（作物遗传育种专业论文）抗寒相关基因cbf3、ice1以及atgols3的转基因拟南芥耐寒效果评价.pdf

摘要 低温冷害使许多植物生存受到严重危害，全球每年因低温冷害造成的农作物损失高 达数千亿元，提高植物抗寒能力的研究具有重要的理论意义和现实意义。本研究采用 p c r 方法从拟南芥 阳6 翻叩s 括珐础以胛矽中分离受低温诱导的c b 丹( c r e p e a tb i i l d i n g f a c t o r3 ) 、脱jn n d u c e ro fc b fe x p r e s s i o n1 ) 、4 糨他油i d o p s i sg a l a c t i n o ls y n m a s e 3 j 三种抗寒相关基因和c b 乃冷诱导启动子c p 。将c p c b f 3 置于植物表达载体 p c a m b i a l 3 0 0 中，构建侧基因冷诱导表达载体p c a c p c b f 3 ；然后将带有组成型 启动子的肌醇半乳糖苷酶基因么f g ，d 鼬和抗寒基因j c e j 分别合并于p c a c p c b f 3 中， 构建了两个双基因植物表达载体p c a c p c b f 3 3 5 s a t g o l s 3 和p c a c p c b f 3 3 5 s i c e l ，其中c 基因冷诱导表达，彳f g d 册和亿匹j 基因过量表达。以上三 种重组质粒转入农杆菌g v 3 1 0 l 中，并利用真空抽滤法导入拟南芥中，经5 0 m 班的潮 霉素( h y g ) 抗性筛选，得到t 4 代单拷贝插入纯合子植株。 将野生型拟南芥与耐寒基因转基因拟南芥纯合子从r t - p c r 、叶绿素含量、相对电 导率和脯氨酸含量等四个抗寒性生理生化指标进行抗寒性评价。实验结果表明，单基因 p v k h 3 5 s a t g o l s 3 转拟南芥和联合双基因p v k h 3 5 s - c b f 3 - 3 5 s a t g o l s 3 转化拟南芥 的抗寒能力均比野生型拟南芥强；而联合双基因转化拟南芥的抗寒能力又比单基因转拟 南芥强。 关键词：c b 乃基因j c z j 基因彳f g o 五站基因拟南芥 抗寒性 a b s t r a c t c o l di sas e v e r e 是c t o rt oa 氐c tp l 觚ts u r v i v a l e v e r yy e 碣h u l l d r e d so f b i l l i o n sr m b h a v eb e e nl o s ti nc r o p sc a u s e db yc o l dh u r ti nt h e 、v o r d t h u s ，i m p r o v e m e n to fp l a n tc o l d t o l e r 觚c ei ss i 鲥矗c a n t i nt h i sr e s e a r c bt h r e eg e n e so f 乃、彳f g d 埘a n d 观jg e n e s r e l a t i n gt oc o l dt o l e r a n c e ，a n d o n ec 0 1 di n d u c i b l ep r o m o t e ro fc pa tu p s t r e a mo f c 召f 3w e r ei s o l a t e d 丘o m 么，口6 f 矗印s 括珐口z 幺聍口b yl m p c r t h ec o m b m a t i o no fc p - c b f 3 w a si n s e r t e dt 0t h ep l a n te x p r e s s i o nv e c t o ro fp c a m b i al30 0 ，w h i c hr e s u l t e d i n p c a c p c b f 3 彳，g d z s 3a n d 伦e jw i t h3 5 sp r o m o t e rw e r ei n s e r t e dd o w ns t r e a m o fc p c b f 3 ，r e s p e c t i v e l y ； w h i c h p r o d u c e d t w o b i - g e n ee x p r e s s i n g v e c t o r so f p c a c p c b f 3 35 s a t g o l s 3a n dp c a - c p - c b f 3 3 5 s i c e l t h et h r e ee x p r e s s i o n v e c t o r sw e r et r a n s f o r m e di n t o 彳朋撕叠唧括砌口妇，z 口b yv a c u u mi n f i l t r a t i o na n d s e l e c t e do nt h em sm e d i u mw i t h5 0 m g 兀h y 伊o m y c i n a r e rt h r e eg e n e