（免疫学专业论文）p100蛋白与u5116蛋白的相互结合作用.pdf

天津医科大学硕士学位论文 中文摘要 目的： 真核基因的表达过程，包括d n a 转录、p r e m r n a 剪接、翻译等步骤。其中 d n a 转录和p r e m r n a 剪接是两个重要环节，它们都要通过复杂的蛋白复合物来 执行功能，涉及到蛋白d n a 、蛋白r n a 和蛋白蛋白之间的相互作用。大量研 究表明基因转录和p r e m k n a 剪接并非两个独立的过程，多种蛋白具有参与转录 和剪接调控的双重功能，从而将这两个过程紧密地连接起来，因此这些蛋白被 称c r o s s t a l k 蛋白。对于这些蛋白的了解有助于转录和剪接机制的深入探讨。人类 p 1 0 0 蛋白是一个关键的转录调控子，能通过在启动子特异性激活因子和基本转 录机器之间形成连接从而促进基因转录。h c a ( h y d r o p h o b i cc l u s t e ra n a l y s i s ，疏水 簇分析) 法发现p 1 0 0 蛋白是由4 个重复的s n 1 i k ( s t a p h y l o c o c c a ln u c l e a s e 1 i k e ，葡萄 球菌核酸酶类似) 功能片段和随后位于蛋白c 末端t u d o r - s n ( t s n ) 功能片段组 成。大量的研究发现p 1 0 0 蛋白作为一种共激活因子参与基因转录调控，这种作 用主要借助其重复的s n 样功能片段完成。前期我们课题组采用非变性胶电泳观 察剪接体复合物体外组装的情况。观察发现p 1 0 0 蛋白t s n 片段参与并促进剪接体 的形成【lj 。但p l0 0 蛋白的t s n 功能片段参与并促进p r e m r n a 剪接加工过程的具 体分子机制还不明确。 p r e m r n a 的剪接加工是在一个大的蛋白复合物一剪接体中进行的，而剪 接体中重要的组分就是u 5 s n i 斟p 。u 5 1 1 6 蛋白因为能够直接与u 5s n r n a 结合， 因而组成u 5 s n r n p 的核心，是u 5 的特异蛋白。本研究的主要目的在于研究p 1 0 0 蛋白，u 5 - 1 1 6 蛋白之间特异的结合方式和结合位点，通过蛋白一蛋白相互作用 研究探讨p 1 0 0 蛋白的t s n 功能片段参与并促进p r e m r n a 剪接加工过程的分子机 制，为随后p 1 0 0 蛋白功能的研究奠定基础。 方法： 本课题分三部分进行研究，第一部分为确定能与p 1 0 0 蛋白，u 5 1 1 6 蛋白 结合的h p r p 8 蛋白功能片段。首先根据h p r p 8 蛋白的结构特点构建h p r p 8 蛋白不 同结构域的g s t 融合蛋白表达质粒。利用g s tp u l ld o w n 方法用g s t - h p r p 8 片 段融合蛋白钓取体外翻译带有3 5 s 标记的p 1 0 0 蛋白，放射自显影观察结果，寻 找h p r p 8 的功能部位。同样方法研究u 5 1 1 6 蛋白与h p r p 8 蛋白结合的功能片段。 第二部分是p 1 0 0 蛋白与u 5 1 1 6 蛋白的结合。首先构建p e g f p c i u 5 1 1 6 天津医科大学硕士学位论文 重组质粒，利用c o i p ( c o i m m u n o p r e e i p i t a t i o n ，免疫共沉淀) 技术研究p 1 0 0 蛋白与u 5 “6 蛋白在细胞内的结合情况。再构建p e r f p c i p 1 0 0 重组质粒，利 用激光共聚焦显微镜研究p 1 0 0 蛋白与u 5 1 1 6 蛋白细胞内定位情况。 第三部分为了进一步确定p 1 0 0 蛋白与u 5 1 1 6 蛋白结合的功能片段。使用 g s t 融合蛋白钓取法和w e s t e r nb l o t 技术，用p 1 0 0 蛋白s n 片段和t s n 片段的 g s t 融合蛋白( g s t 空载作为阴性对照) 钓取细胞内过表达的u 5 1 1 6 蛋白， w e s t e r nb l o t 方法检测。 。 结果： 第一部分h p r p 8 蛋白与p 1 0 0 蛋白，u 5 1 1 6 蛋白相互结合的功能片段研究结 果显示：p 1 0 0 蛋白不能与h p r p 8 蛋白2 1 片段结合，能与2 2 片段在体外直接结 合。u 5 1 1 6 蛋白能与h p r p 8 蛋白的2 1 ，2 2 片段在体外结合。 第二部分成功构建了以下重组质粒：( ) p e g f p c i u 5 1 1 6 ( 霪) p e r f p c i p 1 0 0 。 过表达的p 1 0 0 蛋白与u 5 1 1 6 蛋白之间可以发生共沉淀，表明两者细胞内可以 稳定结合。