（农业昆虫与害虫防治专业论文）Zwittermicin+A生物合成相关基因tzwM、tzwO的研究.pdf

摘要z w i t t e r m i d na 是由蜡状芽胞杆菌( b a c i l l u sc e r e l l f ，b c ) 和苏云金芽胞杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ，b t ) 产生的一种新型广谱的抗生素，是已知唯一的线性氨基多元醇类抗生素，该抗生素对多种真核微生物和原核微生物有抑制作用，而且该抗生素与b t 毒素共同使用能显著提高b t 杀虫活性。基于以上特点，使得z w i t t e r m i c i na生物合成基因簇的研究成为该研究领域的热点之一2 0 0 4 年，e m m c r t 等从b c 菌株u w 8 5 中克隆了1 6 k b 的z w i t t e r m i c i na 生物合成基因簇，其中包括，z w i t t e r m i c i na抗性基因( z m a r ) 在内的九个完整的开放阅读框( o r f s ，它们的顺序为d 叩、o , y 、z m a r 、o f f 2 、0 0 4 、o 庐d ，归) 和一个不完整的开放阅读框d 矽b t 菌株g 0 3 对鳞翅目害虫具有高毒力，高产z w i t t e r m i c i na ，有很高的抑菌活性。本研究室在已发表的z w i t t e r m i c i na 合成基因簇基础上，在g 0 3 中发现了完整的d j ，9 ( 本研究命名为t z w m ) ，同时还发现了5 个新的开放阅读框，3 个位于已发表序列的上游，命名为t z w a 、t z w b ，t z w c ，2 个位于已发表序列的下游，命名为t z w n 和t z w o 本研究对t z w m 和t z w o 序列进行测定并推测了其氨基酸序列，t z w m 长度为1 ，0 7 4b p ，编码的蛋白分子量为4 0 5k d a ，t z w m 与各种细菌的链烷磺酸盐单加氧酶有同源性；t z w o 长度为l ，0 7 7b p ，编码的蛋白分子量为4 2 0k d a ，t z w o 与f k b h ( f k b h 参与f k 5 2 0 抗生素合成所需的甲氧基丙二酸单酰基a c p 的合成) 有较高的同源性。本研究分别克隆了v z w m和t z w o 的全长基因，并在大肠杆菌b l 2 1 中进行了融合表达及纯化。通过等位基因交换的方法，构建了t z w m 基因突变盒m 和t z w o 基因突变盒o ，分别将其插入温度敏感的ec o l i b t 穿梭载体p r n 5 1 0 1 得到突变质粒p r n m 和p r n o 。导入产z w i t t e r m i c i na 的b t 菌株g 0 3 ，经高温突变分别获得t z w m 、t z w o 的突变株各3 株，将t z w m 的突变株命名：g 0 3 a t z w m - 1 0 1 ，g 0 3 a t z w m 1 4 0 和g 0 3 a t z w m - 2 6 2 ，将t z w o的突变体命名为：g 0 3 a t z w o - 8 9 ，g 0 3 a t z w o - 1 4 4 和g 0 3 a t z w o - 1 8 4 。运用s o u t h e r nb l o t t i n g 的方法，分别验证了突变体g 0 3 a 也, w m - 1 0 1 和g 0 3 a t z w o - i 8 4 的正确性；通过其对欧文氏杆菌的抑菌活性表明各突变株均丧失了抑菌活性；质谱分析未检测到z w i t t e r m i c i n a ；对突变体进行基因互补，又使其恢复了抑菌活性。表明t z w m , t z w o是z w i t t e r m i c i na 合成所必需的。这为z w i t t e r m i c i na 合成途径的解析提供了重要线索。关键词：b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ；z w i t t e r m i c i na 生物合成基因簇；基因敲除；突变体c h a r a c t e r i z a t i o no f t z w m a n d 拓幻g e n e si n v o l v e di nz w i t t e r m i e i nab i o s y n t h e s i sa u 恤o cj i a n m il i us u p e r v i s e p r o f g u o x u nl i , a s s o c i a t ep r o f f u p i n gs o n gm a j o f ：a g r i c u l t u r e e n t o m o l o g y a n d p e s t c o a n o la b s t r a c tz w i t t e r m i e i nai sal i n e a l a m i n o p o l y o la n t i b i o t i cp r o d u c e db yb a c i l l u sc e r e l l s ( b c ) a n db