（内科学专业论文）多种乙型肝炎病毒突变株可调控性表达细胞系的构建.pdf

i 、l ：、1 1 l 目录 中文摘要l 英文摘要5 研究论文 引言1 0 第一部分 前言1 3目u 百1 3 材料与方法1 4 结果1 8 附图2 0 讨论2 6 小结2 7 参考文献2 7 第二部分 前言2 9日u 吞2 9 材料与方法2 9 结果3 1 附图3 3 讨 仑3 6 小结3 7 参考文献3 7 综j 苤4 0 致谢5 1 个人简历5 2 中文摘要 多种乙型肝炎病毒突变株可调控性表达细胞系的构建 摘要 乙型肝炎病毒( 船v ) 持续感染是一世界性的卫生问题，慢性肝炎 终至肝硬化甚至肝细胞癌的发生。随着疫苗的普遍接种及抗病毒药物的广 泛应用，有效的降低了发病率及死亡率，但是也给人类带来一系列的问题： 疫苗诊断逃逸突变以及核苷类似物长期应用引发耐药导致检测和治疗的 失败。这些突变株与野生株相比，在生物学特性方面必然有其特殊性。为 了进一步了解突变株对病毒复制力、疫苗接种效能所带来的影响，以及研 究核苷类似物的耐药机制、筛选新型药物，有必要建立全基因组的细胞模 型。国内外研究表明，h e p g 2 和h u h 7 细胞瞬时转染乙肝病毒质粒后，能 够支持乙肝病毒的复制。然而，由于缺乏复制的稳定性，对药物筛选等高 要求的实验是不适用的。h e p g 2 2 15 细胞系是目前公认的应用最广泛的 乙型肝炎细胞模型，并且被广泛应用于抗病毒研究。不仅病毒复制均衡、 变异小，而且经多代培养仍可以长时间地维持病毒复制。但是病毒复制水 平较低，并且不能人为控制。为解决目前面临的难题，有必要构建一个稳 定的、可诱导表达的h b v 突变株细胞系。四环素( t e t ) 诱导的基因表达 系统是目前研究和应用最为广泛的真核细胞基因表达系统。本研究就是利 用p c r 、酶切等手段构建多个h b v 全基因组突变株，转染前期已构建成 功的t t a 细胞系，用潮霉素筛选，构建多个突变株可调控性表达细胞系， 并作为细胞模型检测已知的h b v 抑制剂的作用。为进一步完善h b s a g 诊断试剂盒及其变异监测、研究耐药机制、筛选新型抗病毒药物奠定了实 验基础。本研究共分2 部分完成。 第一部分多种h b v 突变株可调控性表达细胞系的构建 目的：应用分子生物学技术，将h b v 突变株克隆到p t r e 2 h y g 载体 上，构建8 个h b v 全基因组突变株。通过转染前期实验构建成功的t t a 细胞系，构建多种突变株可调控性表达细胞系，观察病毒表达情况，证明 稳定复制能力及可调控性。 方法： 1 应用p c r 和酶切重组技术，在p c h 3 0 9 3 质粒p 基因r t 区b ，c ，d 中文摘要 亚功能域1 7 3 ，1 8 0 ，1 8 1 ，2 0 4 ，2 3 6 位点及s 基因区1 0 0 ，1 2 0 ，1 4 5 位点实现定 点突变，并克隆到p t r e 2 h y g 载体上，构建具有潮霉素抗性的 p t r e - h b v - a 181t p t r e h b v - n 2 3 6 t , p t r e h b v - a 181t - n 2 3 6 t , p t r e - h b v - m 2 0 4 i ，p t r e h b v - l 18 0 m m 2 0 4 v , p t r e h b v - v17 3 l l18 0 m - m 2 0 4 v , p t r e h b v - g 1 4 5 r ，p t r e h b v - y 1 0 0 c p 1 2 0 t8 个质粒。 2 通过酶切及测序鉴定新构建质粒的正确性后，大量提取质粒。 3 前期实验已经成功构建了整合有p t t a 2 质粒的h e p g 2 细胞系 ( g 2 t a 2 7 ) 。上述8 个新构建质粒和p t r e w m h b v 分别转染此细胞，经 潮霉素筛选，获得阳性细胞克隆。 4 分别经过p c r 筛选出高分泌突变h b vd n a 及w m h b vd n a 颗粒 的细胞系。 5 在无抗生素筛选条件下，连续传代2 0 代，s o u t h e r nb l o t 观察其稳定 复制能力，并挑选最佳细胞系。 6 细胞系可调控性的鉴定应用s o u t h e r nb l o t 验证各细胞系在强力霉 素去除或加入时h b vd n a 的表达情况。 7 检测突变对病毒复制能力的影响应用质粒转染技术及s o u t h e r n b l o t 检测病毒复制能力的变化情况。 结果： l 成功构建了8 个具有潮霉素抗性的突变株质粒。 2 转染后，经潮霉素筛选，分别获得6 0 一1 0 0 个细胞克隆。 3 分别挑选其中4 8 个单细胞克隆进行扩大培养，经p c r 检测细胞上 清液中h b vd n a 及w m h b vd n a ，选取4 个表达量较高者。 4 在无抗生素筛选条件下，继续传代培养2 0 代( 约4 个月) ，通过 s o u t h e r nb l o t 检测，在细胞裂解液中能够形成h b v 复制中间体，并且均 强于g 2 2 1 5 细胞。最终选定a 1 8 1 t 5 5 ，n 2 3 6 t 1 3 ，a 1 8 1 t - n 2 3 6 t 1 ，m 2 0 4 1 4 3 ， l 1 8 0 m m 2 0 4 v 1 6 ，v 1 7 3 l l 1 8 0 m m 2 0 4 v 4 4 ，g 1 4 5 r 1 ，y 1 0 0 c p 1 2 0 t 3 ， w m h b v 4 2 九个细胞株。 5 通过s o u t h e mb l o t 检测，证明了所构建的几个细胞系为可诱导性表 达，即去除强力霉素时，细胞裂解液中能够形成h b v 复制中间体；加入 时则停止表达。 