利用激光共聚焦显微镜研究p 1 0 0 蛋白与u 5 1 1 6 蛋白定位情况。在 转染后的细胞内观察到两者定位基本一致，主要分布于胞浆。 第三部分p 1 0 0 蛋白与u 5 1 1 6 蛋白在细胞外结合的研究结果显示p 1 0 0 蛋白 的t s n 片段能够与u 5 1 1 6 蛋白结合而s n 片段不能与其结合。 结论： 本课题研究结果表明p 1 0 0 蛋白和u 5 1 1 6 蛋白都能与h p r p 8 蛋白体外直接结 合，但结合部位不同。p 1 0 0 蛋白能够与u 5 1 1 6 蛋白在细胞内，外均可结合。二 者之间的结合是由p 1 0 0 t s n 片段介导的。 关键词：h p r p 8u 5 - 1 1 6 剪接体剪接因子共激活因子 i i 天津医科大学硕士学位论文 a b s t r a c t o b j e c t i v e ： e u k a r y o t i cg e n ee x p r e s s i o np r o c e s si sc o n s i s t i n go fd n at r a n s c r i p t i o n ， p r e - m r n as p l i c i n ga n dt r a n s l a t i o n i nt h i sp r o c e s s e st r a n s c r i p t i o na n dp r e m r n a s p l i c i n ga r et h ek e yp r o c e s s e sa n db o t ho ft h e mr e q u i r em u l t i - c o m p o n e n tc o m p l e xt o f u n c t i o n , c o n c l u d i n go fp r o t e i n - d n a ，p r o t e i n - r n aa n dp r o t e i n - p r o t e i n t r a n s c r i p t i o n a n ds p l i c i n ga r en o ti n d e p e n d e n te v e n t s t h e ya r ef u n c t i o n a l l yc o o r d i n a t e d s o m e p r o t e i n sh a v et r a n s c r i p t i o na n ds p l i c i n gf u n c t i o n , s ot h e ya r ec a l l e dc r o s s t a l kp r o t e i n s t u d y i n gt h e s ec r o s s - t a l kp r o t e i n sw i l lh e l pu sk n o w nm u c ha b o u tt r a n s c r i p t i o na n d s p l i c i n g h u m a np l0 0p r o t e i ni san o v e lt r a n s c r i p t i o n a lc o a c t i v a t o r h c a ( h y d r o p h o b i c c l u s t e ra n a l y s i s ) s h o wt h a tpl0 0c o n s i s t so fs t a p h y l o c o c c a ln u c l e a s e ( s n ) - l i k ea n d t u d o r ( t s n ) d o m a i n s t h es n 1 i k ed o m a i n sh a v e b e e ns h o w nt of u n c t i o ni n t r a n s c r i p t i o n ，b u tt h ef u n c t i o no ft s nd o m a i ni nt h ea s s e m b l yo fs n r n pc o m p l e x e s a n dp r e m r n as p l i c i n gp r o c e s s p r e - m r n as p l i c i n gi sh a p p e n e di nab i gp r o t e i nc o m p l e x - s p l i c o s o m e ，i nw h i c h t h e r ei su 5s n r n ps p e c i f i cp r o t e i n s ，s u c ha su 5 一l16 t h ep u r p o s eo ft h i ss t u d