a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ( b ow i t hb r o a ds p e c t r u m s z w i t t e r m i e i nai n h i b i t sm a n ye u k a r y o t e sa n dp r o k a r y o t e s ，a n di n t e r a e t ss y n e r g i s t i c a l l yw i t hb tt o x i nt oe n h a n c et h ei n s e c t i e i d a la e t i v i t yo f b t s o ，t h es t u d yo f z w i t t e r m i e nab i o s y n t h e r i ee l u s t o rf so r eo f t h eh o t s t o p s i n2 0 0 4 ，e m m e r te ta lc l o n e dn i n ei n t e g r i t yo p e nr e a d i n gf l - a u l e s ( o r f s ，t h es e q u e n c ei sd 碉、o r f l 、z m a r 、o r f 2 、删：矽、o r f s o r y s ) ，i n c l u d i n gz w i t t e n n i e nas e l f - r e s i s t a n c eg e n e ( z m a r )a n dp a r t i a ld ，椤i nt h i si a b ，w ec l o n e dz w i t t e r m i c uab i o s y n t h e t i cc l u s t e r ( w h i c hw a s6 4k bi nl e n g t h ) f r o mb t h u r i n g i e n s i sg 0 3w i t hh i g ht o x i c i t yt ol e p i d o p t e r a ni n s e c tp e s t s s e q u e n c ea n a l y s i sr e v e a l e di n t e 班t yo d 9 ( c a l l e dt z w m ) a n df i v en e wo r f s ，n a m e l yt z w a ，t z w b 。t z w c , t z w n a n dt z w o s e q u e n c ea n a l y s i ss h o w e dt h a t ：t h el e n g t ho f t z w m w a s1 0 7 4b pa n de n c o d e da4 0 5l ( dp r o t e i nw i t hs i m i l a r i t yt om o n o o x y g e n a s ee n z y t n eo ft h ea l k a n e s u l f o n a t e ，t h el e n g t ho ft z w ow a s1 0 7 7b pa n de n c o d e da4 2 0k dp r o t e i n 谢t l ll l i g hs i m i l a r i t yt of k b h ( f k b hi si n v o l v e di nt h ef o r m a t i o no fm m a c p ，a r te x t e n d e ru n i tn e e d e df o rt h eb i o s y n t h e s i so ff k 5 2 0 ) t h et z w ma n dt z w o 鼯h e 8w e r l - ee l o n e di n t of u s i n g - e x p r e s s i o nv e c t o rp e t 一2 1 ba n do v e r e x p r e s s e di nec o l ia n dt h e nt h er e e o m b i n e dp r o t e i n s 、黼p u r i f i e dr e s p e c t i v e l y t ot e s tt h ef u n c t i o no f t z w m a n d z w d t h ea l i d e sc o n t a i n i n ga l li n f l a m ed e l e t i o nw e l 0c o n s t r u c t e da n dw e r ec l o n e di n t ot h et e m p e r a t u r e - s e n s i t i v es h u t t i ev e c t o rp r n 5 1 0 l _r e s p e c t i v e l y a l l e l i ee x c h a n g ew a sp e r f o r m e di ng 0 3 ，a n dt h r e em u t a n t so ft z