6 与野生株h b v 相比，突变株m 2 0 4 i ，m 2 0 4 v 及n 2 3 6 t 的复制能力 中文摘要 明显下降；而l 1 8 0 m m 2 0 4 v 及g 1 4 5 r , y i o o c p 1 2 0 t 变化不大。 结论：成功构建了八个突变株和一个w m h b v 可调控性表达细胞系， 有助于研究某一基因在各个不同发育时期的功能，也为筛选新型抗病毒药 物、完善检测方法奠定了实验基础。 第二部分h b v 突变株细胞系对常用的h b v 抑制剂的敏感性研究 目的： 检测新构建的突变株及w m h b v 细胞系对常用核苷类似物的敏感 性。为完善检测方法及进一步筛选新型药物奠定了基础。 方法： 1 通过s o u t h e r nb l o t ，检测新构建的核苷类似物耐药突变株对拉米夫 定和阿德福韦酯的敏感性。 2 通过n a t i v es o u t h e r n ，检测新构建细胞系对拉米夫定和阿德福韦酯 的敏感性。 3 通过质粒瞬时转染及s o u t h e r nb l o t ，检测阿德福韦酯理论耐药突变 点对阿德福韦酯敏感性。 4 经p c r 及基因测序技术，验证新构建细胞系的阿德福韦酯耐药突 变位点。 结果： 1 经s o u t h e r nb l o t 检测发现在a 1 8 1 t 5 5 ，n 2 3 6 t 1 3 ，a 1 8 1 t - n 2 3 6 t 1 及 作为对照的野生型h b v 株加拉米夫定组，随着药物浓度的不断加大，h b v 复制中间体表达水平逐渐减弱；而l 18 0 m m 2 0 4 v 1 6 ，m 2 0 4 1 4 3 及 v 1 7 3 l l 1 8 0 m m 2 0 4 v 4 4 三组细胞系，h b v 复制中间体表达水平不因加 拉米夫定而改变，并且不受药物浓度的影响；所有细胞系加阿德福韦酯组， 包括a 1 8 1 t 5 5 ，n 2 3 6 t 1 3 及a 1 8 1 t - n 2 3 6 t 1 均对阿德福韦酯敏感。 2 经n a t i v es o u t h e r n 发现，野生型h b v 病毒株、g 1 4 5 r 1 ， y 1 0 0 c p 1 2 0 t 3 及w m h b v 4 2 的复制水平均能被拉米夫定及阿德福韦酯 有效的抑制；l 1 8 0 m m 2 0 4 v 1 6 及m 2 0 4 1 4 3 拉米夫定组，病毒复制水平未 见减弱；所有细胞系加阿德福韦酯组包括n 2 3 6 t 1 3 ，复制水平均可见明显 减弱。 3 经质粒瞬时转染及s o u t h e mb l o t 检测发现，阿德福韦酯理论耐药突 变点n 2 3 6 t ，与野生型h b v 相似，同样对阿德福韦酯敏感。 中文摘要 二二_ 二二_ 一 4 经基因测序，证实新构建细胞系a 1 8 1 t 5 5 的1 8 1 位点、n 2 3 6 t 1 3 的2 3 6 位点及a 18 1 t - n 2 3 6 t 1 的1 8 1 和2 3 6 位点上均有突变，并且突变与 设计完全一致。 结论：作为细胞模型部分验证了常见的h b v 抑制剂的作用，为进一 步筛选新型抗h b v 药物、进一步构建动物模型、开展体内实验奠定基础。 关键词：核苷类似物；h b v 突变株；四环素调控系统；细胞系；药 物筛选 一_ 4 英文摘要 c o n s t r u c t i o no fs e v e r a ls p e c i a lc e l ll i n e so f h e p a t i t i sbv i r u sm u t a n t a n t s w i t hi n d u c i b l ee x p r e s s i o n a b s t r a c t h e p a t i t i sbv i r u s ( r m v ) i n f e c t i o n sa r eam a j o rw o r l d w i d eh e a l t hp r o b l e m w i t hc h r o n i ci n f e c t i o n sl e a d i n gt oc i r r h o s i sa n dh e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a a c c o m p a n y i n gt h ew i d e s p r e a d l yv a c c i n a t i o na n dg e n e r a l l ya p p l i c a t i o n o f a n t i v i r a ld r u g s ，t h em o r b i d i t ya n dm o r t a l i t yh a v eb e e ns i g n i f i c a n t l yr e d u c e d ， b u ts e v e r a lp r o b l e m sa r i s es u c ha sv a c c i n e d i a g n o s t i ce s c a p em u t a n t i o na n d n u c l e o t i d ea n a l o gr e s i s t a n tm u t a t i o n ，l e a d i n gt oe x a m i n a t i o na n dt r e a t m e n t f a i l u r e c o m p a r e dt ow i l ds t r a i no fh b v ，t h e r em u s tb ep a r t i c u l a rc h a