（作物遗传育种专业论文）水稻花期突变体的筛选与分析.pdf

摘要 生育期是决定水稻品种地区及季节适应性的重要性状，生育期的遗传研究与指导 育种实践、品种改良及品种推广密切相关。缩短水稻生育期，对提高水稻产量和改良 水稻品质具有十分重要的意义。突变体是进行基因功能研究的良好材料，近年来大规 模t - d n a 标签库的创建产生了大量的突变体，包括早熟和迟熟突变体，利用突变体 克隆控制水稻花期的基因是可行的。同时，水稻作为短同照模式植物，将与长日照模 式植物拟南芥一起，在最终揭开植物成花机理的研究中发挥不可替代的作用。 本研究从独立的t - d n a 插入标签系群体中( 包括激活标签系和增强子捕获标签 系) 筛选出花期突变体，并对突变体插入位点侧翼序列进行扩增与分析，完善了一套 利用标签突变体克隆基因的方法。获得主要结果如下： 1 对近5 万份t - d n a 插入标签系进行了田间调查和筛选，结果获得有明显表型的花 期突变体约3 5 0 份。其中筛选到早熟突变体2 3 7 份，晚热突变体1 2 6 份。增强子 捕获系突变频率比激活标签系高0 1 。大多数早熟突变体与对照日本晴相比至 少提早抽穗一个月，少数突变体花期提早近2 个月。有4 株抽穗期延迟一个月仍 不能抽穗。 2 采用p c r w a l k i n g 方法分离扩增插入位点的侧翼序列，并对它进行了一些改进。 实验证明，d r a i 酶切扩增效率要高于s s p i ，用两种酶d r a l 和s s p l 酶切可以获得 更多侧翼序列；第二轮p c r 反应体系体积由2 0 9 l 变成4 0 0 , l ，药品用量相应加倍， 扩增效率不会下降。从3 5 0 个样品中扩增出2 7 8 条t - d n a 侧翼序列和2 8 9 条t o s l 7 插入侧翼序列，t - d n a 和砀s 1 7 侧翼序列扩增效率约8 0 ；测序总共得4 9 9 条成 功序列，其中t - d n a 有2 4 4 条，t o m 7 有2 5 5 条，t - d n a 和t o s l 7 侧翼序列成功 测序效率达8 8 。 3 对t - d n a 和7 撕1 7 插入的位置进行了初步分析，表明t o m 7 倾向插入基因内，而 t - d n a 插入基因内与基因间没有偏好性。t _ d n a 标签系两个载体比较分析表明： 增强子捕获系扩增条带效率大于激活标签系，但是扩增得到有效水稻序列的效率 小于激活标签系。 4 阐明了t d n a 插入不同位置产生的效应。t - d n a 插入引起基因功能失活或基因 表达量上升或下降。激活标签插入基因内导致基因功能失活，3 5 s 在基因上游和 下游对基因起激活作用；列举了多点插入同一基因和同一突变体多点突变等情况。 5 对插入位置的基因或基因编码蛋白的功能进行了研究，主要以h d l 、蛋白激酶为 主。对基因功能进行预测。得到了约6 0 个候选基因，其中2 个侯选基因已经通过 共分离得以确认。探讨了标签法克隆水稻花期基因与预期设想还有很大差距的几 方面原因。 关键词：水稻；突变体：开花；t - d n a ；t o s l 7 s c r e e n i n ga n da n a l y s i so ff l o w e r i n gm u 纽n 臼i n r i c e a u t h o r ：g a o c j m a j o r ：c r o pg e n e t i c sa n db r e e d i n g s u p e r v i s o r ：p r o f m az h i - y i n g p r o f w a n gx i n g - f e n p m fl ut i e - g a n g a b s t r a c t h e a d i n gd a t ei s a l li m p o r t a n tc h a r a c t e rw h i c hd e c i d e st h er i c ev a i l e t ya r e aa n dt h e s e a s c o m p a t i o n h e a d i n gd a t eh e r e d i t yh a sc l o s e l ya s s o c i a t i o nt oi n s t r u c t i n gb r e e d i n g p r a c t i c e ，t h ei m p r o v e m e n to fv a r i e t i e sa n dt h ev a r i e t yp r o m o t i o n m a k i n gt h eh e a d i n gd a t e e a r l yi se s p e c i a l l ys i 印i f i c a n tt o 朗l h a n c ep r o d u c t i o na n di m p r o v eq u a l i t y o ff l e e t 1 l e m u t a n ti sg o o dm a t e r i a lt oc o n d u c tt h eg e n ef