r a t i o n s ， s e v e r a ls i g n a ll o c u sa n dh o m o z y g o t e1 i n e sf b re a c he x p r e s s i n gv e c t o rh a v eb e e n o b t a i n e d t h ee v a l u a t i o no fc o l dt o l e r a n c ei nt 啪s g e n i c缸a b i d o p s i so fp c a c p - c b f 3 ， p c a c p c b f 3 3 5 s a t g 0 1 s 3 a n d p c a c p c b f 3 3 5 s i c e l h a sb e e n d o n e t 1 1 r o u 曲 c o m p 撕n gg e n ee x p r e s s i o n ，r e l a t i v ee l e c t r i c a lc o n d u c t i v 时a n d t h ec o n t e n to fc h l o r o p h y ua n d p r 0 1 i n ew i t l lt h a ti nw i l dt y p ea r a b i d o p s i s t h er e s u l t s s h o w e d 廿1 a tm ec 0 1 dt 0 1 e r a n c eo f 仃孤s g e l l i cm a b i d o p s i so fp v k h - 3 5 s - a t g o l s 3 觚dp v k h 一3 5 s c b f 3 - 3 5 s a t g o l s 3 w a s s t r o n g e rt 1 1 a nw i l dt y p ec o l 啪b i a ；m e a i l w l l i l e ，m a tw a ss t r o n g e r i i ld i g e n ee x p r e s s i n g p 础i d o p s i st h a ni ns i n g l e g e n ee x p r e s s i n ga t a b i d o p s i s k e yw o r d s ：c ! 引叼g e n e ：彳f g o 五四g e n e ；j jg e n e ； 爿阳6 谢叩s 缸珐口肠”口； c o l dt o l e r 飙c e h 缩写词( a b b r e via tio n ) 缩写 a m p 英文名称 a m p i c i l i n k a n k a n a m y c i n b p c a r b c e f b a s ep a i r c a r b e n i c i l l i n c e f a z o i i n 砒fr i f 锄p i c i n s t r s t r e p t o m y c i n h y gh y g r o m y c i n l b m s n a a 6 b a r p m c t a b l u r i a b e r t a n im e d i u m 中文名称 氨苄青霉素 卡那霉素 碱基对 羧苄青霉素 头孢霉素 利福平 链霉素 潮霉素 l b 培养基 m u r a s h i g ea n ds h o o gm e d i u mm s 培养基 a c e t i ca c i d 6 b e n z y i a n i n o p u r i n e l u x r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e 萘乙酸 6 一苄基氨基嘌呤 勒克司 转分钟 e t h y i e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d乙二胺四乙酸 e d t a c e 够lt r i e t h y l a m m o n i u m d n t p p c r t a q 十六烷基三甲基溴化胺 d e p 科r i b o n u c i e o s i d et r i p n o s p h a t e 脱氧核苷三磷酸 p o l y m e 豫s ec h a i nr e a c t i o n聚合酶链式反应 t h e r m u sa q u a t i c u sd n a p o l y m e r a s e嗜热水生菌d n a 聚合酶 5 5 海南大学学位论文原创i 生声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下。独立进行研究工作所取 得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写 过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律结果由本人承担。 