r a c t e ri n t h ea s p e c to fb i o n o m i c so fm u t a n t s i no r d e rt od e e p l yu n d e r s t a n dt h ea f f e c tt o l e v e l so fv i r u sr e p l i c a t i o na n dv a c c i n ee f f i c a c yb yt h e s ea l t e r a t i o n s ，s t u d yt h e m e c h a n i s m so fr e s i s t a n c et on a ，a n de v e n t u a l l yd e v e l o pn o v e la n t i v i r a la g e n t s ， w en e e dt oc o n s t r u c ts e v e r a ls p e c i a lc e l lm o d e l so fh b vm u t a n t s i ti s r e p o r t e di nd o m e s t i ca n da b r o a d ，t w oh u m a nh e p a t o m ac e l ll i n e s ，h e p g 2a n d h u h 7 ，c a ns u p p o r tv i r u sr e p l i c a t i o nw h e nt r a n s i e n t l yt r a n s f e c t e dw i t hh b v d n a h o w e v e r ，i ti s n o ta p p l i c a b l ef o rp a r t i c u l a ra p p l i c a t i o n sr e q u i r i n g s t a n d a r d i z e dc o n d i t i o n ss u c ha sd r u gs c r e e n i n gb e c a u s ei tl a c ko fa b i l i t yt o r e p l i c a t es t a b l y a sa l lk n o w n ，h e p g 2 2 15i s ae x t e n s i v e l ya p p l i c a f i e dh b v c e l ll i n e ，a n dw i d e l yu s e di na n t i v i r a lr e s e a r c h ，p r o v i d i n gd i s t i n c ta d v a n t a g e s ： e s s e n t i a l l ya l lc e l l sa r ep r o d u c t i v e ，i n t e r e x p e r i m e n tv a r i a t i o ni sm i n i m i z e d ， a n di d e n t i c a lc e l l sp r o d u c i n gi d e n t i c a lv i r u sa r er e l a t i v e l ye a s i l ym a i n t a i n e d a n de x p a n d e d b u th b v p r o d u c t i o ni sl i m i t e da n d d i f f i c u l tt oc o n t r 0 1 o u ra i m i st oe s t a b l i s hs t a b l e ，i n d u c i b l yh b vm u t a n t a n t sp r o d u c i n gc e l ll i n e st h a t o v e r c o m et h e s el i m i t a t i o n s t e t r a c y c l i n e ( t e t ) 一i n d u c i b l ee x p r e s s i o ns y s t e mi s o n eo ft h em o s tp r o m i n e n ta n dw i d e l y - a c c e p t e di n d u c i b l es y s t e m s i n e u k a r y o t e ss o 胁o nt h i ss t u d y ，f i r s t l y ，w ec o n s t r u c t e ds e v e r a lf u l l l e n g t h g e n o m eh e p a t i t i abv i r u sp l a s m i d sw i t hs i t e - d i r e c t e dm u t a g e n e s i sb yp c r ， e n z y m e c u t t i n gr e c o m b i n a t i o nt e c h n i q u ea n do t h e rm o l e c u l a rb i o l o g ys k i l l s 5 英文摘要 s e c o n d l y ，t t ac e l l sw e r et r a n s f e c t e dw h i c hw e r es u c c e s s e d l yc o n s t u s t e d p r e v i o u s l y ，a n dt h e nb ys c r e e n i n gs t a b l ec