u n c t i o nr e s e a r c h i nr e c e n ty e a r s ，w eh a v e o b t a i n e dm a n ym u t a n t s ，i n c l u d i n ge a r l yh e a d i n gm u t a n t sa n ds e r o t i n o u sm u t a n t s i ti sv e r y f e a s i b l et oc l o n eg e n e sw h i c hc o n t r o lf l o w e r i n gt i m e r i c e ，t h es h o r td a t ep a t t e mp l a n t , p l a y sa l li m p o r t a n tr o l eo ne x p l o r i n gf l o w e r i n gm e c h a n i s m i nt h i sr e s e a r c h , e a r l yh e a d i n gm u t a n t sa r es c r e e n e df r o mt - d n ai n s e r t i o nl a b e l m u t a n t s ( i n c l u d i n ga c t i v a t i o nt a g g i n ga n de n h a n c e rt r a p p i n gl i n e s ) ，m o r e o v e r , f l a n k i n g s e q u e n c e sa r es e p a r a t e da n da n a l y s i s e d w eh a v em a d et h em e t h o do fc l o n i n gg e n ef o r b e t t e r e x p e r i m e n t a lr e s u l t sa l ea sf o l l o w ： 1 w ei n v e s t i g a t ea n ds c n 嫩1t oo b t a i na b o u t3 5 0f l o w e r i n gm u t a n t sf r o m5 00 0 0 i n d e p e n d e n tl a b e lm u t a n t si nt h ef i e l d e a r l yh e a d i n gm u t a n t sa r ed o u b l et os e r o t i n o u s m u t a n t s t h ee f f i c i e n c yo f e n h a n c e r 唧p i n gi so 1 h i g h e rt h a na c t i v a t i o nt a g g i n g m o s t o fe a r l yh e a d i n gm u t a n t sa r ea tl e a s tam o n t he a r l i e rt h a nc k af e wo ft h e ma r et w o m o n t h se a r l i e r f o u rs e r o t i n o u sm u t a n t sa r eam o n t h1 a t c rt h a nc k 2 w eu s ep c r - w a l k i n gt os e p a r a t ef l a n k i n gs e q u e n c e sa n di m p m v et h i ss y s t e m i ti s s u g g e s t e dt h a td r a li sb e t t e rt h a ns s p l i nt h i sr e s e a r c ht w oe n z y m e sd r a i 和s s p la r eu s e d t og e tm o r ef l a n k i n gs e q u e n c e s 1 1 1 ev o l u m eo ft h es e c o n dp c ri sc h a n g e df r o m2 0 t lt o 4 0 t ld o e sn o tr e d u c et h ef i n a le f f m i e n c y w ea l r e a d yo b t a i na p p r o x i m a t e l y2 7 7f l a n k i n g s e q u e n c e so ft - d n aa n d2 8 9f l a n k i n gs e q u e n c e s a m p l i f y i n ge f f i c i e n c yo ff l a n k i n g s e q u e n c e si sa b o u t8 0 w eo b t a i n4 9 9s u c c e s s f u lf l a n