yw a st o v a l i d a t et h eh y p o t h e s i st h a tpl0 0p r o t e i nf u n c t i o n si np r e m r n as p l i c i n g ，a n dt o r e v e a ls p l i c i n gp r o c e s s e sm o l e c u l em e c h a n i s m m e t h o d s ： i nt h i sr e p o r t ，t h e r ea r et h r e ep a r t s f i r s t , g s tg e n ef u s i o np r o t e i n s 、析t hv a r i o u s f r a g m e n t so fh p r p 8w e r eu s e dt op u l ld o w ni nv i t r ot r a n s l a t e df u l ll e n g t hpl0 0o r u 5 - 116l a b e l e dw i t h 3 s w e s t e r nb l o te x p e r i m e n t sw e r ea l s ou s e dt oc o n f i r mt h e s p e c i f i ci n t e r a c t i o nd o m a i n so fh p r p 8 i nt h es e c o n dp a r t , i n t e r a c t i o n so fp 1 0 0a n du 5 - 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116 ( 趸) p e r f p - c i - p l0 0 c o i m m u n o p r e c i p i t a t i o na n d w e s t e r nb l o te x p e r i m e n t sa l s oc o n f i r m e dt h ei n t e r a c t i o no fo v e r - e x p r e s st w op r o t e i n s i nc e l l a n dw eo b s e r v e dt h ec o l o c a l i z a t i o no fp l0 0p r o t e i na n du 5 - 11 6p r o t e i nb y i m m u n o f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y i nt h et h i r dp a r t , pl0 0 一t s nf r a g m e ms t a b l yi n t e r a c t sw i t l lu 5 116 p r o t e i n c o n c l u s i o n ： o u rp r e s e n ts t u d yp r o v i d e sf o l l o w i n gv i e w s ：pl0 0p r o t e i n ，u 5 116p r o t e i nc a l l b i n d st oh p r p 8p r o t e i n , b u tf u n c t i o nd o m a i n so fh p r p 8a r ed i f f e r e n t pl0 0p r o t e i nc a n i n t e r a c t su 5 - 116p r o t e i n pl0 0 一t s ns t a b l yb i n d st ou 5 116 p r o t e i n k e y w o r d s ：h p r p 8 u 5 116 s p l i c e o s o m es p l i c i n gf a c t o r c o a c t i v a t o r i v 天津医科大学硕士学位论文 符号说明 缩略词英文全称 d m s o d i m e t h y ls u l f o x i d e d m e md u l b e c c o sm o d i f i e de a g l e sm e d i u m b s a d n a r n a m r n a c d n a us i 矾p b o v i n es e r u ma l b u m i n d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d r i b o n u c l e i ea c i d m e s s e n g e