黼粼：钟哥虹 日期：嬲年多月乡日 学位论文版权使用授权说明 本人完全了解海南大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权海南大 学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文，本人在导师指导下完成的论文成果，知识产权归属海 南大学。 保密论文在解密后遵守此规定。 论文作者躲计壮导师张涨孝 日期：2 彩年易月岁日日期：如喈年；月，日 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的学位论 文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中规定享受相关 权益。回意论文提交丘溢丘；口堂玺：口= 玺；口三生蕴杰。 篙嚣蓖磬 日期：a 鼬多年莎月岁日 导师签名： 日期：触纡月日 1 前言 1 1 植物抗寒 植物细胞有着精细的内在结构，生物膜将各种细胞器有序隔离以保证细胞正常的代 谢功能。植物的抗寒性与细胞结构，特别是膜结构的稳定性有着密切的关系。植物遭受 低温胁迫时，膜脂物相发生改变，由液晶相变为凝胶相，膜脂上脂肪酸的排列趋向有序， 膜的外形和厚度发生变化，膜上产生龟裂而膜透性增大，以及膜结合酶结构改变( l y o n s e f 口，1 9 7 0 ) 。膜的性质、结构和相变可能是寒害原初反应的重要指示，而在遗传基因控 制的范围内，膜脂成分的不饱和度以及细胞质粘度和流动性可作为抗寒的重要生理指标 ( 沈漫等，1 9 9 7 ) 。低温胁迫下，细胞的超微结构也表现明显的变化，叶绿体由梭形变为 圆形，类囊体、高尔基体空泡化，细胞染色质凝集等( 简令成，1 9 8 7 ) 。另外，植物抗 低温水平的变化与许多酶系统结构型变化、同工酶的改组及功能活力的改变亦有密切关 系( 沈漫等，1 9 9 7 ) 。特别是零下低温对植物细胞的伤害更大，植物体内开始通常发生 胞外结冰，从而导致细胞壁和原生质膜的机械损伤。细胞内发生一系列生理代谢功能紊 乱，冰冻脱水引起细胞收缩塌陷，使许多与膜结合的功能蛋白( 酶) 脱离膜的保护，丧 失功能，细胞内可溶性蛋白质沉淀、盐份毒害及冰冻脱水引起的次生干旱等。当温度降 低到一定程度时，将发生胞内结冰，从而最终成为不可逆伤害导致整个植株死亡 ( t h o m a s h o w 。1 9 9 8 ) 。 1 2 植物抗寒基因工程概述 1 2 1 植物抗寒基因工程 低温是一个很重要的环境因子，它在很大程度上影响了植物的生长、发展、生存及 分布。热带和亚热带的许多重要作物和水果，如水稻( d ，弘口s 口r f ，口) 、玉米( 历口聊a 筘) 、 西红柿西，c 叩p 船 加，2 甜掣沱，? ，“肌) 、香蕉( 朋洳口叩甜m f 口纪) 等，在低温但非冰冻条件下 ( o 1 2 ) 就会受到损害，甚至死亡。所以，植物抗寒一直是国内外研究的重点。早 期对抗寒的研究侧重于植物冷适应过程中的形态结构和生理生化，以及蛋白质的代谢， 尤其是冷胁迫过程中低温诱导蛋白的性质、结构和功能的研究。从上个世纪9 0 年代以 来，研究已深入到冷适应反应中的基因表达与调控( b a l ( e r 订口，1 9 9 4 ) 。随着植物生理 1 学、细胞学和分子生物学理论和方法的日益完善，植物冷驯化和抗寒分子机理的研究取 得了显著的进展，植物抗寒基因工程也随之得以广泛开展，目前已经发展了多种转基因 抗寒植物。用基因工程的方法培育抗寒植物正以其周期短、见效快的优点而逐渐在植物 遗传育种中占有重要地位。 目前，国内外植物抗寒基因工程主要是针对抗寒功能基因和抗寒调控基因。导入抗 寒功能基因研究策略，一方面是从植物或植物以外更广泛的物种范围获取“抗寒一基因 转入植物来打破植物遗传群体中抗寒冻种质资源缺乏的限制；另一方面是利用植物自身 的生理代谢保护机制制定相应的遗传策略，如提高植物体内不饱和脂肪酸的含量、加强 膜脂过氧化防御系统中酶的活性等。目前导入抗寒调控基因主要是围绕一种与抵抗寒冷 所导致的渗透胁迫相关的冷诱导基因转录因子c b f ( d r e b ) 展开。 1 2 2c 8 f 基因在抗寒和抗旱中的交互作用 在某种逆境条件下生长的植物，不仅具有抵抗该逆境的能力，而且还有抵抗其它逆 境的能力，这种现象称为植物的交叉适应( 马海慧等，2 0 0 3 ) 。利用基因芯片的方法分 析环境压力对基因的诱导作用时发现，植物经过干旱、盐、机械、热激等逆境胁迫后， 同时也能增强耐低温的能力。生长在干旱条件下的植物比有充足水分浇灌的植物更具有 抗寒性( k a s u g a 甜口z ，1 9 9 9 ) 。一系列研究表明，植物冰冻首先发生在细胞膜系统。低 温引起植物胞外或胞内结冰，由于胞外空间冰点较高且有一些灰尘或细菌作冰核，所以 胞外先于胞内形成冰晶，冰晶溶液比液态溶液的水势低，并且温度越低，水势差值越大， 因而胞内的水分通过质膜流出，导致细胞严重脱水。一些转基因植物在抗寒性提高的同 时其抗旱性也相应提高。其原因为植物在抗寒性增加的同时能够使细胞脱水减少，耐旱 性增加，所以植物在低温和干旱条件下反应的分子机理非常相似( s t e p o n k u se f 口z ， 1 9 9 3 ) 。