w m ( n a m e l yg 0 3 t z w m - 1 0 l ig 0 3 a t z w m - 1 4 0a n da g 0 3 t z w m - 2 6 2 ) a n dt h r e em u t a n t so ft z w o( n a m e l yg 0 3 a z w o - 8 9 ，g 0 3 a t z w o - 1 4 4a n dg 0 3 a t z w o - 1 8 4 ) w e l eo b t a i n e ds e p a r a t e l y 1 1 1 ed e l i t i o n so ft h em u t a n t sg 0 3 t z w m - 1 0 1a n dg 0 3 t z w o - 1 8 4w e l ec o n f i r m e db ys o u t h e r nb l o t t i n g n 忙c u l t u r a ls u p e r n a t a n to fa l lm u t a n t sd i dn o ti n h i b i tt h eg r o w t ho fe r w i n 缸h e r b i c o l a f u r t h e r m o r e z w i t t e r m i c i nap r o d u c t sf r o mm u t a n t sc o u l dn o tb ed e t e c t e db yt h em a s ss p e c t r o g r a ma n a l y s i s t h e n , t z w ma n dt z w ow e r ei n t r o d u c e di n t ot h eg 0 3 t z w m - 1 0 1a n dg 0 3 t z w o - 1 8 4s e p a r a t e l y , b o i ht r a i l s f o r m a n i sr e s t o r e dt op r o d u c ez w i t t e r m i c i nar e s p e c t i v e l y t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt z w ma n dt z w ow e l 弓n e c e s s a r yf o rz w i t t e n n i e i nab i o s y n t h e s i s t 1 1 ei d e n t i f i c a t i o no ft h et w og e n e sf u l t h o p r o v i d e se l u e so f z w i t t r m i e i nab i o s y n t h e s i sp a s w a y k e y w o r d s ：b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ；z w i t t e r m i e i nab i o s y n t h e s i sd m t e r ；g e n ek n o c k - o u t ；m u t a n t独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果掘我所知除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑些壅些盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：翔；善舞签字只期：弦哆年月午只学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解塑韭壅些盘堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权塑些盔：些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩卸或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：匀建噻签字r 期：如叼年6j e j 牛同学位论文作者毕业后去向：工作单位：通汛地址：导师鹕霸习签字f i 期：2 7 年厂月仁日电话：邮编：z w i t t c r m i r d na 生物合成相关基因t a w m t z w o 的研究1 i 苏云金芽胞杆菌概述i 前言苏云金芽胞杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ，简称b t ) 在伯杰氏细菌鉴定手册) 第九版中归属于第二类第十八群，革兰氏阳性，芽胞杆菌属的一个种。苏云金芽胞杆菌在土壤、虫尸、储藏物、植被以及污水、尘埃等基质中i i ， q 均有广泛的分布。而土壤作为微生物的大本营，是苏云金芽胞杆菌分布最为丰富的生境，但是其在土壤中分布表现出一定的地域特性，且分布数量与土壤类型、p h 值、土壤腐殖质、植被及其他微生物种群与数量等有关苏云金芽胞杆菌的营养体为杆状，两端钝圆，大小为1 2 1 8 $ t m x 3 0 - - 5 0 岫，周生鞭毛或无鞭毛。