k i n gs e q u e n c e si n c l u d i n g2 4 4 t d n aa n d2 5 5 而s 1 7 e f f i c i e n c yo f f l a n k i n gs e q u e n c e si sa b o u t8 8 3 m a k i n gp r e l i m i n a r ya n a l y s i st ot h ei n s e r t i o ns i t e w ec a i lk n o w nt h a t 劢1 7i n c l i n e t oi n s e r tg e n er e g i o na n dt - d n ad o e sn o th a v ec l e a rt r e n db e t w e e ng e n er e g i o na n ds p a c e o fg e n e s 1 1 1 ec o n s 廿a s tb e t w e e nt h ee n h a n c e rt r a p p i n ga n da c t i v a t i o nt a g g i n gl i b r a r y s h o w e dt h ea m p l i f i c a t i o ne f f i c i e n c yo ft h ee n h a n c e l t r a p p i n gi sb e t t e rt h a na c t i v a t i o n t a g g i n g b u tw o r s ei na c q u i r i n gs u c c e s s f u ls e q u e n c e s 4 w ee x p l a i nt h a td i f f e r e n tr e s u l t sa c c o r d i n gt od i f f e r e n ti n s e r t i o ns i t e s t - d n a i n s e r t i o nl e a d st h a tg e n ef u n c t i o nl o s e sa n de x p r e s s i o no fg e n ew i l lb eu po rd o w n i tm a y a c t i v a t eg e n e s ，w h e t h e r3 5 so fa c t i v a t i o nt a g g i n gi n s e r tg e n eu p s t r e a mo rd o w n s t r e a m p a r t i c u l a r i z et h a td i f i e r e n ts i t e si n s e r tt h es a m eg e n ea n dd i f f e r e n t i n s e r t i o ns i t e so f m u t a n t s ，e t e 5 a n a l y s i so fg e n ea n dp r o t e i n s u c ha sk i m s cp r o t e i na n dh d l a b o u t6 0g e n e sh a v e b e e no b t a i n e da f t e rs t u d y i n gt h eg e n ef u n c t i o n 2c a n d i d a t eg e n e so ft h e ma l r e a d ya r e c o n f i r m e dt h r o u g hs e p a r a t i n ge x p e r i m e n t t a k e i n ga d v a n g t a g eo fl a b e lm u t a n t st oc l o n e g e n eh a s al o n gw a yt og oa n dw e t l l i r 山d e e p l y k e y w o r d s ：r i c e ；m u t a n t ；f l o w e r i n g ；t - d n a t o s l 7 独创性声明 本人声明所望交的学似沧丈足本花学帅指导f 进行的研究工作及取得 的研究成果。掘我所知，除了叟= 中特别u 以杯汽和致谢的地方外，论文中不包 含其他人已经发表或撰写过的例。究成果，也不包岔为获得塑j e 壅些太堂或其它 教育机构的学位或t f ：书而使用过的材利，t j 我同r 作的同志对本研究所做的 任何贡献均已在论文中怍了明确的酏叫并襄j 了甥 意。 学位论文作者签名 彦蔻， 够宁i i 期：荔口1 年多月，弓同 关于论文使用授权的说明 本学位论文作符完伞了解通j t 壅些丛登宵戈保留硬使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门( 机构1 送突沱文的复印件和磁盘，允许论文被查 ( 借) 阅。