rr n a c o m p l e m e n t a r yd n a u 融c hs i n a i ln u c l e a r r i b o n u c l e o p r o t e i n p r p 8 p r e c u r s o rm r n a p r o c e s s i n g8 s t a t e b n a 2 i l 4 s m n c b p t b p o bf o l d 姒t r h a h r p s n t a d t f p m s f s i g n a lt r a n s d u c e r sa n da c t i v a t o r so f t r a n s c r i p t i o n e p s t e i n b a r rv i r u sn u c l e a ra n t i g e n2 i n t e r l e u k i n e 4 s u r v i v a lm o t o rn e u r o n c a m pr e s p o n s ee l e m e n t - b i n d i n gp r o t e i n t a t a - b o xb i n d i n gp r o t e i n o l i g o n u c l e o t i d e o l i g o s a c c h a r i d eb i n d i n gf o l d h i s t o n ea c e t y lt r a n s f e r a s e r n ah e l i c a s ea h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e s t a p h y l o c o c c a ln u c l e a s e t r a n s c r i p t i o na c t i v a t i o nd o m a i n t r a n s c r i p t i o nf a c t o r p h e n y l m e t h y l s u l f o n y lf l u o r i d e v i 中文译名 二甲基亚砜 达尔伯克( 氏) 改良伊 格尔( 氏) 培养基 牛血清白蛋白 脱氧核糖核酸 核糖核酸 信使r n a 互补d n a 富含嘧啶小核核糖核 蛋白 前体m r n a 剪接因子 8 信号传导与转录激活 因子 e b 病毒细胞核抗原2 白细胞介素- 4 运动神经元生存蛋白 环腺苷单磷酸反应元 件结合蛋白 t a t a 框结合蛋白 o b 折叠 组蛋白乙酰转移酶 r n a 解旋酶a 辣根过氧化物酶 葡萄球菌核酸酶 转录激活区 转录因子 苯甲基磺酰氟 天津医科大学硕士学位论文 g f p d d h ：2 0 e b p b s t b s f b s 毋 而s e d l a e c o l i i p t g x g a l 1 3 - g a l h e p e s 心 t e m e d s d s p a g e c o i p h c a g s t o d g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n绿色荧光蛋白 d o u b l ed i s t i l l e dh 2 0 双蒸水 e t h i d i u mb r o m i d e 溴化乙锭 p h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e 磷酸盐缓冲液 嘶sb u f f e rs o l u t i o n 三羟甲基氨基甲烷缓冲 盐溶液 f e t a lb o v i n es e r u m 胎牛血清 w e s t e r nb l o t免疫印迹 t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) 一m e t h a n a m i n e 三羟甲基氨基甲烷 e t h y l e n ed i a m i n e t et r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 e s c h e r u c h i ac o l i 埃希氏大肠杆菌 i s o p r o p y l - p - d - t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e异丙基硫代1 3d 半乳 糖苷 5 - b r o m o 4 一c h l o r o 3 i n d o l y l f t d - g a l a e t o s i d e5 溴_ 4 - 氯3 一吲哚 b d 半乳糖苷 p g