它形成芽胞的过程中，在菌体内的一端或两端形成一个或多个形状一致或不同的伴胞晶体( p a r a s p o r a lc r y s t a l ) 胞子囊在后期破裂，释放出芽胞和伴胞晶体。芽胞大小为0 8 - 0 9 1 u n x 2 1 u n ，卵圆形。有光泽有很强的抗逆性；伴胞晶体形状多样，有棱形、长菱形、短菱形、立方形、球形、椭球形、无定形及三围l 苏云金芽胞杆菌中的芽胞和晶体角形唧和镶嵌形【这种伴胞晶体的主要成分是f i 当1 t h e c r y s t a i ds p o r e i n 8 a c i l h t h u n n g i e n a i s具有杀虫活性的蛋白质，故又称为杀虫晶体蛋白( i c p s ) 或乒内毒素( 扛e n d o t o x i n ) ( 图1 ) 。该杀虫晶体蛋白由c r y 基因和c y t 基因编码，现在已经发现苏云金芽胞杆菌大多数菌株都能产生多种类型的晶体蛋白，对鳞翅目( i e p i d o p t e r a ) 、双翅目( d i p t e r a ) 、鞘翅目( c o l e o p t e r a ) 、膜翅目( h 煳t e r a ) 、同翅目( h o m o p t c r a ) 、直翅目( o r t h o p t e r a ) 、食毛目( m a l l o p h a g a ) 等多种昆虫，以及线虫、螨类和原生动物等具有特异性的杀虫活性“q 据估计，已分离的b t 菌株超过了5 万株，b i 的杀虫范围已经扩大到包括大量农林及卫生害虫在内的无脊椎的4 个门和节肢动物门中9 个目的生物【1 9 l 。b i 对人畜无害，不污染环境，因而b t 在害虫的生物防治中得到了最广泛的应用，成为目前应用最广泛的微生物杀虫剂自1 9 8 1 年s c h n e p f 和w h i t e l e y 从苏云金芽胞杆菌克隆了第一个编码6 - 内毒素的c r y 基因c r y l a a l 以来，目前已克隆到的杀虫晶体蛋白基因已经超过4 0 0 个( h t t p ：w w w b i o l s s u s x a c u k h o m e n e i lc r i c k m o r e j b t t o x i n s 2 h l m l ) 。他们分属于1 5 4 种模式基因。我国至今已克隆了6 7 种b t c r y 基因i c p s 的杀虫作用机理：当敏感昆虫摄食伴胞晶体后伴胞晶体进入中肠，经过溶解和激活作用，释放出毒索核心片段，然后作用于中肠上皮细胞，引起该细胞膨胀和裂解，最后导致昆虫肠道麻痹、肠道穿孔或停止进食，直至虫体死亡。b t 很早就用来做为生物杀虫剂转苏云金芽胞杆菌c r y 基因抗鳞翅目及鞘翅目害虫的转基因研究已经取得了很大进展【2 “2 1 ，4 2 3 卅。目前，b t5 内河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文毒素的应用主要集中在三个方面：一是直接工业化生产：二是构建工程菌，进而转化生产；三是培育转基因抗虫植物凹- 觚飘趣拽蚓随着对b t 研究的不断深入，发现了许多与杀虫相关的其它有效成分，如辅助蛋白( h e l p e rp r o t e i m ) p 1 9 、p 2 0 、p 2 1 1 3 1 - 强韧，营养期杀虫蛋白( v e g e t a t i v ei n s e c t i c i d a lp r o t e i n s , p 薯) m 3 5 , 抵3 1 和增效物质z , m i t t e m d c i na 弧州，这些成分中有韵本身有杀虫活性，掘1 9 9 6 年e s t r a c h 等在斑发酵上清液中发现在营养期分泌的一类新型杀虫蛋白即营养期杀虫蛋白，对鳞翅目和鞘翅目害虫具有较广谱的杀虫涯性。有的成分本身并没有杀虫话性，但可以增强杀虫晶体蛋白的表达或提高其毒性特别是z w i t m t a i c i na 。与b t 毒素共同使用能显著提高苏云金芽胞杆菌的杀虫活性m4 1 a z w i t t e r m i c i na 是一种新型抗生素眦h 瓴峨切，由蜡状芽胞杆菌( b a c i l l u sc e r e u s ) 和礅产生该抗生素可抑制多种真核微生物和原核微生物，其中包括多种植物病原菌呻例，而且与b t 毒素共同使用能显著提高b c 的杀虫活性m “1 。可作为增效因子来提高b t 的防效从而减少毒素的使用量，延缓抗性的产生，拓宽杀虫谱，使m 这一著名的生防菌在可持续农业中发挥更大的作用。国外z w i t t e r m i e i a a 的研究已有十几年的历史，在很多方面都取得了很好的进展1 2z w i t t e r m i c i na 的研究进展1 2 iz w i l t e r m i e i na 的发现、结构及活性1 9 9 0 年h a n d e l s m a n 从营蓿根际分离刭一株对苜蓿猝饿病( 该病由苜蓿疫霉p h y t o p h t h o r am e d i c a g i n i s 引起) 防效很高的蜡状芽胞杆菌菌株，命名为u w 8 5 划当u w 8 5 芽胞大量形成时，培养渡和培养渡滤液不仅可以防治苜蓿猝倒病，还可以抑制苜蓿疫霉的生长m5 1 1 s i l o - s t t h 从u w 8 5 培养滤液中纯化出两种抗生素，其中一种抗生素为3 9 6 d a 的线性氨基多元醇，有一个富含氮的末端，羟基交错捧列在碳主链两侧( 图2 ) ，p h7 o 时是阳离子，是已知唯一的氨基多元醇类抗生素，与肽类和聚酮化合物类抗生素有相似的结构特征命名为z w i t t e r m i e i na 岬j 。