l o n e sw i t hh y g r o m y c i nt oc o n s t r u c t s e v e r a l s p e c i a l c e l ll i n e so fh e p a t i t i sbv i r u sm u t a n t sw i t hi n d u c i b l e e x p r e s s i o n t h i r d l y , w eu s e dt w on a s t oa s s e s st h es u i t a b i l i t yo ft h en e wc e l l l i n e sb yt e s t i n gh b vi n h i b i t o r s i tm a yb eu s e f u ln o to n l yf o rd i a g n o s i so f h e p a t i t i sbv i r u si n f e c t i o n ，b u ta l s oa sav a l u a b l et o o lf o rh b s a gv a r i a n t d e t e c t i o n i na d d i t i o n ，i te s t a b l i s hf o u n d a t i o nf o rs t u d y i n gt h em e c h a n i s m so f r e s i s t a n c e ，a n ds c r e e n i n gf o rn e wa n t i v i r a ld r u g s t h i ss t u d yi n c l u d e st w o p a r t s p a r to n ec o n s t r u c t i o no fs e v e r a ls p e c i a lc e l ll i n e sw i t hi n d u c i b l e e x p r e s s i o n o b j e c t i v e ：t oc o n s t r u c t8f u l l l e n g t hg e n o m eh e p a t i t i abv i r u sp l a s m i d s w i t hs i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i sb ym o l e c u l a rb i o l o g yt e c h n i q u e ，h b vv e c t o r w a sc l o n e di n t o p l a s m i dp t r e 2 h y g t h r o u g ht r a n s f e c t i n g t t ac e l l s s u c c e s s e d l yc o n s t u s t e dp r e v i o u s l y ，w ec a na l s oc o n s t r u c ts e v e r a ls p e c i a lc e l l l i n e so fh b vm u t a n t sw i t hi n d u c i b l e e x p r e s s i o n t h ea b i l i t y o fs t a b l e r e p l i c a t i o na n dr e g u l a t i o nc a nb ea s s e s s e db ya n a l y s i s i n gt h el e v e lo fh b v e x p r e s s i o n m e t h o d ： lt om a k es i t e - d i r e c t e dm u t a g e n e s i si nt h eb ，c ，dd o m a i no fh b v p o l ( 1 7 3 ，1 8 0 ，1 8 1 ，2 0 4 ，2 3 6 ) a n dh b s a g ( 1 0 0 ，1 2 0 ，1 4 5 ) b yp c ra n d e n z y m e - c u t t i n g r e c o m b i n a t i o nt e c h n i q u e t h r o u g hc l o n i n gt h i sh b v v e c t o r si n t op l a s m i dp t r e 2 h y g ，w ec a nc o n s t r u c t8p l a s m i d sw i t h h y g r o m y c i n r e s i s t a n t ，i n c l u d i n gp t r e - h b v - a 181t ，p t r e - h b v - n 2 3 6 t , a ) p t r e h b v a 1 81 t - n 2 3 6 t ，p t r e h b v - m 2 0 4 i ，p t r e h b v _ l l8 0 m - m 2 0 4 v , p t r e - h b v - v 17 3 l - l18 0 m m 2 0 4 v , p t r e - h b v - g14 5 r ，p t r e - h b v - y 1 0 0 c p 1 2 0 t 2a f t e ri d e n t i f y i n gb ye n z y m e c u t t i n ga n ds e q u e n c i n g ，t h ep l a s m i d ss h o u l d b ep r