本人授权煎j 壅些盘堂叫以将论殳的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，”丁l 三l 采用影印、缩印或j 1 杯t 等巧法加以保存或编成学位论文。 ( 保密的学位论文存解密后j 诹道：r 此协议1 学位论文作者签名 高翥。 签字同期： 2 d c 1 勺j用i ；| 导蚵】签名 箍产h 期： 日7 年石月g 同 水稻花期突变体的筛选与分析 1 引言 水稻( o r y z as a t i v al ) 是世界上最重要的粮食作物之一，世界上水稻年种植面积 1 5 亿公顷，年生产量6 亿吨。生育期是决定水稻品种地区及季节适应性的重要性状， 抽穗期的遗传研究对指导育种实践、品种改良及品种推广均具有重要意义。选育早熟 早花品种，缩短品种的生育期，对水稻生产发展的意义尤为重大。早熟可以使水稻免 受寒冷天气的灾害，从而提高产量；早熟早花可以减少稻米垩白现象的形成，从而提 高品质。近几年来对水稻早熟早花的研究取得了一些新的进展。 l 。】高等植物开花时程研究 高等植物从营养生长向生殖生长的转变是由一系列环境和内部因子调控的i ”。近 年来以拟南芥( a r a b i d o p s i st h a t i a n a ) 为模式植物的双子砰植物豹发育研究取得了飞 速的发展，为高等植物开花时程的基因调控提供了一个很好的模式。 多个外界环境因素和内在因素影晌着植物的丌花，研究者认为这些环境因子是通 过调节某些内源组分从而影响和调控j 丌花时程1 2 j 。近些年根据几种模式植物如拟南芥 和金鱼革等调控开花的信号途径的研究，提出了控制开花对问的三条信号途径： 1 ) 光周期促进途径：股来说，植物先通过光受体感受光信号，包括光质光 量光周期，然后作用于植物生物钟的周期节律，调控植物表达某些促进开花基因，降 解某些抑制丌花的因子，接着花分生组织同性基因表达升高，导致开花。光受体包 括光敏素和隐形素，现在已经发现五种光敏色素( p h y a 、p h y b 、p h y c 、p h y d 、及p 细b ) 和两种隐花色素( c r y l 和c r y 2 ) 。c r y 2 基因突变导致开花推迟，丽口砂b 基因突变导致 开花提前，p h y a 突变在长光照下开花稍微推迟，但如果黑暗中有光照问隔，则花期大 大推迟，红外光和蓝光( 7 3 5 n m ，4 4 0 a m ) 分别通 过p h y a 、c r y l ，c r y 2 促进开花。红光 ( 6 6 0 h m ) 则通过p m p h y d 4 自2 p h y e 抑制开花。 ( 2 ) 自发促进途径：在拟南芥中，存在这样一些突变体f l e a f p a 1 d ，f v e 和劬， 在长、短同照下都晚丌花，可以被春化作用克服。它们对春化敏感，但丌花比处于非 诱导条件短同照下的拟南芥还要晚。可见这些基因产物促进开花的作用是独立于春化 与光周期作用以外的，它们的信号传导途径称为自主促进途径p j 。 ( 3 ) 春化促进途径【4 。j ：春化作用的效应取决于植物本身所处的阶段、处理时间 长短和所利用的温度1 6 ”。在拟南芥中春化作用是出单基因f r i 控制的，f r l 是一个 具有两个c o i l e d - c o i l 结构域的特殊蛋白质，肘基因已通过遗传作图定位于4 号染色 体的顶端。f l c 位于染色体5 上，编码一个含脚d s 盒的开花抑制转录因子。f r ， 的作用是促进( m a d s ) 基因r n r n a 的积累，以促进凡c 的表达，来抑制开花，m a d s m r n a 与抑制开花时间有数量的关系。春化作用导致彪c 研j ，l 水平降低，促进开花。 在拟南芥中已经鉴定出多个春化相关基因：e l 和e l f 8 的功能是协助f r i 共同促 进f l c 的转录。v i n 3 具有感受低温时程的特性，其作用是在春化过程中识别低温处 理的时闯进而建立对春化关键基因戌c 表达的抑制。玎c _ ，和p 尉妇的功能是在春化 河北农业大学硕十学位( 毕业) 论文 作用后，维持对f l c 表达的持续抑制【8 _ 。 另外，许多化学药剂的应用已表明能够促进开花，其中赤霉素和碱基类似物的应 用引起了更大的注意【1 2 _ 。”。所有已知的植物激素( 赤霉素、生长素、细胞分裂素和 油菜素内酯) 在一定程度上参与了花期控制1 1 “”。 l d ，c o ，g 1 、f e ，刀、f d 、删、f h a 、f p a 、f v e 和f 黝被认为是 经典的晚期丌花基因。9 】，其中l d 、f c a c o 、刀和f h a 均已被克隆。l d 编码 着富含谷氨酸的核蛋白，该蛋白可能含有同源结构域，其功能目前还不清楚。f c a 编码一个含有2 个r n a 结合的结构域和一个w w 蛋白相互作用结构域的蛋白质，在 开花转录后调控中发挥作用。f h a 基因与t e l ，基因有同源性，并且f h a 编码c r y 2 蛋白，在蓝光感应中发挥作用2 l j 。c o 是一个b b o x 类的锌指蛋白，c 0 的组成型 表达导致了开花的早期性，肯定了该基因能促进开花。不管长同照还是短日照。过量 表达c d 均导致早开花。c d 可能是以输出物的方式综合日照接受和控时机制促进了 开花。