z w i t 船 m i e na 的累积水平与其抑制病害的程度有相关性，纯品z w i t t e r m i e na 延缓苜蓿疫霉胞囊萌发出的芽管的伸长，而且将z w i t u m n i e i na 和无抻菌活性的u w 8 5 突变体培养液共同孵育可以抑制苜蓿猝倒病。z w i t t c r m i e i na 对卵菌及其亲缘菌、海藻原生生物等有很高的活性，对各种革兰氏阴性细菌及一些萃兰氏阳性细菌有中等话性，冠时对根多植物病原真蔼有活性州刈而且当z w i t t c r r m d aa 与另一种抗生素k a a o s a m i n e 共同作用于大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 和苜蓿疫霉时表现出增效活性州1 z w i t t e r m i d na 与b t 内毒素协同增效能显著提高b t 杀虫活性m “，国内已有厂家将z w i t t e r m i d na 提取物加入发酵产品，显著减少了b c 制剂的使用量并提高了田问防治效果以上研究成果充分说明蜡状芽胞杆菌u w 8 5 在培养过程中生成z w i m a m i c i na 并分泌到细胞外z w i t t c r m i e i na 有广泛的抑菌活性而且对b t 内毒素有协同增效活性。1 2 2 影响z w i t t e f m i c i n a 积累的因素及z w i t t e m f i e i n a 的纯化蜡状芽胞杆菌u w 8 5 在芽胞形成但还未释放时培养液中z w i t t e r m i d na 浓度为最大浓度的二分之一继续培养至芽胞大量形成时z w i t t e n n i c i na 的浓度达到最高，此时的培养液的防病活2z w i t t e r m i e i na 生物合成相关基因z w m 、t z w o 的研究性也最高1 4 0 , “i 这为z w i t t e r m i e i na 的提取和纯化提供了理论依据但同时也提出一个问题，z w i t t e r m i e i na 的形成对芽胞的形成有依赖关系，还是一种巧合?无机离子和氨基酸对培养过程中z w i t t e r m i e i na 的累积量也有影响。当t s b ( 胰胨豆胨培养液) 中加入大于等于5 0 m m 的磷酸盐时，降低z w i t t e r m i e i na 的累积量及培养液的防病活性；0 2 5 1 0 m m 的铁离子则提高z w i t t e r m i e i na 的累积量及培养液的防病活性；微量元素锰、硼、铜、钼、锌对其无影响。u w 8 5 在化学成分确定的极限培养基m e s 中不能生长，当培养基中加入缬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、丙氨酸、亮氨酸和天冬氨酸后u w 8 5 可以生长，但不能生成z w i t t e r m i e i na ，当培养基中继续加入谷氨酸、精氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸，可以检测到z w i t t e r m i e i na i 蛔，表明这五种氨基酸或其中的几种氨基酸与z w i t t e r m i e i na 的生成或分泌有关以上研究结果为z w i t t e r m i e i na 大量制备和纯化提供了理论依据，也为研究z w i t t e t m i e i na 的合成与调控提供了重要线索蜡状芽胞杆菌u w 8 5 在二分之一的胰胨豆胨培养液中培养至芽胞大量形成时，离心取上清，并用h c l 将其调至p h 7 0 ( z w i t t e r m i e i na 以阳离子形式存在) ，将样品上羧甲基交联葡萄糖阳离子交换柱，将活性部分进行蒸干，重新悬浮后进行高压纸电泳，收集到的活性部分之一为z w i t t e r m i e i na i 卅，通过h p i , c 亦可纯化z w i o e t m i e i na i 1 2 3z w i t t e r m i e i na 的抑菌机制目前尚未发现z w i t t e r m i e i n a 作用的靶位点，但有些初步进展。当大肠杆菌( 对z w i t t e r m i e i na 敏感) 的h e m a 、h e m b 、h e m l 、u b i 、c y d a b 和a q j 基因( 与产生质子动力相关) 被破坏，造成其在产生质子动力( p r o t o n m o t i v e f o r c e p m f ) 方面的缺陷，影响了膜电位，影响了z w i t t e r m i e i na 的吸收，从而表现抗性。