许多基因如尺d 、歙d 、c 锹、”及k ，均受低温和干旱诱导( s h i n o z 出甜甜， 2 0 0 0 ；t h o m a s h o w ，1 9 9 9 ) 。s e l ( i 等利用c d n a 距阵法分析了1 3 0 0 个拟南芥基因的表达， 确认了1 9 个抗寒基因，而其中1 5 个冷诱导基因同样也能被干旱诱导( s e hm 甜以， 2 0 0 1 ) 。c b f 调节因子的基本作用是在冻害和其他涉及水分胁迫时保护细胞。过量表达 c b f j f 及c 8 乃的转基因拟南芥与对照相比不仅抗冻，而且对干旱或盐害造成的水分胁 迫也具有抗性( j a g l o o 怕s e n 甜口f ，1 9 9 8 ；l i u 甜以，1 9 9 8 ；k a s u g a p f 口，1 9 9 9 ) 。 h a k k e 等发现，在干旱胁迫条件下，删基因能被诱导表达，但在冷冻条件下，c b 尉的表 达没有变化。利用3 5 s 组成型启动子使c 召尉过量表达，能引起c 伽j 毙及c 锹7 孙的 2 组成型表达，而这两个基因是与抗寒性和抗旱性有关结果使c 删转基因拟南芥的抗 寒性和抗早性都大大提高( h 赫e f 缸，2 0 0 4 ) ( 图1 ) 。 圃婴圈圃 i 鹰翮i 学南 i、 匝叵 卜嗯_ 0 鲥h i i 生 圈1 低温和干早信号传导途径( z h a n ge t 矗上，2 0 0 4 ) f i g 1s i 印a l t 憎n s d u c 6 0 no f c o i da n dd r o u 曲t t o l e r a n c e s 1 2 3 植物耐寒基因c n 詹、c 曰f ，船及三者之间关系 低温是影响植物生长、发育及其地理分布的重要环境限制因素之。植物的抗寒性 是一种潜在的遗传特性，植物只有经过一定时间的非冻低温( 2 6 ) 驯化才具有较 强的抗寒性。植物冷驯化包括许多生理生化反应，如蔗糖、甜菜碱、脯氨酸等的增加， 脂膜变化，蛋白表达等。冷驯化是一个十分复杂的过程近二十年来，世界各地的科研 工作者围绕在冷驯化过程中植物发生的生理生化和分子水平的各种变化进行了大量的 研究。最新的研究表明至少有3 0 0 个冷反应基因参与了冷驯化进程( f o w l 盯“d 2 0 0 2 ) 。 针对如此复杂的适应过程，冷驯化研究的一个基本目标是分离和鉴定对抗寒性提高起着 关键作用的冷反应基因。随着突变分析和分子遗传学方法的大量应用，以拟南芥作为模 式植物，己经克隆了许多冷反应基因及冷调节的转录园子基因，明确了这些基因的抗寒 功能及其涉及的多种低温调控的信号传导途径。x i n 等利用化学诱变的方法获得了与拟 尽 乒 芩量上 南芥抗寒性有关的组成型突变体，突变体p s 七j 不经过冷驯化就表现出较强的抗寒性( x i i l p ，讲1 9 9 8 ) 。 1 2 3 1 足基因 冷驯化能诱导和增加一些基因的表达，使多种基因表达发生改变。这些冷诱导基因 表达的产物可分为两类：一是调控蛋白，调控寒冷信号传导、抗寒基因表达和抗寒蛋白 活性；二是功能蛋白，与植物抗寒性的提高直接相关( m o t o 抵甜口，2 0 0 3 ) 。目前已知 的植物抗寒基因主要为环境诱导表达的基因和某些组成性表达的基因。c 锹基因是冷 诱导基因，在它的启动子区域含有具有五个碱基核心序列c c g a c 的脱水反应元素d i 也 ( 沈j f l 砌f f d 刀陀印o ，2 s 如pp 彪朋e 门f ) ，d i 也做为顺式作用启动子元素，能在低温胁迫时激 活c 6 恹基因的表达( f e m a n k o 甜口z ，2 0 0 4 ) 。b a k e r 等把核心序列c c g a c 命名为c i 汀 ( c 卸p 讲) ( b a k e r 甜口，1 9 9 4 ) 。c m i 迮存在于许多低温反应基因的启动子中，如拟 南芥c 6 幔，妇、小麦矿c s j 2 d ，以及油菜b m ，5 ( j a g l o o t t o s e n 甜口，1 9 9 8 ；s t o c k i n g e rp ，口， 2 0 0 4 ；g a o 甜口z ，2 0 0 2 ；k a n a y a “耐，1 9 9 9 ) 。 1 1 1 0 m a s h o w 等研究发现拟南芥受低温、干旱或a b a 处理时能诱导c o r l 5 a 蛋白基 因表达产生1 5 k d 的多肽，此多肽与叶绿体结合后转变为9 4 k d 的多肽c o r l 5 锄 ( t 0 m a s h o w 甜口，1 9 9 4 ) 。使c o r l 5 锄多肽在转基因拟南芥中大量表达，结果是与野 生型相比转基因植物分别提高了叶绿体和原生质体的抗寒性，并增强原生质膜稳定性， 减轻寒冻损害( 挑p ，口，1 9 9 6 ) 。h u 曲e sm a 等的研究表明c o r l 5 a 家族的c 锹j 妇 基因是与其它c 锹基因相互作用而提高植物的抗寒性( h u g h e s 甜口f ，1 9 9 9 ) 。 m a ir 等将西红柿三p 乃基因转入酵母中使其大量表达后，显著提高酵母细胞抗寒 性( m a i 甜口z ，1 9 9 6 ) 。