（内科学专业论文）体外扩增巨核细胞的研究.pdf

北京协和医学院中图医学科学院清华大学医学部颀i ? 研究生学位论文 摘要 目的：探讨采用脐血单个核细胞为起始细胞在无血清培养基中体外扩增巨核细胞： 观察胎儿肺部组织来源的间充质干细胞对脐血单个核细胞诱导分化为巨核细胞的 影响。方法：分取脐血单个核细胞，在t p o ，i l _ 1 l ，肝素的扩增体系中分为两组 培养，第一组以c d 3 4 细胞作为对照，单独培养，第二组与问充质干细胞共培养，在 7 天，l o 天，1 4 天时，取细胞进行活细胞计数，流式细胞仪分析c d 4 1 a 和c d 6 1 的表 达情况。取1 4 天细胞采用免疫组化和透射电镜分析细胞形态与结构，通过流式细胞 仪分析细胞d n a 含量。结果：m n c 经细胞因子诱导后，c d 4 1 a 和c d 6 1 阳性比例明 显上升，与0 天时相比，培养1 4 天后。c d 4 1 a + 细胞平均扩增了4 2 9 5 倍，c d 6 1 + 细胞 平均扩增了3 3 9 倍。第二组在l o 天时得到的c d 4 1 + 细胞和c d 6 1 + 细胞最多，分别是第一 组的4 5 倍和4 7 倍，免疫组化和电镜结果表明，两组细胞核发育不成熟。结论：在 t p o ，i 卜l l ，肝素的扩增体系下以m n c 为起始细胞能够诱导得到大量的巨核细胞， 胎肺间充质干细胞能有效刺激c 0 4 1 + 细胞和c d 6 1 + 细胞生成，对细胞核发育影响。 关键词脐血单个核细胞，c d 3 4 细胞，胎肺间充质干细胞，巨核细胞 中图分类号r 3 2 9 2 8 北京协和医学院中国医学科学院清华人学医学部硕i ：研究生学位论文 a b s tr a c t a i m ：i no r d e rt oe x p a n dm e g a k a r y o c y t ef r o mu m b ili c a lc o r db l o o dm o n o n u c l e a r c e l l s ，a n da n a l y s i st h ee f f e c to ff e t a ll u n gm e s e n c h y m a ls t e mc e l l ( f l - m s c ) o nd i f f e r e n t i a t i o no fu m b il i c a lc o r db l o o dm o n o n u c l e a rc e l l s ( m n c ) t o w a r d m e g a k a r y o c y t e m e t h o d ：u m b i l i c a lc o r db l o o df r e s hm n cw a si s o l a t e d ，a n d d i v i d e di n t ot w og r o u p su n d e rt p oa n di l - l lw i t hh e p a r i n f i r s tg r o u p ：m n c w a sc u ll u r e da l o n ea n dc d 3 4 + c e l i sw e r es e l e c t e da sc o n t r o l ：s e c o n dg r o u p ： m n cw a sc o c u l t u r e dw i t hf l m s c t h ec e ll sw e r et a k e no u ta td a y7 ，1 0 1 4f o r e e l lc o u n t i n ga n df l o wc y t o m e t r ya n a l y s i sc d 4 1 aa n dc d 6 1 t h em o r p h e u sa n d u h r a s t r u c l u ro fm e g a k a r y o c y t e ，w e r eo b s e r v e db yh i s t o c h e m i sa n da n a l y z e db y t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p ya td a y14 t h ec o n t e n to fd n aw a sa n a l y z