a l a c t o s i d a s e1 3 - 半乳糖苷酶 h y d r o x y e t h y lp i p e r a z i n ee t h a n e s u l f o n i ca c i d 羟乙基哌嗪乙磺酸 a m m o n i u n lp e r s u l f a t e 过硫酸氨 n ，n ，n ，n - t e t r a m e t h y l e t h y l e n e n ，n ，n ，n 一四甲基乙 二胺 s o d i u md o d e c y ls u l f a t e十二烷基硫酸钠 p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s 聚丙烯酰胺凝胶 c o i m m m u n o p r e c i p i t a t i o n 免疫共沉淀 h y d r o p h o b i cc l u s t e ra n a l y s i s 疏水簇分析 g l u t a t h i o n es t r a n s f e r a s e谷胱甘肽s 转移酶 o p t i c a ld e n s i t y 光密度 v 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：垄竺盏查 日期：2 。降明弓。日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库迸行检索，并采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有 关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。 本论文属于 保密口，在年解密后适用本授权书。 不保密囹 ( 请在以上方框内打“妒) 作者签名：盔盛叁日期：2 研年 月弓口日 导师签名：一鞑 日期：2 伽c 年夕月3 。日 天津医科大学硕士学位论文 - 上- 一 月u 吾 研究现状、成果 真核基因准确表达是一个复杂的过程，需要多种调控机制相互作用才能完 成。编码蛋白质的基因在r n a 聚合酶i i ( r n ap o l y m e r a s e l i ，r n ap o l i 0 1 作用 下转录为p r e - m r n a ，这一过程是基因表达的初始步骤。p r e m r n a 包括外显子 和内含子，通过剪接加工使p r e m r n a 中的内含子去除而将相邻的外显子拼接起 来，使之成为成熟的m r n a 。后者转运至胞浆中，经过翻译和翻译后修饰等过程 才能形成具有活性的蛋白 2 1 。因此，转录和p r e m r n a 的剪接加工是表达过程中 两个重要的环节，都需要复杂的调控复合物执行功能。基因转录是以d n a 为模 板合成r n a 的过程，转录活性有赖于基本转录元件、转录因子和共激活因子等 组成的转录调控复合物的调节。目前对调控真核基因转录的分子机制的研究较 多，也相对比较全面。基因转录生成的初级转录产物p r e - m r n a 不仅包括外显子， 也包括内含子。p r e m r n a 的长度和数量都可以很大，通常为成熟m r n a 的4 1 0 倍。由于蛋白质翻译元件只能翻译密码子连续排列的m r n a ，它无法识别并跳过 非编码序列，因此p r e m r n a 在翻译成蛋白质前必须将内含子去除。从p r e m r n a 中去除内含子把相邻外显子连接在一起是p r e m r n a 剪接( p r e m r n a s p l i c i n g ) | 3 1 。 多年来，p r e m r n a 剪接一直被认为是转录后加工的一个过程。然而越来越多的 研究发现在全部p r e m r n a 转录合成之前包括剪接在内的p r e m r n a 力h i 过程就 已经开始，即共转录( c o 臼觚s 嘶p t i o m i ) h 。由于其调控机制更加复杂，不仅涉及 到蛋白与蛋白之间的相互作用，还涉及蛋白r n a 和r n a r n a 之间的相互作用， 所以至今对于p r e m r n a 剪接调控的分子机制了解并不透彻。近年研究表明， p r e m r n a 剪接加工不但与胚胎的发育、性别确定、激素分泌等密切相关，而且 多种人类遗传性疾病( 如地中海贫血、遗传性肾炎) 的发生和剪接因子的功能 异常有直接的关系【5 6 7 j 。因此研究参与p r e m r n a 剪接加工调控的剪接因子的结 构和功能，将有利于了解剪接反应的分子机制，有助于揭示某些特殊生理和病 理现象的分子基础，促进相应基因的表达调控研究。 转录和p r e m r n a 剪接一样都是真核基因表达中复杂的多分子过程。