c o 的表达除受到生物钟的调控外，还受到光周期的影响。如果的翻译、 活性、稳定性手光起控制作用，那么可以推测c o 只在长光照条件下有活性，长同诱 导基因表达而启动开花。 水稻是短同照植物，开花受到短同照的促进。r 照长短以及水稻本身的营养生长 状态决定着水稻的开花期1 2 2 矧。关于水稻花期的遗传学研究已经很多，并发现了几 个控制p s ( 植物对不同光照长度的反应) 的基因位点，例如s e l ，s e 3 & 7 、e 1 d 等。但是只有一个基因s e 5 被克隆。水稻突变体& 5 的表现：植株偏白，表现为早开 花，突变后完全不受光周期调控。& 5 基因编码一个与拟南芥册7 ，同源的血红素加氧 酶，显然光敏色素的发色团对于光敏色素行使光周期诱导功能起着关键作用1 2 42 ”。 y a n o 利用日本晴的k a s a l a t h 衍生的群体，通过构建近等基因系，图位克隆了觑，1 ， 胁拓、h d 3 a 和e h d l 系列基因4 个。随着分子遗传学和分子生物学的发展，现在共检 测到1 3 个与早熟早花有关的q t l 位点，分别确定了他们在染色体上的位置和各个基 因的作用。h d l 位于第六染色体中部，k a s a l a t h 缩短了花期。月砚位于第七染色体末 端，k a s a l a t h 缩短了花期：月刃位于第六染色体，日本晴缩短了花期；h d 4 位于第七 染色体，同本晴缩短了花期；h d 5 位于第八染色体，同本晴缩短了花期：h d 6 位于第 三染色体，由日本晴和籼稻杂交回交后代分离群体中检测到的h d 6 ，编码蛋白激酶 c 也a 的催化亚基。日本晴中的月弱，是未成熟蛋白，提前终止，没有功能。拟南芥 中与控制花期有关c k 2 ，在体外作用于并磷酸化相关的转录因子c c a l 。将k a s a l a t h 的c k 2 a 转移到同本晴中延迟了开花。e h d l 编码双重功能的b 类调控因子，尤其在 短只照下开花极早，励们和三“l 是控制开花途径两个独立因子，它们都位于嬲a 的上游。l e e l 2 6 筛选了影响花期的突变体，通过t d n a 方法克隆该基因编码m a d s 家族m a 珊5 0 基因，与拟南芥c j a g l 2 0 高度同源，其处于开花途径的m 妇口的上 游，处于删l 的下游，是开花途径的正调控因子。日本岛本教授分析了促使水稻开 花的信息传达路径上的三种基因“伪g ，、“国f ，”和“肋口，。结果发现，处在路径上游 发挥作用的基因“o s g i 一旦处于活跃状态，处在中游的“h d l ”也会增加，而下游的基 因w 出口 却大量减少，作用受到抑制，从而使水稻开花出现障碍。岛本认为，通过对 2 水稻花期突变体的筛选与分析 基因的调节完全可以控制水稻开花的季节。为此，他还通过转基因技术让上游“o s g l 基因过分活跃，结果转基因水稻和正常水稻相比，从发芽到开花的时叫要长9 0 天左 右。这些充分说明了人工调节植物花期大有可能。 拟南芥中存在5 种光敏色素( p h y a 、劝咖、岁、p k y d 、及p 妙p ) 和2 种隐花色 素( c r y l 和c r y 2 ) ，而水稻中发现3 种光敏色素( p h y a ，p h y b 初p h y c ) 和3 种c r y 同源基因田j ：在拟南芥自主促进开花途径中调控f l c 表达的f c a 基因在水稻中发现 有同源基因。拟南芥中受c o 调控的促进开花的基因胛、s o c i 、，丫在水稻中也有 对应的同源基因【2 7 】( h d 3 a 、o s m a d s - b o x 家族和r f y ) ：拟南芥生物钟基因l h y 、 g 譬分别对应水稻中的o s l h y 和伪g 1 ；其它生物钟基因兀) c j 、e l f 3 、z t l 、f k f l 等在水稻中也存在同源基因。 1 2 标签突变体的研究 目前国际上已获得了上百力拟南芥标签插入突变体和4 0 余万水稻标签突变体。 其中我国水稻标签突变体数量达2 0 力以上、插入位点侧翼序列2 力r 余条，尽管这些 突变体还远没有达到饱和的程度，但已经为进行水稻功能基因组学研究提供了良好的 平台。t d n a 插入突变和转座子插入突变技术是目前较为常用的两条创制水稻突变 体的技术路线。由于t - d n a 、转座子的序列己知，就如同在插入位点贴了一个标签。 插入位点侧翼序列相对容易获得，而且这类突变位点较少，易于进行遗传分析，所以 受到了广大研究者的关注。 t d n a 标签系统：t - d n a 来自根癌农杆菌( a g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n s ) t i 质粒 上一段d n a ，可以转移到寄主的染色体内，随机且稳定地整合到植物基因组中，稳 定表达。t d n a 插入植物基因组届破坏原有基因表达模式，产生突变体，屙对又可 作为“标签”用来鉴定基因的功能。优点是基因组t d n a 的插入通常是稳定的，且 t - d n a 的插入不具有位点特异性，可以建立饱和的i - d n a 插入突变库1 2 8 j 。 