e da td a y1 4 r e s u l t ：a f t e ri n d u c t i o nc d 4 1 a c e li sa n dc d 6 1 + c e ll sw e r el a r g e l yi n c r e a s l y a td a y1 4 ，c d 4 1a c e l l sw e r e4 2 9 5 一f o l dv e r s u si n i f i a lc d 4 1 re e l ln u m b e ra td a y0 a n dc d 6 1 + c e l i sw e r e3 3 9 1 f o l dv e r s u si n i t i a lc d 6 1 + c e l ln u m b e ra td a y0 t h em o s t c d 41a + c e l l sa n dc d 61 十c e l l sw e r eo b t a i n e da td a y10b ys e c o n dg r o u p ，r e s p e c t i v e l y4 5 a n d4 7f o l dv e r s u sm n ca l o n e t h em o r p h e u sa n du h r a s t r u c t u ro f m e g a k a r y o c y t e s h o w e dc e l ln u c l e u so fm e g a k a r y o c y t ew e r en o tm a t u r eb o t ho ft w og r o u p s c o n c l u s i o n ： m n cc a n g e n e r a t el a r g e ra m o u n tm k s u n d e rt p oa n di l 一11w i t hh e p a r i ni ns e r u m f r e e f l - m s cc a ne n h a n c ep r o d u c t i o no fc d 41a + c e l l sa n dc d 61 + c e l l s ，a n dh a de f f e c t o nc e l ln u c l e u sd e v e l o p m e n t k e yw o r d sc o r db l o o dm n c ，c d 3 4 + c e l l s ，f c t a il u n gm e s e n c h y m a ls t e mc e l l ， m e g a k a r y o c y t e 3 附件5 ： 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人已经发表或撰写过的研究 成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同 志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：旅t 身幺私签字日期：砂甲年多月牛日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解兰丝塞迹塑匡堂隍有关保存、使用学位论文的管理办 法。有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权j 匕塞迹塑医堂暄可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：认屹为 签字日期：2 p 一7 年z 月中日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位：江霜，_ 匕翔兰涉姒舀既2 司 通讯地址： 2 电话： 邮编： 妒日 游弘桫忉 上b 彳 扎 钒 瑚 到 阳 稻 字 i y ， 鄯 签 北京协和医学院中国医学科学院清华大学医学部颈，i ：研究生学位论文 前言 血小板输注能快速恢复放化疗后导致的血小板恢复延迟，但是反复输注血小板 会导致产生血小板抗体引起输注无效，而且血小板不易存储，价格昂贵( 1 3 ) 。这些 问题限制了血小板的应用。反复使用血小板输注也增加了交叉感染的危险性。骨髓 移植能够有效替代血小板输注帮助血小板恢复，但是骨髓来源比较难困难。