原结合。为检测己结合的抗体，加入酶标抗人i g g 抗体( 酶结合物) 进行第二次温育，然后加入色原底物液以产生颜色反应。 5 3 2 实验步骤 ( 1 ) 实验前将待测血清解冻，于室温融化并恢复至2 0 2 5 备用。 ( 2 ) 待测血清以样品稀释液稀释至1 ：1 0 1 。 ( 3 ) 加样：滴加5 0 u l 己稀释血清至加样板反应区，避免产生气泡。 ( 4 ) 温育( 第一次) ：将载片盖在加样板的凹槽里，反应即开始。确保 每个样本均与载片上的膜条接触。在3 0 0 印m 旋转摇床上室温温育3 0 分 钟。 ( 5 ) 清洗：将清洗缓冲液盛于烧杯中，流水冲洗载片后放入小杯中浸洗 15 分钟。 ( 6 ) 加样：滴加5 0 u l 己稀释的酶结合物于加样板的每个反应区。 ( 7 ) 温育( 第二次) ：从浸洗液中取出载片，擦干背部及四周后置于加 样板凹槽里。在3 0 0 印m 旋转摇床上室温温育3 0 分钟。 ( 8 ) 清洗：将清洗缓冲液盛于烧杯中，流水冲洗载片后放入小杯中浸洗 15 分钟。 ( 9 ) 加样：滴加5 0 u l 底物液于加样板的每个反应区。 ( 1 0 ) 温育( 第三次) ：从浸洗液中取出载片，擦干背部及四周后置于加 样板凹槽里。在3 0 0 印m 旋转摇床上室温温育3 0 分钟。 ( 1 1 ) 清洗：用去离子水或蒸馏水冲洗载片，风干1 5 分钟。 ( 1 2 ) 结果判读：观察反应区内抗原带着色的深浅。无色：阴性。着色非 常弱：临界阳性。着色中到较强：阳性。着色与质控带强度相同：强阳性。 5 4 抗核抗体检测 5 4 1 实验原理 稀释的血清与生物载片温育，如果样本是阳性的，特异性i g g 、i g a 和i g m 抗体与相应的核抗原结合。在第二次温育时，荧光素标记的抗人 抗体与结合在生物基质上的抗体反应，形成荧光显微镜下所观察到的特异 性荧光模式。 研究论文 5 4 2 实验步骤 ( 1 ) 实验前将待测血清解冻，于室温融化并恢复至2 0 2 5 备用。 ( 2 ) 待测血清以样品稀释液稀释至1 ：1 0 0 。 ( 3 ) 加样：将加样板放在泡沫板上，按照顺序分别滴加2 5 u 1 稀释后的血 清至加样板的每一个反应区，避免产生气泡。 ( 4 ) 温育：将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里，反 应立即开始。确保每一样品均与生物薄片接触。室温温育3 0 分钟。 ( 5 ) 冲洗：将清洗缓冲液盛于烧杯中，流水冲洗载片后放入小杯中浸洗 5 分钟。 ( 6 ) 加样：滴加2 0 u l f i t 标记的抗人球蛋白( 荧光二抗) 至洁净加样板 的反应区。 ( 7 ) 温育：从杯中取出载片，5 秒钟内用吸水纸擦去背面和边缘的水分 后，立即盖在加样板的凹槽里。室温温育3 0 分钟。 ( 8 ) 冲洗：将清洗缓冲液盛于烧杯中，流水冲洗载片后放入小杯中浸洗 5 分钟。 ( 9 ) 封片：将盖玻片直接放到泡沫板的凹槽里。滴加甘油至盖玻片。从 缓冲液中取出载片，用吸水纸擦去背面和边缘的水分，将载片覆有生物薄 片的一面朝下放在准备好的盖玻片上。调整固定好。 ( 1 0 ) 结果判读：显微镜下观察荧光模型及荧光强弱。 6 统计学处理 所有数据均由s p s s l 3 o 统计软件处理。研究数据以均数士标准差表 示，计量资料采用秩和检验，计数资料采用卡