t - d n a 捕获标签系统：通过将被“标签”的基因和报告基因( g u s 或g f p ) 融合来 反映该基因的活性或表达模式。可以在没有突变表型和序列信息的情况下鉴定出目标 基因脚l 。该方法可分离鉴定杂合子中的致死基因，功能上冗余的基因和在多个发育阶 段发挥功能的基因。捕获标签系统有三种基本类型：增强子捕获，启动子捕获和基因 捕获，每种类型捕获标签系统都能对插入位点的颓式作用元件作出反应。本研究所用 的增强子捕获载体，由于增强子捕获系统的激活对t - d n a 插入位点和方向并无严格 要求，因此能够产生较高的g u s 表达频率。增强子捕获系统还可以用柬揭示基因家 族或与某个功能相关的基因簇的表达模式和调控网络。 t d n a 激活标签系统【2 9 】：将含有多个c a l v i v 3 5 s 增强子的t d n a 或者转座子元 件转入植物中而得到功能获得性突变。由于3 5 s 增强子可以在任何方向和离编码区很 远的距离外起作用，因而可以促使附近的基因过量表达而产生功能获得性突变。将外 源的增强子或启动子插入基因甜近，这些增强子可以激活附近位置的基因转录表达。 因为这些激活的基因是由t d n a 插入引起的，这种方法称为激活标签l z ”。激活标签 河北农业人学硕十学儒( 毕业) 论文 已经应用于多个植物的基因分离，运用基因激活标签技术在拟南芥、矮牵牛、常春花 等植物中分离了许多基因。在拟南芥中，己通过转座子激活标签法分离鉴定出t i n y 、 l h y 、s h i 等基因1 3 甜。激活标签系统具有以下几个特点：首先，通过该系统可以产 生显性突变，克服了基因功能的冗余对于分离基因的功能产生的障碍【3 引。可有效用于 分析多拷贝基因，而且其突变表型在转基因当代就可以表现。其次，该系统既可以进 行基因增强表达的显性突变体的筛选，又可以进行基因失活引起突变体的筛选，引起 的突变率远远高于单位点插入的突变率。最后，激活标签系统引起的这些突变体只是 增强表达基因原有的表型而不会改变表达模式。 转座子插入突变：转座子是染色体上一段可移动的d n a 片段，它可从染色体的 一个位置跳到另一个位置。当转座子跳跃插入到某个功能基因时，就会引起该基因的 失活，并诱导产生突变型，而当转座子再次转座或切离这一位点时，失活基因的功能 又可得到恢复。根据转座子的增殖方式】，可分转座子和逆转座子两类，相应地可利 用转座子插入法( a c d s 系统插入) 和逆转座子插入法( 逆转录转座子t o s l 7 ) 建立 水稻突变体库。 大规模水稻标签突变体库的建立以及功能基因的研究将为具有重要农艺性状基 因的克隆、自主知识产权的获得等奠定基础，而近几年突变体的创制和筛选使我们获 得了大量突变体，包括早熟和迟熟突变体。因此利用突变体克隆控制水稻花期的基因 是可行的。如能鉴定分离出更多的早熟基因，将为育种或引种工作开辟新的资源和途 径。同时，水稻作为短同照模式植物将与长r 照模式植物拟南芥一起，在最终揭丌植 物成花机理的研究中发挥不可替代的作用p “。 1 3 本研究主要内容 基于本实验室大规模水稻t - d n a 插入标签突变体库的构建( 包括激活标签系和 增强子捕获标签系) ，本文主要对以下几个方面开展研究： 1 对5 00 0 0 株水稻标签系t 代转化植株进行调查，观察和记录田间表型，筛 选早熟和晚熟的突变体。 2 利用p c r w a l k i n g 技术获得尽可能多的侧翼序列，并对p c r - w a l k i n g 技术体 系进行改进和完善。 3 对p c r 扩增获得的侧翼序列进行测序，将序列与水稻基因组序列进行同源 性比对，分析t d n a 和7 砸1 7 插入位点和插入基因的功能。 4 通过共分离实验确定突变表型是否由t - d n a 插入引起，确认基因和早熟突 变表型的关系，获取有重要价值的早熟突变体。 水稻花期突变体的筛选与分析 2 1 供试材料 2 1 1 载体 2 材料与方法 ( i ) 激活标签载体p e r - 3 8 t d n a 左边界是检测基因一潮霉素抗性基因，其前面为3 5 s 启动子，没有报告 基因，中间是p u c l 9 带有一部分酶切位点，右边界是3 5 s 启动予带有2 个增强子， 用来激活插入位点附近的基因的增强表达( 图1 ) 。 曲r 耽 粥j f e 船钻耻t 衄t - 口p 3 5 $ d e p s d m l 5 4 6 ( p e p , 3 8 ) 图l激活标签载体p e r 3 8 的t - d n a 区的结构 f i g f t h e t - d n a o f a c t i v a t i o n t a g g i n gv c c l o r p e r 3 8 r 班n 咖如咖 和u m i e r h 柑n 为t - d n a 区的右础界和占：边羿- p 3 5 s 显来溺丁花棒葵| 【邑叶病i ； ( c 叫l n o 呲r m o v i ev l r 嶂，c - m v ) 的启 动子，p 3 5 s d e 是带有两个增强子的起动子咖期霉秉碑艘转咎尊蓦凼瑟傥璺体细胞获群期带素执性：p u c 是兜摩槛体p u c l 9 序 列1 硇足终止子- o d 是趋驱动序列促进t - d n a 的转移，s 一 b 帅等分荆代表切位点 ( 2 ) 增强子捕获载体p f x e 2 4 2 - 1 5 r 报告基因与最小启动子融合，t - d n a 作为只带有t a t a 盒和转录起始位点的基 础启动子，- - 4 8c a m v 本身不足以启动下游基因的表达。