脐带 血中富含有造血干细胞，已经被很多实验室证实( 4 8 ) ，而且来源广泛，采集方便 而且脐血具有免疫原性低，不易受病毒污染，等特优点而倍受关注。成为骨髓移植 的可选择的替代品( 9 - i1 ，但限于脐血中干细胞的数量，使得脐血移植更多应用于 儿童，目前临床已经报道移植的病例超过6 0 0 例( 1 2 - 1 4 ) 但脐血移植后血小板恢 复延迟成为它应用的难题( 1 5 ) 。很多实验室针对这一现象进行了研究，发现脐血中 巨核组细胞过少可能是导致脐血移植后血小板恢复慢的原因( 1 6 ) 。体外扩增巨核细 胞是解决这一问题的有效办法( 1 7 1 9 ) 。已经证明很多因子能够有效促进巨核细胞生 成，这些因子包括t p o ，s c f ，f i t 3l i g a n d ，p d g f b b ，g m c s f ，i l 1 b ，i l 3 ，i l - 6 ，i l 9 ， a n di l 11 ( 2 0 2 3 ) ，其中以t p o 和s c f 作用最为关键( 2 4 ) 。这些因子对巨核细胞生成 的贡献不同，很多实验室在不断的尝试不同的因子组合，试图找到最佳的扩增条件。 t p o 是体外扩增巨核细胞关键因子，它是c m p l 的配体，通过刺激c - m p l 来作用 于巨核细胞。t p o 在1 9 9 4 先后被几个实验室克隆出来，而且它的作用也如人们猜测 一样，它的重组蛋白可以有效促进巨核细胞集落生长，促进巨核细胞成熟，以及c d 4 1 、 c d 6 1 等系特异性标志的表达，促进巨核细胞的成熟，并支持功能性血小板的形成。 t p o 已经被应用于临床帮助血小板恢复。敲除t p o 或c m p l 基因的小鼠，除了出现严重 的血小板减少、骨髓巨核( 祖) 细胞减少外，红系和粒系的祖细胞也明显减少( 2 5 ，2 6 ) 。 t p o 已经被应用于临床帮助血小板恢复。但直接输注t p o 取得的效果并不好( 2 7 ) 。 s c f 是造血干细胞体外扩增的重要因子，它主要作用于造血干细胞，促进造血 干细胞增殖但是研究表明它能够降低巨核细胞凋亡，并促进巨核细胞成熟( 2 3 ) 。 f l 在巨核形成过程中作用不明，不能促进c d 4 1 a 阳性细胞增加和巨核细胞成熟，但 能刺激细胞总数增j j i l ( 2 2 ) 。i l 3 促进巨核细胞增殖，并不促进巨核细胞的成熟和血小 板的生成释放。i l 1 l 主要刺激巨核细胞成熟与血小板生成，其作用可能部分是由 t p o 介导的( 2 l ，2 4 ) 。目前i l i l 是惟一通过美国食品药品管理局( f d a ) 认证，允许在 临床用于升高外周血小板的细胞因子。 肝素在血浆或血清存在的条件下，对巨核细胞增生和成熟有刺激作用，实验也进 一步证实了它能促进人和小鼠的巨核细胞生成( 2 8 ，2 9 ) 。 我们实验室已经发现t p o ，i l 1 l ，肝素钠的因子组合能有效促进巨核细胞体 外扩增( 1 7 ) 。 北京协和医学院中田医学科学院清华大学医学部硕l 研究生学位论文 分选脐血c d 3 4 + 细胞得到的细胞较少，不易满足成人移植的需要。相比于脐血 c d 3 4 + 细胞，选择单个核细胞作为来源扩增巨核细胞有很多优势，避免了分选过程 中c d 3 4 + 细胞和一些更早期的li n - c d 3 4 细胞的丢失，而且单个核细胞做为初始细 胞，得到的起始细胞的量更大，节省了分选的成本，扩增后能得到更多的巨核细胞， 操作简便实用性更强。 最初用于扩增巨核细胞培养基都含有动物血清或者是人血清，在这种含血清的 培养基中的得到的巨核细胞的产量很低。在血清的存在条件下，即使是加入t p o 后， 培养巨核细胞产量仍然很低，不能满足试验研究的需要但随着人们在用于培养的 血清中发现了转化生长因子p l ( t g f d 1 ) ( 3 0 3 6 ) ，而这种蛋白能阻止干细胞向巨核 分化，于是大家纷纷改变了扩增的策略，在无血清培养基中扩增巨核细胞，这种条 件下不含有t g f 3 1 ( 3 7 ，3 8 ) 。而且因为无血清培养基能够阻止造血于细胞自发分化 ( 3 9 ) ，得到c d 3 4 + 细胞更多，同时也避免了异种抗原的侵入和病毒感染的风险，因 此人们越来越倾向使用无血清培养基。而且随着因子组合的优化，无血清培养基培 养的巨核细胞产量将会满足临床使用。 