另外大肠杆菌编码r n a 聚合酶两个亚基的基因r p o b , r p o c 遭到破坏时，对z w i t t e r m i e i na 表现抗性，z w i t t e r m i e i na 可能抑制d n a 的复制、转录、d n a 旋转酶和d n a 拓扑异构酶i 的活性，但研究中未发现进一步的证据支持是z w i t t e r m i e i na 作用的靶位点【，2 1 1 2 4z w i t t e r m i e i na 抗性基因的克隆及抗性机理的研究产抗生素的生物都含有有效的防御机制以保护自身免受有毒代谢产物的毒害。产抗生素的细菌若含有对自身所产抗生素敏感的靶位点，必须有一个抗性基因以保护自身免受有毒代谢产物的毒害对z w i t t e r m i e i na 的抗性机理进行研究，不仅有助于了解z w i t m m a i e i na 的作用方式。而且有助于问接分离z w i t t e r m i e i na 合成所需的基因为确定z w i t t e r m i e i na 的抗性决定簇，m i l n e r 窜构建了蜡状芽胞杆菌株u w 8 5 ( 产生_ z w i t t e r m i e i na ) 的基因组文库，筛选大肠杆菌株d h 5 a ( 对z w i t m m i e i na 敏感) 的抗性转化子，经亚克隆和诱变定义了一个基因命名为n 3 i ，该基因位于决定z w i t t e r m i e i na 抗性的1 2 k b 的d n a 片段上。携带z m a r 基因的片段可与蜡状芽胞杆菌株u w 8 5 的相应片段杂交，而在蜡状芽胞杆菌株u w 8 5的敏感性突变体中不能发现与之杂交的相应片段。并且携带z m a r 基因的质粒可使lr w 8 5 的敏感性突变体回复其对z w i a e t m i e i na 的抗性。对1 2 k b 的d n a 片段进行测序和分析定义了一个开放阅读3河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文框，命名为z m a r 其核苷酸序列和预测蛋白氨基酸序列与数据库中已有的信息均无相似性携带积，基因的大肠杆菌株的细胞提取物中 4 3 5 k d a 蛋白。其分子量和氮末端氨基酸序列都与由口懈r 序列预测的蛋白相符合结果表碉z m a r 基因编码z w i t t e r m i c i n ea 抗性决定物，而且该基因在蜡状芽胞杆菌和大肠杆菌都有功能s t o h l ( s t o me t a l ，1 9 9 9 ) 等对7 _ m a r 的功能进行了研究，研究结果表明携带m 积基因的大肠杆菌的细胞提取物通过共价修饰使z w i t t 日m i c i na 失活，对失活的z 诎e r m i c i na 进行化学分析结果表明，失话的z w i 岫i c i n a 被乙酰化( 图3 ) z m a r 蛋白可使z w i t t e n n i c i n a 失活，并进一步证明掀催化撕啪i d na 的乙酰化，乙酰辅酶a 作为乙酰基供体，础可能构成一类新的乙酰基转移酶”c u n d l i f f 攫到的抗性机理包括三种类型【卅，第一类。通过化学修饰使抗生紊失活既甄明第二类使抗生素游离靶位点附近，或在细胞内将抗生素螯合d & ”第三类，对靶位点进行修饰，或以不敏感型的靶位点取代敏感型的靶位点骶蛾6 t , 6 2 1 。z m a r 钝化机制属于删i 廊提到的三种类型抗性机理中的一种：通过化学修饰使抗生素失活眦纸5 6 , 5 z l ，从而使产生z w i t t e t m i c i n e a 的生物对z w i o t e m l i c i n e a 表现出抗性，起到保护自身的作用抗性基因的获得还为间接分析z w i t t e m i c i n ea 合成所需的基因奠定了基础“ 麟挣n 鼻嘴燃1 4 秘“孤雌帅岫 岫嘶柚鲥删哪鼬洲|田2z w i n o m i c i na 的化学结构f i g 2 s t r u c t u r o d , f z w i t t e r m i c i n 1 2 5 产z w i t t e r m i c i na 菌株的筛选围3 钝化后z w i n 哪i i i c i n a 的化学结构f i g 3s m j c ：t u r e o f i n a c t i v e t e dz w i t t e n n i c i n 以往主要采用p c r 扩增：m l a r 基因与测定抑菌活性相结合的方法进行产z w i t t e r m i c i na 菌株的筛选1 4 口大量研究结果证明抗生素抗性基因往往与抗生素合成、分泌和调节的基因成簇存在唧i 因此，抗生索抗性基因的研究将为深入开展抗生索作用方式和抗生素合成基因簇的研究提供线索和奠定基础。