而当外源的增强子等基因表 达调控元件激活了g a l 4 n p l 6 的表达时，产生的g a i a n p l 6 融合蛋白便会特异性 的结合到u a s 上，从而激活下游g u s 基因的表达( 图2 ) 。 河北农业大学硕+ 学位( 毕业) 论文 k p n l r b g a l 4 v f 1 66 x u a sg u s p i u s a l pp u c o r jc a l l v 3 5 s h p hl j 3 图2 增强子捕获载体p f x e 2 4 2 l5 r 的t - d n a 区结构简田 f i g 2 as c h e m a t i cd i a g r a mo f t h e t - d n ar e g i o n o f p f x e 2 4 2 1 5 r r i b ( n 咖m r d e r ) 和l i b ( 1 e f th a r d e r ) 丹掰代表t - c w a m 帕右边界和 锄抖：g a i a - v p l 6 蝙甜融合篮r i fg u s p i m 作为报告摹埘： 6 x u a s 悬6 个睾联重复的虹辩蠹谣序列；a m p 足氨苄鼠葛螽挽性蕞蹦，柞为质牲拯救时竹选再拓矗三用：p u co r i 垦p u c 蓑列质i 宦的复 制起点：c i m v 3 $ s 是来雄于花囊信叶璃蜀 的启动f ：h p i i 是瑚雄萱磷酸转移群基因 ( 3 ) 逆转座子t o s l 7 水稻中有许多内源的逆转座子，其中在组培中有活性是t o s l 7 、t o s l 0 和t o s 9 ， 丁瓠1 7 的活性最高，在组培的情况下能迅速跳跃到新的位点。一般经过组培三个月到 半年，它的拷贝数就能增强1 5 个，同本晴中有内源的有活性的t o s l 7 拷贝数2 个， 全长4 】1 4 个碱基，它位于水稻第七染色体和第十染色体上，各自的b a c 克隆号为 p a cc l o n c ：p 0 5 2 4 ( 珀8 和c i o n e ：n b x b o o l 9 m 2 0 ( 图3 ) 。 圈3 遂转座子t o s l 7 的结构简田 f i g 3a s c h e m a i cd i a g r a mo f t h er d “m s d 0 nt o s l 7 5 - l t r ( r - i m gt e r m i n a lf e t e ) 和3 - l t r ( 3 - l 帆gt e m m a lf 印酬) 分崩代表7 0 _ 1 7 的5 来稿和3 束1 1 k 度1 3 8 b p - 5 末端和3 来螭同向重复p b s ( p r i m e t b m d m bs i t e ) 代衰引物结台物点互补于t r n a 3 来麓p p t 代袭多曛岭位点掌喀基嘲稿码埔毒的核心夤 自囊n i c e 印幔目n e a s e ) 9 0 i 肇埘蝙码与饭馥舟废以及重组相关的群娄。) 国ks a i l 。b 蜘h i ，哪。1 是 b * 1 7 需用鹅蠢坍证点 2 1 2 实验材料 以粳稻品种同本晴( o 忉s a t i v al j a p o n i c a “n i p p o n b a r e ) 为受体材料，用农杆菌 介导的方法获得了大约5 万份t - d n a 插入标签系转基因植株，以激活标签载体 p e r 3 8 为载体的有3 60 0 0 份，以增强子捕获载体p f x e 2 4 2 一l5 r 为载体的有1 60 0 0 份。将转基因植株t 0 获得的种子再种入大田，本实验田恻种植材料为t i 代转基因植 株。筛选其中的花期突变体进行侧翼序列扩增和测序分析。 6 水稻花期突变体的筛选与分析 2 ，1 3 药品和试剂 ( 1 ) 所用t a t 酶、限制性内切酶和t 4 连接酶均购自大连宝生物工程有限公司。接 头和引物由上海生工合成。 ( 2 ) 接头( a d a ，5 0 i _ t m ) 双链分别为： a d a i ( 1 0 0 p m ) 5 c t 从t a c g a ( 汀c a c t a t a g c g c t c g a g c g g c c g c c g g g g a g g t 3 a d a s ( 1 0 0 u m ) 5 - p a c c t c c c c - n h 2 3 用等体积的两条互补寡核苷酸混合，9 2 变性处理6 m i n 后，让其自然冷却至室 温退火形成双链接头。两个载体所用的特异性接头是一样的。 