所以我们选择单个核细胞作为来源扩增巨核细胞，在无血清培养条件下，使 用t p o ，i l 11 ，肝素钠的因子组合扩增巨核细胞，以c d 3 4 + 细胞作为对照，进行比 较。 间充质干细胞( m e s e n c h y m a ls t e mc e l i s ， m s c ) 来源于发育早期中胚层，广 泛存在于多种组织中，目前已经在骨髓、脂肪、羊水、真皮、牙、骨骼肌、胎肺、 胎肝、脐血、脐带等发现它的存在，它在体外可以诱导分化为中胚层来源的细胞如 骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等，而且在一定条件下还可以诱导分化为肝脏细胞、 心肌细胞及神经细胞等。这些特点引起大家极大的关注，除了多向分化的能力，m s c 还可以分泌多种细胞因子，调节免疫、支持造血，免疫源性低的特性。骨髓间充质 细胞是最早被研究的基质细胞，它能分泌t p o ，能够支持巨核细胞生长( 4 0 - 4 2 ) ，但 它在短期内对细胞总数增加不明显。因此我们采用一种较早期的来源于胎肺间充质 干细胞( f l m s c ) 。观察它对巨核细胞扩增的影响。 北京协和医学院中国医学科学院清华人学医学部颈l ：研究生学位论文 第一部分 体外扩增巨核细胞的研究 6 北京协和医学院中国医学科学院清华人学医学部顾i 二珂f 宄生学位论文 材料与方法 一、主要实验材料 1 实验标本来源 u c b 标本取自天津市中心妇产医院足月剖宫产的新生儿脐带，供者无慢性感 染、血液学疾患及家族遗传病史经产妇及家属书面同意用于科学研究。 2 试剂 胎牛血清(fcs)hyclone公司 多聚甲醛国产分析纯 0 4 台盼兰( t r y p a nb l u es o l u t i o n )美i 虱s i g m a 公司 流式专用红细胞裂解液( b df a c sl y s i n gs o l u t i o n )美国b d 公司 无血清培养液 s t e mc e l l 公司 重组人血小板生成素( r h t p o ) 三生制药公司 重组人白细胞介素一li ( i l 1 1 )齐鲁制药公司 巨核细胞免疫组化试剂盒协和干细胞公司 p i s i g m a 公司 淋巴细胞分离液( f i c o l l h y p a q u e ) 天津生物工程所 i m d mg i b c o 公司 d m e m g i b c o 公司 d f 1 2 g i b c o 公司 3 耗材 6 孔培养板美国c o m i n gc o s t a r 公司 1 2 ：f l 培养板 美国c o m i n gc o s t a r 公司 2 4 j ：l 培养板美国c o m i n gc o s t a r 公司 15 m l 离心管 美国c o m i n gc o s t a r 公司 5 0 m l 离心管 美国c o m i n gc o s t a r 公司 t 7 5 培养瓶美国i w a k i 公司 l m i 一次性使用无菌注射器 美国b d 公司 北京协和医学院中国医学科学院清华人学医学部颈i ：o f 宄生学位论文 5 m i 一次性使用无菌注射器 4 。抗体 c d 3 4 f i t c 单克隆抗体 c d 3 4 p e 单克隆单克隆抗体 p e 标记的小鼠i g g 2 曩抗体 f i t c 标记的小鼠l g g i 抗体 c d 4 1 a p e 单克隆单克隆抗体 c d 4 i a - f i t c 单克隆单克隆抗体 c d 6 1 p e 单克隆单克隆抗体 c d 4 5 f i t c 单克隆抗体 h l a d r - f i t c 单克隆抗体 c d 3 4 f i t c 单克隆抗体 美国b d 公司 美国b d p h a r m m g e n 公司 美国b d p h a r m m g e n 公司 美国b d - p h a r m m g e n 公司 美国b d p h a r m m g e n 公司 美国b d p h a r m m g e n 公司 美国b d - p h a r m m g e n 公司 美国b d p h a r m m g e n 公司 美国b d - p h a r m m g e n 公司 美国b d - p h a r m i n g e n 公司 美国b d - p h a r m i n g e n 公司 5 细胞磁珠分选试剂和材料 m a c s ( m s 型) 细胞磁性分选柱，c d 3 4 + 细胞磁珠分选试剂盒( c d 3 4m i c r o b e a d k i t ) ，m i n i m a c s 磁性分选仪均购自德国m i l t e n y ib i o t e c 公司。