邵铁梅等对产生z w i t t e n n i c i na 的b t 菌株的筛选体系作了改进，即：将上清液9 5 水浴1 5m i l l 后再进行抑菌活性测定，其目的是使热敏感的抑菌活性成分失活，以便于准确检测菌株z w i t t e r m i c i na 的抑菌活性，这样可筛选到真正高产z w i t t e r m i c i na 的菌株在此基础上筛选获得了一批高产z w i t t e n n i c i na 的b t 菌株；对其中高产z w i t t e n n i c i na 的g 0 3 菌株进行了c i y 基因型鉴定从中分离克隆了z 哪r 全长基因并进行了表达和活性研究，为进一步开发高毒力的b t 菌株和开展z w i v e n n i c i na 合成基因簇的研究创造了条件”j 1 2 6z w i t t a m i c i n a 生物合成基因簇的研究4m i l n e r 等从产z w i u e n n i c i na 的蜡状芽胞杆菌菌株u w 8 5 中分离到抗z w i t t e r m i c i na 的基因z w u e r m i c i aa 生物合成相关基因t z w m 血帕的研究z n u z r ，并对其进行了测序，进而证明当菌株u w 8 5 在z m a r 所在区域发生大片段缺失时不再产生z w i t t e r m i c i na 唧而且r a f f d 等报道由土壤分离得到的蜡状芽胞杆菌菌株中z w i t t e r m i c i na 的生成和口枷基因的出现有高度的相关性 4 7 1 c u o d i f f e 报道产生抗生素的生物要求自身有抵抗抗生素的基因以保护自身免受有毒代谢物的毒害而且抗性基因通常与抗生素的合成基因成簇存在驯。基于以上原因s t o h l 等猜测合成z w i t t e r m i c i na 所需的基因有可能与z m a r 基因紧紧相连为了确定z m a r 基因是否与z w i t t e n n i c i na 合成基因簇相连，s t o h l 等对z m a r 基因的侧翼进行了测序并对其进行了功能分析闭序列分析的结果表明在z m a r 基因的周围有3 个与之有相同转录方向的开放阅读框：o , 7 0 0 2 ，d d 3 ，3 个开放阅读框都有假设的核糖体结合位点，缺少启动子序列，而且起始密码子与终止密码子的重叠，预示3 个开放阅读框和z m a r 基因组成操纵子用b l a s ta l g o r i t h m ( 舢b c h l i ie t a 1 9 9 0 ) 分析3 个开放阅读框编码的氨基酸序列，结果表明o r f i编码一个4 2 1 k d a 蛋白，等电点p h6 7 ，与乙酰辅酶a 脱氢酶有高度的同源性。o r f 2 编码一个4 5 6 k d a 蛋白，等电点p h5 3 ，与聚酮化合物合酶和脂肪酸合酶有同源性，尤其是与聚酮化合物合酶的酰基转移酶部分和脂肪酸合酶的酰基转移酶部分同源性更高，同源部分包括酰基转移酶的活性位点s t o h l 等进一步用插入失活的方法研究了o , 2 和z m a r 的功能研究结果表明z m a r 是菌株对z w i 廿e r m i c i n a 抗性所必须的，o a 2 是合成z w i t t u i c i n a 所必须的2 0 0 4 年e m m e r t 等通过构建突变体库与b a c 文库相结合的技术来研究与z w i t t e r m i c i na 合成有关的基因i 捌，在s t o h l 发表的3 g k b 的合成基因的下游又发现了1 2 k b ，其中包括5 个完整的开放阅读框0 , - 7 4 ，n 咖d 咖n 矿o 碉，和一个不完整的开放阅读框d j 尹，而且这些开放阅读框与z m r 基因和已知的开放阅读框具有相同的转录方向，相邻的开放阅读框之间有重叠现象，缺少启动子序列，而且部分相邻开放阅读框的起始密码子与终止密码子的重叠( 图4 ) ，预示着9个开放阅读框和z m a r 基因可能组成操纵子，翻译偶联哪删，其中z m a r 基因是菌株对z w i t t e r m i c i na 表现抗性所必须的，0 , 2 是合成z w i a c r m i c i na 所必需的”q l_o 巾。毋z m a r0 , 20 , 4o 币。啪。币。毋009图4 蜡状芽胞杆菌u w 8 5 中z w i r e n n i c i na 合成基因簇的基因组成f i g 4b i o s y n t h e t i c g e n e d u s t e r i d e n t i f i e d o f z w i t t e r m i c i n a f r o m 且u w 8 5这些基因编码的蛋白都与聚酮类抗生素、非核糖体肽类抗生索合成有关的蛋白质有很高的同源性，其中最大的基因o , 8 可能编码聚酮类抗生素合酶和非核糖体肽类抗生素合酶的杂合体，预示撕删c i na 可能由非核糖体肽合成酶和聚酮化合物合成酶杂合通路合成e n m c l t 推测z u d m m m c i na 有五种假定的前体：l 丝氮酸、丙二酰基如a 、氨基丙二酰基- a c p 、羟基丙二酰基- a c p 、2 , 3 二氨基丙酸根( 图5 ) 其中o , - ) 4 ，o , 5 0 , 6 、o q 7 参与z 咖e r m i e i na 假定的前体之一氨基丙二酸单酰基载体蛋白假设途径( 图6a ) ，o r f l ，o f f 2 ，o , 3 是羟基丙二酸单酰基载体蛋白合成途径的部分( 图6 b ) 一旦所有的前体均已合成时，聊参与z w r r m i c n a 的最后组合：n r p s i 激活并使丝氨酸连到肽基载体蛋白结构域上p k s l 将丙二酸单酰基辅酶a 的丙二酰基部分转移至它的酰基载体蛋白结构域上，接着使共价结合的丙二酰基部分与上游的丝氨酸聚合，p k s l 的酮还原酶结构域可将丝氨酸的羧基还原，生成p k s l 上的中间体随后的聚合和还原氨基丙二酰基和羟基丙二酰基部分以类似的方式催化产生p k s 3 上的中间体。