目前 很多研究证明转录和剪接并不是两个绝对独立、严格按先后顺序发生的过程。 已经发现一些蛋白具有偶联作用，可将基因转录和p r e m r n a 剪接加工两个环 节联系起来，使转录和剪接同时进行。例如，作为基本转录调控元件的核心成 天津医科大学硕士学位论文 员的r n a 聚合酶i i ，它不仅在启动基因转录方面起举足轻重的作用，而且它可 通过其c t s n ( c a r b o x y - t e r m i n a ld o m a i n ，羧基端结构域) 募集到许多剪接因子， 并与其相互作用，对p r e m r n a 的剪接加工产生直接或间接的影响，从而将基 因转录和p r e m r n a 剪接过程偶联起来。在关于剪接体蛋白组成的研究中发现 - 一些转录调控因子也是催化p r e m r n a 剪接的剪接体成员，而且一些剪接因于 能与转录相关因子结合，这些蛋白同时参与转录和剪接的调控，被称为c r o s s - t a l k 蛋白。它们将转录和剪接有机的联系在一起，促进基因有效表达【s j 。最近，人剪 接体蛋白组学研究发现，剪接体中只少有3 0 种以上的剪接因子蛋白参与剪接之 外的基因表达过成【吼1 0 川】。例如s k i p ( s k io n c o g e n ei n t e r a c t i n gp r o t e i n ，s l ( i ，癌基 因作用蛋白) 、p g c 1 ( p e r o x i s o m ep r o l i f e r a t o r - a c t i v a t e dr e c e p t o ryc o a c t i v a t o r - 1 ，过 氧化物酶体增殖物激活受体丫共激活因子1 ) 等【1 2 j 3 ，1 4 1 。这些结果显示基因的表 达过程是通过蛋白之间的相互作用广泛偶连的。因此，明确定义功能蛋白复合 物和它们之间共有的成员是理解转录和剪接过程生理机制的关键。 p r e m r n a 剪接是在剪接体中进行的。在剪接过程中形成的剪接复合物称为 剪接体( s p l i c o s o m e ) ，剪接体的主要组成是蛋白质和小核r n a ( s m a l ln u c l e a rr n a ， s n r n a ) 。复合物的沉降系数约为5 0 6 0 s ，它是在剪接过程的各个阶段随着 s n r n a 的加入而形成的。也就是说在完整的p r e m r n a 上形成的一个剪接中间 体。剪接体中有5 种s n r n a ，即u 1 、u 2 、u 5 、u 4 、u 6s n r n a ，其中u 4 和 u 6s n r n a 以碱基配对方式形成二聚体【l5 川。s n r n a 可以通过碱基互补配对来 识别特异性序列，在剪接体的组装，活化和转酯反应中都起重要作用【l7 1 。在自 然状态下它们以s n r n p ( s m a l ln u c l e a rr i b o n u c l e o p r o t e i np a r t i c l e ，小核核糖核蛋 白颗粒) 的形式存在。s n r n p 以其所含的s n r n a 来命名，其组成蛋白又可分为 两组：( 1 ) 只存在于某种s n r n p 中的特异蛋白；( 2 ) 可与u l 、u 2 、u 4 、u 5s n r n a 结合的s m 蛋白。s m 蛋白可以与u 1 、u 2 、u 4 、u 5s n r n a 中的s m 结合区域结 合，并起稳定s n r n a 的作用【1 8 ，这一位点是一段u 富集的r n a 序列。此外， 在剪接体中还存在着非s n r n p 蛋白。其中一些为功能已知的剪接因子，如s r 蛋白( 富含a r g s e r ) ，它可促进其它剪接因子与s n r n a 结合【1 9 1 。 。 转录激活因子人类p 1 0 0 蛋白首先是作为e b n a 2 ( e p s t e i n b a r rv i r u sn u c l e a r p r o t e i n2 ，e b 病毒细胞核抗原2 ) 的转录激活因子被发现的【2 0 】。p 1 0 0 蛋白在细 胞内的含量很丰富，并且存在与多种组织，细胞以及不同种属种。p 1 0 0 蛋白应 当在细胞内承担重要作用。p 1 0 0 蛋白是一种多功能蛋白，在体内很多代谢途径发 2 天津医科大学硕士学位论文 挥作用。作为转录激活因子，p 1 0 0 蛋白主要是以s n 结构域作为蛋白结合区域， 将转录相关因子与基本转录元件结合在一起，从而参与转录调控。如其在j a k s t a t 信号传导通路中的作用就是如此。j a k s t a t 信号传导通路是细胞因子 调控基因表达的主要途径。