e p a r e dl a r g e l y 3 p r e v i o u s l y , w eh a v es u c c e s s e d l yc o n s t u s t e do n en e wh e p g 2c e l ll i n e ， n a m e dg 2 t a 2 7 ，w h i c hw a sc l o n e dw i t h p l a s m i dp t t a 2 i tw a s 6 英文摘要 4 5 6 7 2 3 4 6 r e s p e c t i v e l yt r a n s f e c t e dw i t ht h i s 8p l a s m i d s n e w l yc o n s t r u s t e d a n d p l a s m i dp t r e w m h b v d o x w a sa d d e da n dm a i n t a i n e du n t i lr e s i s t a n t c l o n e sb e c a m ev i s i b l e i n i t i a ls c r e e n i n gf o rh b v e x p r e s s i o nw a sd o n eb yt e s t i n gh b v d n aa n d w m h b vd n a a f t e r2 0g e n e r a t i o n sw i t h o u ta n ya n t i b i o t i c s ，t h er e p l i c a t i o na b i l i t yo f i n d i v i d u a lc l o n e sw e r em o n i t o r e db ys o u t h e r nb l o t e v e n t r o l l y ，b e s tc e l l l i n e ss h o u l db es e l e c t e d r e g u l a t a b i l i t yw a sm o n i t o r e db ys o u t h e r nb l o t t i n g f o rn u c l e o c a p s i d a s s o c i a t e dh b v d n ai nc e l l sg r o w nw i t h o u t ，o rw i t hd o x y c y c l i n e t oe x a m i n et h ei n f l u e n c et or e p l i c a t i o no fh b vm u t a n t sb yt r a n s f e c t i o n t e c h n i q u ea n ds o u t h e r nb l o t r e s u l t ： t h e e i g h t m u t a n t sw i t h h y g r o m y c i n - r e s i s t a n t w e r e s u c c e s s f u l l y c o n s t r u c t e d a f t e rt r a n s f e c t i o n ，a b o u t6 0 10 0s t a b l et r a n s f e c t a n t se a c hw e r es e l e c t e d u s i n gh y g r o m y c i n 34 8i n d i v i d u a lc l o n e sw e r ep i c k e df r o me v e r y6 0s t a b l et r a n s f e c t a n t st ob e c u l t u r e e de x p a n d l y e v e n t u a l l y ，4b e t t e rc l o n e sw e r es e c l e c t e db yt e s t i n g h b v d n a b yp c r i nt h ec u l t u r es u p e m a t a n t s 4a f t e rp e r s i s t l yc u l t u r e dw i t h o u ta n ya n t i b i o t i c sf o r2 0g e n e r a t i o n s ( a b o u t 4 m o n t h s ) ，r e p l i c a t i v ei n t e r m e d i a t e sw e r em o n i t o r e db ys o u t h e r nb l o t i n c o m p a r i s o nt oh e p g 2 2 1 5c e l l s ，a l ln e wc e l ll i n e sp r o d u c e dp a r t i c u l a r l y s t r o n g e rs i g n a l s e v e n t u a l l y ，9b e s tc e l ll i n e ss t o o do u t a si ty i e l d e du pt o h i g h e r l e v e l st h a n m a n yo t h e rc l o n e s ，n a m e da 181t 5 5 ，n 2 3 6 t13 ， a 1 8 1 t _ n 2 3 6 t 1 ，m 2 0 4 1 4 3 ，l 1 8 0 m m 2 0 4 v 1 6 ，v 1 7 3 l - l 1 8 0 m m 2 0 4 v 4 4 ， g 1 4 5 r 1 ，y 1 0 0 c - p 1 2 0 t 3a n dw 舳v 4 2 a l lcl o n e sp r o v i d i n gh i g hl e v e la n dt i g h t l yr e g u l a t e de x p r e s s i o nw e r e i d e n t i f i e db ys o u t h e r nb l o t w i t h o u td o x ，r e p l i c a t i v ei n t e r m e d i a t e sc a nb e s e e n ，y e tw e r es t i l lt i g h t l ys u p p r e s s e db y d o xa d d i t i o n c o m p a r e d t oh b vw i l ds t r a i n s ，t h er e p l i c a t i o na b i l i t yo fm u t a n t so fm 2 0 4 v , 7 英文摘要 m 2 0 4 ia n dn 2 3 6 ti so b v i o u s l yd e c r e s s i n g h o w e v e r , i tc h a n g e dal i t t l ei n m u t a n t so f l l8 0 m m 2 0 4 v ，g 1 4 5 ra n dy 1 0 0 c p 1 2 0 t c o n c l u s i o n ：s u c c e s s f u lc o n s t r u c t i o no fs e v e r a ls p e c i a lc e l ll i n e sw i t h i n d u c i b l ee x p r e s s i o n ，i sh e l p f u lf o r s t u d y i n gt h ef u n c t i o no fa n yg e n ei n d i f f e r e n ts t a g e so fd e v e l o p m e n t i ta l s oe s t a b l i s hf o u n d a t i o nf o rs c r e e n i n gf o r n e wa n t i v i r a ld r u g s ，a n da c c u r a t ed i a g n o s i so f h e p a t i t i sb v i r u si n f e c t i o n p a r tt w oa s s e s st h es u i t a b i l i t yo ft h en e wc e l ll i n e sf o rt e s t i n gh b v i n h i b i t o r s o b j e c t i v e ：t ot e s tt h es e n s i b i l i t yo fc e l ll i n e s o fh b vm u t a n t sa n d w m h b vc e l ll i n ef o rl a ma n da d f i tm a yb e n e f i tf o ro p t i m i z i n gm e t h o d s o f d i a g n o s i s ，a n ds e l e c t i n gn e wa n t i v i r a ld r u g s m e t h o d ： 1 a s s e s st h es e n s i b i l i t yo ft h ec e l ll i n e so fn u c l e o t i d ea n a l o gr e s i s t a n tn e w l y c o n s t r u s t e dt ol a ma n da d f b ys o u t h e r nb l o t 2e x a m i n et h es e n s i b i l i t yo ft h ec e l ll i n e sn e w l yc o n s t r u s t e dt ol a ma n d a d f b yn a t i v es o u t h e r n 3d e t e c tt h es e n s i b i l i t yo fa d f t h e o r yr e s i s t a n tm u t a n t st oa d fb yp l a s m i d t r a n s i e n tt r a n s f e c t i o na n ds o u t h e r nb l o t 4t oe x a m i n et h ec o r r e c t n e s so ft h es i t e so fs i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i s r e s i s t a n tt oa d f b yp c r a n ds e q u e n c i n gt e c h n i q u e r e s u l t ： ， 1 b ys o u t h e r nb l o t i tc a nb ee a s i l ys e e nt h a tt h es i g n a l so fr e p l i c a t i v ei n t e r m e d i a t e si nt h eg r o u po fa 1 