也有研究表明，大麦能够过冬可能是因为自身高含量的c 0 足j 4 ( e l e n a 甜口，1 9 9 9 ) 。m a l s a k 删h a l r a 等更将白c 伽j 9 转入烟草，和对照烟草植株相比， 转基因植株电渗值较低、发芽率较高、抗寒性有所提高( m a s a l ( a z u 订口，2 0 0 3 ) 。t u u l a p u h a l ( a i n e n 等将删b ，8 ，c o r 4 7 以及三m 9 ，m d 分别构建到植物表达载体p 朋j j ， 之后分别电击转化到农杆菌p g v 2 2 6 0 中，以此农杆菌分别侵染拟南芥，低温条件下， 转基因拟南芥植株和对照植株相比降低了l t 5 0 ，并且转基因植株的存活率也显著高于 对照植株( t u u l a 甜口，2 0 0 4 ) 。 1 2 3 2 凹f 基因 。 转录因子是指那些能专一地结合于d n a 特定序列上的能激活或抑制基因转录的蛋 4 白质。一个典型的植物转录因子包括：d n a 结合域，低聚糖位置，转录调节区域和一 个核酸定位信号( m i c h ep ，日，1 9 9 9 ) 。拟南芥基因组编码至少1 5 3 3 种转录因子，大约 占其总基因数的5 9 。c 职转录因子的发现是近年来植物抗逆研究方面最具突破性的 进展。拟南芥的a 妒基因家族包括删，c b 刀，丹和刚( g i l m o u r 甜口，1 9 9 8 ： m e d i n a 甜口z ，1 9 9 9 ) 。c b 川，c b 心和c 鹏基因聚集在拟南芥4 染色体的短臂上，并 且是串联在上面的( s l l i n w a r i 甜口z ，1 9 9 8 ) ，c 职2 、伽与c 踟的基因序列有较高的 同源性，分别为8 1 和8 4 ，而c 8 心定位在5 染色体上( h a a k e “盘z ，2 0 0 2 ) 。删， c 8 刃和侧三种基因的强表达使拟南芥生长缓慢，花期延迟，脯氨酸和蔗糖含量增 加，同时使拟南芥抗寒性也得到定提高( s a r a l l 甜口，2 0 0 4 ) 。这三种凹f 能结合到 c 伽基因的d i 汪序列上，从而诱导一系列尺基因的表达，因此有人把c b f 转录因 子看作低温时激活一些c 锹基因的开关。目前已发现c 竹调控的抗寒基因至少有十几 表电。粤n ：r d 2 9 a 、i t i 7 8 、c o r 7 8 、c o r l 5 n 、k i n 2 、c o r 6 6 、e r d l o 、醢n l 、r d l 7 、c o r 4 7 、f t 3 5 a 3 、 月5 7 7 、月5 舛、刚2 7 、朋5 2 j 2 2 、p 朋4 。飚r s t e nr 等将拟南芥中分离得到的c b f l 蛋白基因导入未经冷驯化的拟南芥中，诱导其冷诱导基因在常温下表达( k i r s t e n 甜露，。 1 9 9 8 ) 。研究者尝试用组成型启动子c 州v 3 5 s 启动c 删和冷诱导基因砘鲥含d r e 的启动子启动c 尉吖，结果两者在转基因植物中均有表达，且提高植物抗寒力( k a l s u g a 甜口，1 9 9 9 ) 。t h o m a s h o w 等将c b 硝连上c 小3 5 s 启动子转入拟南芥，检测未经低温 处理的转基因植株发现：c b 几持续强表达诱导了厄6 、c d ，毙、c d 一7 和c d ，钙基因 的表达，提高了拟南芥植株的抗寒性( t h o m 砒o w2 0 0 1 ) 。随后s h i n w a r i 对拟南芥做了 类似的试验，证明了f j 过量表达除了能提高植株抗寒性外，还能提高植株对干旱的 抗性，故又把c b 几命名为d 尺e 肋。c 口f ，c 腑和c b 丹基因又分别被称为d r 船j 6 ， 脚肋j c 和删，口。金建凤等利用农杆菌介导法成功地将拟南芥抗寒转录激活因子基 因c 。删转入粳稻中花1 1 中，获得了t 1 代转基因植株，删基因及筛选基因h y g ( 潮霉素抗性基因) 均在t 1 代中检测到。常温和低温处理之后，t 1 代植株体内的脯氨 酸含量均比野生型明显提高，同时，耐低温表型也在t 1 1 株系中出现( 金建凤等，2 0 0 5 ) 。 近年来，在冷敏植物玉米、番茄中也克隆到了c 研吖类似基因，拟南芥c e w 转基因番 茄的实验结果表明拟南芥f j 能调节与抗寒性有关的c 么r 基因的表达，转基因番茄 的抗寒性大为提高。因此，玉米、番茄等冷敏植物c 召几类似基因的研究及其在抗低温 品种改良中的应用近年来受到重视。在番茄表达序列标签数据库中发现有c 曰f 的同源 序列，从番茄c b f 类似基因d n a 序列推测的氨基酸序列与拟南芥c 剧吖有5 3 的同源 性( h s i e h 甜口，2 0 0 2 ) 。 侧在拟南芥胁迫抗性中起重要作用，m o t o a l ( is e l ( i 的实验表明在渊被破坏 的拟南芥植株中c 艿用和删的表达增强，这表明：僦是c 引町和c 引吁表达的 一个负调节子。