s t a t s ( s i g n a lt r a n s d u c e r sa n da c t i v a t o r so f t r a n s d u c t i o n ， 信号转导和转录激活因子) 家族可接受细胞外细胞因子刺激，通过调控基因转录， 引发各种生物反应1 2 。该家族成员之一的s t a t 6 是i l 一4 介导的信号传导通路 中的重要转录调控因子，该传导通路异常活跃与过敏性疾病发生密切相关【2 2 】。 而p 1 0 0 蛋白的s n 结构域可促进s t a t 6 介导的转录活性调控，并形成多种蛋白 质复合物，如桥连s t a t 6 和r n a p o li i ( r n ap o l y m e r a s ei i 。r n a 聚合酶i i ) 形 成r n a p o li i p 1 0 0 s t a t 6 复合物；以及桥连s t a t 6 和r h a ( r n ah e l i c a s ea ， r n a 解旋酶a ) 形成s t a t 6 p 1 0 0 r h a 复合物等1 2 3 ，执2 5 1 ，从而在细胞因子介导 的信号传导通路中发挥重要的作用。除此之外，还有研究表明p 1 0 0 与p i m l 结 合可增强转录因子c m y b 的转录活性；p 1 0 0 蛋白能与偶联病毒转录翻译密切相 关的n s p l ( n o n s t r u c t u r a lp r o t e i nl ，非结构蛋白1 ) 特异性结合【2 6 1 。值得一提的 是，p 1 0 0 蛋白还是r i s c ( r n a i n d u c e d s i l e n c ec o m p l e x r n a 诱导的沉默复合体) 的重要亚基之一【2 7 孤2 9 1 ，提示p 1 0 0 蛋白可能是调控m i r n a 的调控因子【3 0 3 1 1 。 由此可见，p 1 0 0 是基因转录激活因子，其作用是多角度多方面的。它是一种潜 在的多功能蛋白，但具体功能还未完全明确。 h c a ( h y d r o p h o b i cc l u s t e ra n a l y s i s ，疏水簇分析法) 能够勘查出彼此序列无任 何相关性的蛋白质在三维空间结构上的相似性。1 9 9 7 年c a l l e b a u t 等人运用这种方 法在发现了转录共激活因子p 1 0 0 蛋( 3 4 个重复的葡萄球菌核酸酶同源性结构域 s n ( s t a p h y l o c o c c a ln u c l e a s e s ，s n ) ，以及随后的一个t u d o r - s n ( t s n ) 结构域 组成的【3 2 】。目前发现p 1 0 0 蛋白出现在多种蛋白复合物中，并作为核心成员参与 基因转录调控以及r n a 的代谢调节。作为转录激活因子，p 1 0 0 蛋白主要是以s n 结构域作为蛋白结合区域，将转录相关因子与基本转录元件结合在一起，从而 参与转录调控。目前对于p 1 0 0 蛋 刍t s n 结构域的功能的了解甚少。但是由于t s n 结构域具有高度保守性的，其同源片段可出现于多种其它的蛋白之中，因此可 以据此推测其功能。p 1 0 0 蛋白中的t s n 片段与s m n ( s u r v i v a lo f m o t o rn e u r o n ，运 动神经元生存蛋白) 的t s n 片段具有高度相似性。而s m n 就是一种调控基因转 录和p r e m r n a 剪接加工的双重功能蛋白。首先，s m n 可以直接或间接地作用于 转录相关因子，例如核转录激活因子e 2 t 3 3 l 。其次，s m n 中t s n 片段能够与剪接 3 天津医科大学硕士学位论文 体s m 蛋白结合，参与s n r n p 的组装，并直接参与p r e m r n a 的剪接加工，因此s m n 也被认为是剪接因子1 3 4 _ 5 1 。p 1 0 0 蛋白因为含有相似的t s n 结构域，而可能具有 参与剪接加工的功能。我们课题组采用非变性胶电泳观察剪接体复合物体外组 装的情况证实p 1 0 0 蛋白因为参与了剪接体的组装和活化而促进p r e m r n a 剪接 反应的可能性。实验发现它只具有提高剪接反应效率的作用。而且在有关p 1 0 0 蛋白在剪接反应中作用时间的研究可见，反应开始后l o 分钟剪接产物的量与对 照组相比并没有差别，明显的差别是从2 0 分钟开始的，提示p 1 0 0 蛋白在剪接过 程中与其他因子相互作用需要一定时间。研究证实p 1 0 0 蛋白的加入对所有三种 剪接体复合物的形成都有促进作用，特别是对于复合物a 的形成作用更为明显。 进一步观察发现p 1 0 0 蛋白t s n 片段而非s n 片段参与并促进剪接体的形成。其机 理可能是p 1 0 0 蛋白有募集u 4 u 6 u 5 s n r n p 至p r e m r n a 的功能，从而促进复合物 a 到复合物b 的转变。