8 1 t 5 5 ，n 2 3 6 t 1 3 ，a 1 8 1 t - n 2 3 6 t 1a n d h e p g 2 117a r eg r a d u a l l yw e a k e n e d ，f o l l w i n gb ya d d i n gb i g g e rd r u g c o n c e n t r a t i o no f l a m h o w e v e r , t h er e p l i c a t i o n a b i l i t i e s o f l18 0 m - m 2 0 4 v16 ，m 2 0 4 1 4 3a n dv17 3 l - l18 0 m - m 2 0 4 v 4 4a r e n o t a f f e c t e d a l lc e l ll i n e si n c l u d i n ga 1 8 1 t 5 5 ，n 2 3 6 t 1 3a n da 1 8 1 t - n 2 3 6 t1 a r es e n s i t i v et oa d f 2 b yn a t i v es o u t h e r n ，w e c a nf i n dt h a tw i d et y p eh b v , g14 5 r 1 ， y10 0 c p12 0 t 3a n d 佩任瑕v4 2a r es e n s i t i v et ob o t hl a ma n d 舰t h e s i g n a l so fl 18 0 m m 2 0 4 v16a n dm 2 0 4 1 4 3a r en o ti n f l u e n c e db ya d d i n g 8 英文摘要 l a m t h ea b b i l i t i e so fa l lc e l ll i n e s ，i n c l u d i n gn 2 36 t13t or e p l i c a t e b e c o m el o w e ra f t e ra d d i n ga d f 3 b yp l a s m i dt r a n s i e n tt r a n s f e c t i o na n ds o u t h e mb l o t ，w ec a nf i n dn 2 36 ti s s e n s i t i v et oa d f , r e s e m b l et ow i d e 耶v 4 b ys e q u e n c i n g ，w ec a nf i n ds i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i sa ts i t e181i n a 1 8 1 t 5 5 ，s i t e 2 3 6i nn 2 3 6 t 1 3 ，a n ds i t e1 8 1 ，2 3 6i na 1 8 1 t n 2 3 6 t 1 w h i c hi sc o r r e s p o n dt od e s i g n i n gb e f o r e c o n c l u s i o n ：a sc e l lm o d e l ，w ep a r t l yt e s tt h es e n s i t i v i t yt of r e q u e n th b v i n h i b i t o r s i tm a ye s t a b l i s hf o u n d a t i o nf o rs c r e e n i n gf o rn e wa n t i v i r a ld r u g s ， c o n s t r u c t i n ga n i m a lm o d e l ，a n dc a r r y i n gp u te x p e r i m e n ti n v i v o k e yw o r d s ：n u c l e o s ( t ) i d ea n a l o g s ；h b vm u t a n t ；t e t r a c y c l i n e ( t e t ) 一i n d u c i b l ee x p r e s s i o ns y s t e m ；c e l ll i n e ；d r u gs c r e e n i n g 9 研究论文 多种乙型肝炎病毒突变株可调控性表达细胞系的构建 引言 目前，全球约2 0 亿人曾感染过乙型肝炎病毒( 衄v ) ，其中3 5 亿人 为慢性h b v 感染者，每年约有1 0 0 万人死于h b v 感染所致的肝衰竭、 肝硬化和原发性肝细胞癌，因此乙肝的预防、诊断及治疗已成为世界各国 共同关心的问题。 h b v 复制是通过逆转录酶进行的，而逆转录酶缺乏一定的校正能力， 在特异性选择压力下( 免疫制剂和核苷类药物等) ，易导致基因序列发生 改变。h b vs 基因编码乙肝病毒表面抗原，其中“a 决定簇是h b s a g 的主 要抗原决定簇。编码“a 决定簇序列的突变可影响疫苗的预防效果，并且 其抗原性变化还将导致一部分乙肝表面抗原突变体与抗野生型乙肝表面 抗原的结合力的降低或者无法结合，因而用常规市售试剂盒无法检测出这 些乙肝表面抗原突变体。目前h b s a g 突变体的种类很多，常见的点突变 有y 1 0 0 c ，p 1 2 0 t , g 1 4 5 r ，d 1 4 4 e 等，这些是导致目前市售诊断试剂盒漏 检的突变体，也是我们研究的主要对象。由于h b v 基因内部有调控元件， s 基因编码区又与p 基因互相重叠，故研究单一s 基因片段的表达有一定 的局限性，因此有必要从全基因组的角度来研究s 基因变异株的免疫原 性，为进一步完善h b