伽j 和c 鹏转录方式非常相似，低温处理拟南芥植株1 5 池后它们 的转录开始增加，9 0 m i n 积累量最大，随后转录水平急剧下降，c 引叼的转录以较低的 速率积累，低温处理2 5 h 才达到最大，然后转录水平逐渐降低，这表明和c 8 乃 对低温的反应领先于c 脚2 ：常温条件下，拟南芥中c b 刃的转录水平比c 删和c b 乃 高5 8 倍，这和以上提出的c 引叼是c 聊和c 鹏表达的一个负调节子是一致的。 常温条件下侧的含量高而且稳定，抑制了c 删和伽的表达；低温时，某种激 活因子如亿e ，可能诱导c 8 f ，和伽快速地从c 引叼抑制中逃逸，侧和c 引吁表 达后刺激它们下游各自的目的基因表达，从而提高植株的抗寒性。 拟南芥中的c b 乃能刺激四十多种胁迫诱导基因的表达，如耽9 ，c d ，鲥，一7 等，l i uq 等从玫瑰中分离得到d r e 结合蛋白c b f 3 的c d n a ，并将删的c d n a 转 入拟南芥中，极大提高拟南芥抗寒力( l i u 甜讲，1 9 9 8 ) 。而k a u s u g am 的研究表明用冷 诱导基因耽鲥的含d i 也的启动子启动侧以及用组成型启动子3 5 s c 心启动 c 鹏或刚在转基因植物中均有表达，且提高植物抗寒力( k a s u g a 甜口，1 9 9 9 ) 。 n o m a s h o w 等将拟南芥中的c b 乃基因分别连上c 心3 5 s 启动子、冷诱导启动子 加姐，利用农杆菌介导法转化烟草，二者都提高了烟草植株的耐低温能力。严海燕等 发现c 引吁基因过量表达对细胞质膜蛋白总含量和膜脂总含量有提高作用，转有c b 乃 基因的f 3 6 植株细胞膜膜蛋白总含量、膜脂总含量、单位膜蛋白的膜脂含量均高于对照， 分别提高了9 0 、1 2 7 和1 8 ，差异均为极显著，表明c b 乃基因在细胞膜组成方面 起关键作用( 严海燕等，2 0 0 4 ) 。油菜和拟南芥的亲缘关系较近，即使与拟南芥的亲缘关 系更远的植物大麦、小麦和黑麦中也存在c 职类似基因。此外，从大麦的c d n a 文库 中筛选出c 引呵基因，并且定位在大麦的5 号染色体上，能诱导大麦c 伽基因的表达 从而提高植株的抗寒性( c h o ip f 口，2 0 0 2 ) 。 1 2 3 3 咒e j 基因 低温条件下，转基因拟南芥植株的f 转录因子的转录水平在低温1 5 m i n 内增加， 而c 锹基因在2 4 h 转录增加，这充分表明低温时f 转录因子先转录，然后c 锨 基因才转录。c 卯基因不能自动调节，因为它们的启动子中不存在d r e c i 玎核心基序： 6 c c g a c ，并且c 删的强表达未导致锄转录增加。因此，a 泸基因对低温的诱导 反应包括c b f 激活因子( 的改变，i c e 是一个和诱导a 珂基因表达有关联的蛋白质。 最近，鉴定出一个拟南芥类似b h l h 转录激活因子叫圮e j ，c e j 编码一个类似m y c 的b h l h 转录因子，亿冱j 结合到删启动子上的m y c 识别序列。托匹j 是这个级联 反应的一个上游因子，i c e l 蛋白的冷诱导改变和转录协同因子的冷诱导改变可能对于 尬j 激活侧的表达来说是必要的。c h i i m u s 踟y 等的研究结果表明肼，是c 腑 的一个正调节子并且托冱j 在冷诱导中起重要作用，j c e 常温钝化，在低温时能特定地 结合到伽的启动子序列上，诱导c b 乃的表达，而后c 召丹结合到其下游目的基因 启动子的d r e 序列上，诱导c 伽的表达，从而提高植株的抗寒性。他们已经从拟南芥 中克隆到庀e ，并且连上c 蝴v 3 5 s 启动子，利用农杆菌介导法转化拟南芥，获得了 含此冱j 基因的转基因拟南芥植株，通过检测证实转基因拟南芥植株的抗寒性有很大的 提高( c 1 1 i 1 1 1 1 u s 锄y 甜口，2 0 0 3 ) 。 b y e o n g - h al e e 等利用拟南芥2 4 ，0 0 0 个基因组成的基因芯片鉴定出拟南芥基因组 中存在9 3 9 个冷调节基因，即3 9 的拟南芥基因被确定为冷诱导的，其中6 5 5 个为冷 上游调节基因、2 8 4 个为冷下游调节基因( b y e o n g - h a 甜口f ，2 0 0 5 ) 。冷下游调节基因在 拟南芥冷反应中起作用，下游调节对于冷胁迫可能不起主要作用。在低温早期，上游调 节的基因对于其靶基因的上游调节和下游调节都很重要。 f c p j 是拟南芥中的圮e j 基因被破坏的突变体，低温条件下，和对照( j 基因未 被破坏的拟南芥植株) 相比，耙p j 中大约4 0 的冷调节基因的转录发生改变。b y e o n g h a l e e 等通过检测野生型和七p j 中冷调节基因表达的基础水平发现：在f c p j 中，9 3 9 个冷 调节基因中的2 0 4 个基础转录水平发生改变。值得关注的是，缸p ，中许多冷调节基因的 基础转录水平高于野生型中冷调节基因的基础转录水平；此外，招p j 中基础转录水平较 低的冷下游调节基因数目比野生型中基础转录水平较高的冷下游基因数目多。结果表 明，野生型i c e l 蛋白对于维持冷上游和冷下游调节基因的基础表达起重要作用。