两条接头特异性的引物为： a p l ( 5 0 i _ t m ，5 - - g g a t c c t a a t a c g a g t c a c t a t a g c g c 3 ) a p 2 ( 5 0 u m ，5 一c t a t a g c g c t c g a g c g g c - 3 ) ： p e r 3 8 载体的t d n a 区左端的引物分别为： p l b i ( 5 0 1 a m5 c t g t g t t c t t g a t g c a g r r a ( 7 r c c t g 一3 ) p l b 2 ( 5 0 1 a m5 c g t c t t g a t g a g a c c t g c t g c 3 ) 。 两条针对p f x e 2 4 2 一1 5 r 的t d n a 区左端的引物为： l b l ( 5 0 t m ，5 一c g a t g g c t g t g t a g a a g t a c t c g c 3 ) l b 2 ( 5 0 1 a m ，5 一( 汀t c c t a t a g g g n t c g c t c a t g r g t t ( 1 3 ) 。 水稻内源的逆转座子t o s l 7 的新插入位点设计特异t o s l 7 引物，对t o s l 7 右边界 进行扩增： t b l ( 5 0 1 , t m ，5 一g c a t c r 丌c a c a c g r r c t c a t t g t c a g c 3 ) t b 2 ( 5 0 1 t m ，5 - c g g t r a c a t c l r c t c a 从c t c a a t g t g g 3 ) ( 3 ) 1 a g a r o s e 胶配方：1 0 9 a g a r o s e 加入至1 0 0 m l1 x t a e 加热至沸腾，加入3 1 t l e b ，冷却后倒胶。 ( 4 ) 0 5 m e d t a ( p h8 0 ) 配方：8 0 0 m lh 2 0 中加1 8 6 1 9e d t a n a 2 2 h 2 0 定容至 1 0 0 0 m l 灭菌。 ( 5 ) c t a b 裂解缓冲液配方：称取药品于烧杯中加蒸馏水定容至1 0 0 m l 室温保存 1 之周，用前加o 2 b 巯基乙醇。( 表1 ) 襄lc t a b 裂解缓冲澶配制 ! 竺! ! ! 里竺竺! 竺堡! ! ! ：! ! 竺：竺! 竺! 竺! ! ! 坠竺 鼢 ( r c a g e n t ) 终浓度( f i n a ic o n c n t r a l i o n ) i ( 1 0 0 0 m l x d o s a g e ) 7 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 ( 6 ) 乙醇7 酸钠混合液的配制方法：6 2 5 m l9 5 乙醇，3 m l3 m 乙酸钠( p h 4 6 ) ， 1 4 5 m ld d h 2 0 ，混合后总体积为8 0 m l 。 ( 7 ) 乙酸钠溶液的配制方法：称取1 0 2 0 6 9n a a c 3 h 2 0 溶于2 0 0 m ld d h 2 0 中，用 冰醋酸调节p h 值至4 6 ，定容至2 5 0 m l ，分装后灭菌，室温保存。 2 2 试验方法 2 2 1 田间种植规划与数据统计方法 2 0 0 5 年与2 0 0 6 年分别在天津和廊坊育种基地种植转基因t l 与t 2 代。于t 0 代单 株收获后t l 代植株单行种植，4 月1 5 日左右采用育秧盘育苗，每穴2 0 粒饱满的种子。 6 月1 日至6 月7 同插秧，每块地分五个小区，每个小区种植1 0 0 行，每行植株为一 个独立的t - d n a 插入标签系，每行标准为2 0 棵，株距为0 2 米，行距为0 3 米，每 个小区间隔0 2 米，周围设保护行。 按罗林广等的方法，把单株第一穗穗尖露出叶鞘1 锄记为该单株抽穗。 在水稻生长的不同阶段，对5 00 0 0 个独立的t - d n a 插入标签系的t i 代植株进 行田间表型调查，7 月2 0 日 9 月1 0r 统计早熟，9 月1 0 日左右为正常抽穗，9 月 1 5r l o 月1 0 日统计晚熟，于1 0 月下旬进行突变体的收获，对有明显突变表型的突 变体，将纯合与杂合分开收获，在j 下常生长状况下没有明显表型的突变体，每一株系 的2 0 株混收，每一株系收获4 0 0 0 粒种子，用于后继实验。 2 2 2d n a 提取 将筛选所得的3 5 0 份早熟和晚熟突变体提取植物叶片基因组d n a ：取0 2 9 o 3 9 新鲜水稻叶片放置在研钵中加液氮研磨材料至绿色粉末状，立即将粉末转移至 1 5 m l e p p e n d o r f 管中，加入4 0 0 p l c t a b 缓冲液，颠倒混匀，在6 5 水浴中保温2 h ， 过程中将样品颠倒混匀数次；取出样品，静置让其自然冷却至室温，1 20 0 0 r p m 离心 6 m i n ：取上清转移至新管中，加入2 0 0 p l 氯仿，彻底混匀后1 2o o o r p m 离心6 m i n ： 再取上清转移至新管中，加入o 7 倍体积的异丙醇，轻轻晃动，用枪管吸出絮状沉淀； 用5 0 0 p l7 5 乙醇洗涤沉淀；1 20 0 0 r p m 离心3 m i n 后