聚合成酶的最5河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文后，n r p s 2 可能激活、连接、聚合2 ，3 二氮基丙酸盐和与p k s 3 相连的中间体在n r s 2 上形成5个残基的中间体，然后再进行z w i t t e r m m n a 碳骨架的释放和随后的修饰( 图7 ) 嗍7 ：i ! 毒车章o 。k 占占。”? 0 盏a 上薯b 嚣：围5z w i t t e n n i c i n 尢的化学结构及假定前体f i g 5 0 a e m i a d 髓咖r e o f z “n a t i - i c i n a i l i d t h eq 删p , n 目w a e r sf o ri t sb i o s y n t h e s i s 田6 氨基丙二酸单醮基载体蛋白和轻基两二酸单酰基载体蛋白的合成f i 9 6 s d a c n m i t i cr e p t e s e n t a t i o m o f m e t h o x y m a l o r , y l a c p dm n i n o m a l o n y l a c ps c h e m a t i cr e p r a m e a t l a t i o n so f a m i m , n u d o u y l a c pb ：s d m m t k ：r e p r e s e n t a t i o n so f m 甜i 嗍仰a i 删y i a c p田7z w i t t e r m i c i na 的组装机爿f i g 7t h ep u t a t i v em e c h a n i s mf o rz w i t t e r m i c i naa s s e m b l yi 型聚乙烯合酶的组成型生物合成方法是一种形成含聚乙烯结构衍生物的有效方法。这种方法通过改变添加单位的组成来改变衍生物的结构和活性。i 型聚乙烯合酶仅有的四个添加单位为：丙二酰乙酰辅酶a 。甲基丙二酰乙酰辅酶a 。乙烷基丙二酰乙酰辅酶a 。和甲氧基丙二酰基转运蛋白( m m a c p ) 。2 0 0 6 年9 月，y o l a n d e ac h a r t 等验证了氨基丙二酰基转运蛋白( a m - a c p )和羟基丙二酰基转运蛋白( h m - a c p ) 是i 型聚乙烯合酶的另外两个添加单位1 6 , 1 。h m - a c p 和a m - a c p 是z w i t t e r m i c i na 生物合成相关的两个前体，它们分别与乙二醇和乙醇胺单位合成相关y o l a n d ea c h a r t 等通过生物化学和质谱的方法验证了h m - a c p 和a m - a c p 的形成过程，间接地为探索z w i t t e r m i c i na 生物合成途径奠定了基础。基于对f k 5 2 0 生物合成基因簇和其它相关抗生素生物合成基因簇的生物信息学分析，预言m m - a c p 的形成需要五个蛋白被提议的m m - a c p 的合成路径( 图8 ) 为：1 ) 糖酵解途径的中间物可能在r 【b h 作用下在_ a c p 和f k b j 的共同参与下，转化i 型聚乙烯合酶的组成型生物合成方法是一种形成含聚乙烯结构衍生物的有效方法。这种方法通过改变添加单位的组成来改变衍生物的结构和活性。i 型聚乙烯合酶仅有的四个添加单位为：丙二酰乙酰辅酶a ，甲基丙二酰乙酰辅酶a ，乙烷基丙二酰乙酰辅酶= a 和甲氧基丙二酰基转运蛋白( m m - a c p ) 。2 0 0 6 年9 月，y o l m 3 d e 丸c h a r t 等验证了氨基丙二酰基装运蛋白( a m - a c p ) 和羟6z w i t t e r m ic i ：na 生物合成相关基因r z w m 、t z w o 的研究基丙二酰基转运蛋白( h m - a c p ) 是i 型聚乙烯合酶的另外两个添加单位 6 4 1 。h m o a c p 和a m - a c p是z 耐仕e m 血i na 生物合成相关的两个前体，它们分别与乙二醇和乙醇胺单位合成相关。y o l a n d e 丸o i a n 等通过生物化学和质谱的方法验证了h m - a c p 和a m - a c p 的形成过程，问接地为探索z w i t t e n n i c i na 生物合成途径奠定了基础。基于对f k 5 2 0 生物合成基因簇和其它相关抗生素生物合成基因簇的生物信息学分析，预言m m - a c p 的形成需要五个蛋白被提议的m m - a c p 的合成路径( 图8 ) 为：1 ) 糖酵解途径的中间物可能在f k b h 作用下，在a c p 和f k b j 的共同参与下，转化成甘油- a c p 中间物；2 ) 甘油- a c p 在3 羟基丁酰基辅酶a 脱氢酶( f k b k ) 的作用下，形成2 - h y d r o x y - 3 - o x o p r o p i o n y l - a c p ( o r 2 ，3 ，3 - u h y d f o x y p r o p i