记p j 中较低转录水平的冷调节基因数目大约是较高转录水平的冷调节基因数目的2 倍；七p j 中较高比较低转录水平的冷下游调节基因的数目多，这和上面提到的f c ej f 中基础转录 水平相反，表明肥e j 在激活基因表达和调节下游基因方面均发挥重要作用。 最近，伽和c b 乃靶基因已通过转基因拟南芥确定。拟南芥c b 乃和僦靶 基因中有1 0 2 个为冷上游调节基因，b y e o n g - h al e e 等在f c e j 中鉴定的9 3 9 个冷诱导基 因中有7 4 个为冷上游调节基因。这7 4 个基因中包括：6 个c 口乃特定靶基因，1 8 个 7 c 脚眩和c 召乃共有靶基因，5 0 个伽特定靶基因。在记p ，中，6 个c b 乃特定靶基 因中的4 个表达发生改变，而5 0 个伽特定靶基因中的1 9 个表达发生改变。在泐j 中1 8 个和伽共同具有靶基因中1 5 个表达发生改变。结果表明，f c p j 对c 职 靶基因有明显作用，特别对于c b 乃，在f c p j 中c 口乃未冷诱导的靶基因与野生型拟南 芥中的靶基因相一致。 低温胁迫早期，缸p j 中仅有一个转录因子是下游调节的，说明植物中的冷反应从转 录激活开始，而不从基因的反应开始。在低温后期，其它转录因子的转录可能是转录激 活因子早期刺激这些转录因子的结果。鉴定新的冷调节基因并且确定冷胁迫条件下 圮e j 对整个基因表达过程的机理。这个信息为进一步探索低温条件下基因调节的网络 奠定了基础；同时为进一步通过突变体分析、转基因过量表达和其它分子、细胞生物途 径确定冷反应基因在抗寒性方面的功能奠定了基础。 1 2 4 植物抗寒基因工程的转基因研究 迄今为止，植物抗寒基因工程的研究主要在5 个方面取得了成果：( 1 ) 鱼类抗冻基 因途径；( 2 ) 脂肪酸去饱和代谢关键酶基因途径：( 3 ) 脯氨酸基因途径；( 4 ) s 基 因途径；( 5 ) 糖类基因途径。以下逐一加以介绍。 1 2 4 1 抗冻蛋白基因及其转基因植物 近年来，人们对植物抗寒基因进行了深入的研究，揭示出植物抗寒性除受多基因协 同控制外某些单基因也起了重要作用，这些单基因有可能用于植物抗寒基因工程。在不 影响作物产量、品质的情况下，利用植物转抗冻蛋白基因手段培育抗寒品种已成为一条 全新而有效的途径。抗冻蛋白( a j l t i f r e e z ep r o t e i n ，a f p ) 是2 0 世纪6 0 年代从极地海鱼 的血清中发现的一种具有阻止体液内冰核的形成与生长、维持体液的非冰冻状态的高效 抗寒活性物质。抗冻蛋白最早是d e 、，r i e s 在极区海鱼淋巴中被发现，是一类抑制冰晶生 长的蛋白质，能以非依数性形式降低水溶液的冰点而对其熔点影响甚微，从而导致水溶 液的熔点和冰点之间出现差值，这种差值称为热滞活性，因而a f p s 亦称为热滞蛋白 ( d e v i r e sp f 口，1 9 8 6 ) 。有研究发现甘油和柠檬酸能提高抗冻蛋白的热滞值( 加1 d o 舾e f 以，1 9 9 8 ) 。而抗冻蛋白具有稳定膜结构和细胞的功能( m e l a n i e 甜a z ，2 0 0 2 ) 。而且，抗 冻蛋白存在于不同的生物体中，包括鱼类、昆虫和植物，而鱼类抗冻蛋白研究的较多 ( e w a r tp f 口z 。1 9 9 9 ) 。 8 1 2 4 1 1 鱼类a f p 及转鱼类4 即基因植物 对鱼类a f p 的研究较多并且起步较早，早在2 0 世纪7 0 年代初期就已经从海洋鱼 类的血清中发现了抗冻蛋白，并且已作了比较系统深入的研究。g e o 唱e sf 等将人工合 成的黄盖鲽鱼彳卯基因导入玉米原生质体，在植物细胞中获得了表达( g e o r g e s 甜甜， 1 9 9 0 ) 。k u r k e l ss 等从经4 或a b a 处理的拟南芥中分离到2 个基因砌j 和船以，两 个基因对应的蛋白质同冬比目鱼的a f p 结构相似，推测这两个基因可能具有一定的抗 寒基因性质( k u r k e l a 订口，1 9 9 0 ) 。有研究者利用农杆菌将比目鱼体内彳口基因转入番 茄，结果表明这种转基因番茄的组织提取液在冰冻条件下能有效阻止冰晶增长 ( h i 曲t o 、v e r 甜口，1 9 9 1 ) 。在南极海绵( 而肌甜f 胛p 抛6 口珈讹瑚西) 中，可以纯化到一种 亲水提取物，经高压气相色谱多次纯化后分析表明此亲水提取物包含某些抗冻蛋白 ( w i l k i n s 口正，2 0 0 2 ) 。朱晔荣等从加拿大引进了美洲拟鲽( n p 甜面p 彪“，d ，2 p c 抛s 口聊p r f ( 舰脑) 抗冻蛋白，进行转化烟草的研究，结果表明表达的a f p 和植物抗寒性的各项生理指标 呈正相关性( 朱晔荣等，2 0 0 3 ) 。 1 2 4 1 2 昆虫a f p 及转昆虫a f p 基因植物 昆虫具有不同于鱼类抗冻蛋白的独特的抗冻蛋白结构，结构呈多样性( g r a e t l l e r 订 口，2 0 0 0 ；l i o up ，口，2 0 0 0 ；a n t i 仔e e z e 甜口，2 0 0 2 ) ，然而却执行着同样的抗寒功能。一些 越冬的昆虫体内存在超活性的a f p ，维持其体液的过冷状态。目前昆虫中抗冻蛋白的分 离纯化主要在三种昆虫中开展，分别为黄粉虫、美洲脊胸长椿、枞色卷蛾。