而且p 1 0 0 蛋白参与了剪接体的组装和活化过程这一结论正 好和相关的u 5 s n r n p 蛋白的功能一致。u 5 s n r n p 蛋白在剪接体的聚集过程中和 p r e m r n a 剪接反应中发挥着重要作用。u 5 s n r n p 蛋白有助于剪接体在第二步剪 接反应中对外显子的定位。观察发现p 1 0 0 蛋白参与并促进剪接体的形成。但机 制还不明确。经本课题组的前期研究发现p 1 0 0 蛋白与剪接体的u 5 s n r n p 蛋白中 h p r p 8 ，h b r r 2 和u 5 1 1 6 结合。h p r p 8 ，h b 丌2 和u 5 11 6 三者之间存在蛋白水平上的作 用，其 p 1 0 0 蛋白的t s n 片段与h p r p 8 的功能片段2 ( 3 0 3 a a - 6 6 8 a a ) 直接结合。本 研究的主要目的在于研究p 1 0 0 蛋白与u 5 1 1 6 蛋白之间特异的结合方式和结合位 点，通过蛋白一蛋白相互作用研究，探讨p 1 0 0 蛋白参与并促进p r e m r n a 剪接加 工过程的机制，为随后p 1 0 0 蛋白功能的研究奠定基础。 卜一 1 6 3 9- - - - o 1 一6 4 0 8 8 5 卜一p 1 0 0 s n i _ 一p 1 0 0 一t s n 图1p1 0 0 蛋白的结构示意图 f i g lt h es c h e m a t i cf i g u r eo fp 1 0 0p r o t e i ns t r u c t u r e t h es t r u c t u r eo fp 1 0 0 p r o t e i nw a sd i v i d e di n t of i v ep a r t s ，i n c l u d i n gf o u rr e p e a t e ds nd o m a i n s a n do n e t s nd o m a i n t h es nd o m a i ni sr e l a t e dt o p r o t e i n - p r o t e i n i n t e r a c t i o na n d a c t i v a t et r a n s c r i p t i o n 研究目的、方法 4 天津医科大学硕士学位论文 为了验证我们有关p 1 0 0 蛋白功能的设想，本研究分为三个实验部分。第一 部分为h p r p 8 蛋白与p 1 0 0 蛋白，u 5 1 1 6 蛋白结合片段的确定。我们利用g s t 融合蛋白钓取体外翻译带有3 5 s 标记的p 1 0 0 蛋白，u 5 1 1 6 蛋白，通过放射自显 影观察两者的结合片段。第二部分是p 1 0 0 蛋白与u 5 ，1 1 6 蛋白在细胞内的结合。 首先构建p e g f p c i u 5 11 6 重组质粒，利用c o i p 技术研究p 1 0 0 蛋白与u 5 1 1 6 蛋白之间的作用。再构建p e r f p c i p 1 0 0 重组质粒，利用激光共聚焦显微镜研 究p 1 0 0 蛋白与u 5 1 1 6 蛋白的定位情况。第三部分为了进一步确定p 1 0 0 蛋白与 u 5 1 1 6 蛋白结合的部位。使用g s t 融合蛋白钓取法和w e s t e r nb l o t 技术检测是 p 1 0 0 蛋白的s n 功能片段还是t s n 功能片段与u 5 1 1 6 蛋白结合。研究发现p l o o 蛋白，u 5 1 1 6 蛋白能与h p r p 8 蛋白体外直接结合，但结合部位不同。p 1 0 0 蛋白 通过t s n 片段，与u 5 1 1 6 蛋白结合。提示p l o o 蛋白通过与h p r p 8 蛋白，u 5 1 1 6 蛋白相互作用，参与促进剪接加工过程。 天津医科大学硕士学位论文 一、探讨h p r p 8 蛋白与p 1o o 蛋白，u 5 - 116 蛋白相互结合 的功能片段 我们的前期研究发现，h p r p 8 蛋白与p 1 0 0 蛋白，u 5 1 1 6 蛋白在细胞内可以 结合，这种结合是一种稳定的结合。那么，蛋白质的哪个或者哪几个结构域参 与了三者之间的结合作用呢? 为了解决这个问题，我们开展了h p r p 8 蛋白与p 1 0 0 蛋白，u 5 1 1 6 蛋白体外实验。 为了研究h p r p 8 蛋白与p 1 0 0 蛋白，u 5 1 1 6 蛋白相互结合的结构片段，首先 需要构建相关质粒，即含有h p r p 8 不同结构域的g s t 融合蛋白表达质粒。 r ，实验一构建g s t - h p r p 8 功能片段重组质粒 惭实验一姗二裂晏罨嚣鋈蓄磊蠢暑腓外翻译黝 l实验三利用g s t 融合蛋白钓取法结合蛋白质体外翻译系统 研究h p