由于昆虫 a f p 的热滞活性明显高于鱼类和植物，其彳即基因的导入可能更有效地提高转基因植 物的抗寒性。冬季某些昆虫血淋巴的热滞活性为3 6 ，最高达到8 9 ，明显高于 与血清抗冻蛋白的热滞活性( 1 2 ) 。 从甲虫和云杉卷叶蛾中分离到的抗冻蛋白的活性是鱼类抗冻蛋白的l o 1 0 0 倍 ( t y s h e n k oe f 口，1 9 9 7 ) 。黄永芬等将美洲拟鲽抗冻蛋白基因整合在t i 质粒上，然后用 花粉管通道和子房注射方法将其导入番茄中，对d 1 、d 2 代进行d n a 印迹分析，获得 了杂交带( 黄永芬等，1 9 9 7 ) 。田间抗寒性试验表明，转基因植株在低温下的生长势优于 对照，致死温度也比对照降低了2 。赵晓祥等同样利用美洲拟蝶4 胁的基因转入到 番茄中，并检测d 4 代植株在低温条件下过氧化氢酶，过氧化物酶，超氧化物歧化酶的 活性。实验显示：转么即s 基因的番茄植株在苗期低温锻炼中，3 种酶活性均明显高于 9 对照未转基因的植株，表明转基因植株在生理生化水平上获得了有益的变异，且抗寒性 增强。在进一步测定d 4 代苗期致死温度的实验中，发现转基因组的致死温度较未转基 因的对照组明显降低1 2 ( 赵晓祥等，1 9 9 8 ) 。在第一次将云杉蚜虫彳即基因与 c a m v 3 5 s 及胭脂碱合成酶基因组成重组基因后转化烟草后，发现转基因烟草中质外体 云杉蚜虫a f p 的表达能抑制冰重结晶，并且提高了热滞值( h o l m b e 唱甜口，2 0 0 1 ) 。 c o n g m i n “等从云杉蚜虫中分离得到抗冻蛋白c a j f p 5 0 1 ，并且分析出此蛋白的结构 ( ( 新f r hp f 口，1 9 9 2 ) 。 1 2 4 1 3 植物a f p 及转植物爿即基因植物 与鱼类和昆虫抗冻蛋白相比，植物a f p 研究得较晚。直到1 9 9 2 年加拿大g r i m t l l 第 一次提出从经过低温处理的冬黑麦中发现内源a f p 。u r m t i ame 等也发现植物比动物 中存在a f p 更普遍，是抗寒植物对冬季低温较为普遍的适应机制( u r m t i ae f 矗，1 9 9 2 ) 。 d u m a n 等人发现欧白英肠“朋幽妇朋绷) 的茎汁液表现了抑制重结晶的活性，通过免 疫印迹证明该茎汁液与黄粉虫( t e n e b r i o m o l i t o r ) 的a f p s 有共同的抗原决定位点( d u m a n 甜以，1 9 9 3 ) 。在进一步的实验中，从欧白英的冬季枝条中分离到分子量为6 7 l 的抗冻 糖蛋白( a f g p ) 富含甘氨酸( 占2 3 7 ) ，用p 半乳糖酶处理该a f p s 后其抗寒活性随之消 失，表明半乳糖是该a f p s 抗寒活性的关键组成部分( d u m a i l ，1 9 9 4 ) 。将植物凝集素和 a f p 共同构建到植物转化载体p k y l x 3 5 s 中，之后转化马铃薯中发现，在一2 条件下， 未转基因马铃薯叶片的电渗值比转基因马铃薯叶片的高2 倍多，而且未转基因植株遭受 了严重的冻害( j 锄e s 甜口，1 9 9 7 ) 。w a i l i s 按照w i n t e m o u n d e r l 中成熟a f p 的氨基酸序 列人工合成了一段基因，并接上信号肽，以使其定向表达于质外体( w a l l i s 甜口，1 9 9 7 ) 。 该基因被转入马铃薯后，用免疫杂交的方法检测到了表达产物a f p 。对马铃薯叶片电解 质释放量的分析表明，转基因蛋白表达水平与冰冻忍耐程度之间存在着相关性。这是第 一次对转基因植物进行a f p 的表型鉴定。 直到1 9 9 8 年1 0 月，d a 、v n w o r r a l l 在s c i e n c e 上发表了胡萝卜a f p 及其基因的研究 论文( w 6 r r a l l 甜口z ，1 9 9 8 ) ，标志着第一个植物爿即基因的发现，并且将此彳即基因连 接在表达载体上，之后转化烟草，获得了表达并且产生了a f p ，提高了转基因烟草植株 的抗寒性。m e y e 采用c a m v3 5 s 启动子，用农杆菌介导胡萝卜彳即基因重组子转化拟 南芥( m e y e rp ，口，1 9 9 9 ) 。在相同条件下，3 8 个转基因株系与野生株相比无表型差异。 n o n l l e m 印迹显示彳即基因转录水平高。转基因植物提取液有明显的抗冻活性，能够 1 0 修饰冰晶形态，抗寒活性与彳丹，基因转录水平呈正相关。m i c h a e l 从桃树( 办“刀唧e 憎纪口) 的树皮中提取到一种脱水蛋白p c a 6 0 ，这是第一次发现具有脱水素蛋白特性的抗冻蛋 白，其富含赖氨酸、甘氨酸，分子量为5 0 k u ，具有较强修饰冰晶的能力( m i c h a e l 甜口， 1 9 9 9 ) 。最近克隆到的植物抗冻蛋白基因还包括黑麦草1 1 1 7 l 的a f p 的c d n a ( s i d e b o t t o m 甜口，。2 0 0 0 ) ，冬黑麦中3 1 1 7 k d 的a f