试剂盒包括c d 3 4 m i e r o b e a d s 和f c rb l o c k i n gr e a g e n t 。 6 主要溶液配制： a ) p b s 缓冲液：5 0 0m ld d h 2 0 中溶解8 5 9 n a c i 、1 7 2 9 n a 2 h p 0 4 、o 1 7 4 9k h 2 p 0 4 ， 用h c i 调节溶液的p h 值至7 4 ，加水定容到1 0 0 0 m l ，分装后在1 0 5 k g c m 2 高 压蒸汽下灭菌2 0 r a i n ，保存于室温。 b ) m a c s 缓冲液( b u f f e r ) = p b s 液，2 m me d t a ，o 5 牛血清白蛋白( b s a ) 。 c ) p b s e d t a 溶液：称取二乙烯四乙酸二钠，加入无c a s + 、m 9 2 + 液体( d p b s ) ， 磁力搅拌混匀，使其完全溶解，高压灭菌。使用浓度为含2 r a me d t a 的p b s 液。 d ) 红细胞裂解液：称取氯化铵( n h 4 c i ) 0 7 4 7 9 ，t r i s0 2 6 0 9 ，溶解于1 0 0m l d d h 2 0 中过滤除菌，使用时待处理标本与裂解液按l ：9 比例混合，室温下裂解1 0 r a i n 。 e ) l 多聚甲醛：称取l g 多聚甲醛加入1 0 0 m lp b s ，磁力搅拌并加热或用电磁炉煮 待多聚甲醛全部溶解，冷却后过滤除去杂质。 北京协和医学院中田医学科学院渍牛人学医学部硕i ：研究生学位论文 ( 如无特殊说明均为去离子水( d d w ) 配制) 二、主要仪器设备 台式常温高速离心机 德国h e r a e u s 公司 台式低温高速离心机德国h e r a e u s 公司 倒置显微镜日本n i k o n 公司 恒温培养箱美国i r 公司 恒温水浴锅美国l k b 公司 流式细胞仪 美国b e c t o n d i c k i n s o n 公司 微量震荡器北京海淀电子医疗器械厂 荧光显微镜美国b i o r a d 公司 k o d a k 数码相机 美国k 0 d a l ( 公司 离心平衡用天平天津市天平仪器有限公司 细胞计数板和细胞计数仪天津市仪器有限公司 电子数字天平上海o h a u s 国际贸易有限公司 微量移液器法国g i l s o n 公司 h o r i z o n 电泳仪美国b r l 公司 照射铯源( 1 3 7 c s ) 中国医学科学院血液学研究所 超净工作台 苏州集团安泰公司 立式自动加热压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂 三实验方法 ( 一) f i c o l l h y p a q u e 密度梯度法分离单个核细胞 1 标本获取：u c b 采自健康足月剖宫产的新生儿脐带，严格消毒后用1 6 号针 头穿刺脐静脉，通过重力将u c b 收集于含有3 5 m lc p d ( c i t r a t ep h o s p h a t ed e x t r o s e ) 的4 5 0 m l 采集袋内，采集量为8 0 1 0 0 m ! 。从标本采集到分析处理不超过4 小时。 所有供体均经详细解释并签署知情同意书。 2 m n c s 制备：将u c b 先恢复至常温，置于2 5 0 m l 血浆瓶中，按5 ：1 比例 加入6 o 的羟乙基淀粉( 终浓度1 2 ) ，充分混匀，但不要过于用力吸打，静止 4 5 6 0 分钟沉降红细胞。沉降后，分为清晰两层，上层清夜富含有核细胞，下层为 红细胞层，小心吸取上层清夜，不要吹打。在5 0 m l 离心管内加入f i c o l l 分离液 ( d = 1 0 7 7 ) ，在其上小心加入使之形成清晰的两层，分离液与血液的体积比 约为1 5 m l ：2 5 m l 。常温下台式离心机2 0 0 0 r p m 去闸离心2 0 m i n ，离心后可见分 为5 层从上到下依次为血浆血小板层、单个核细胞层、f i c o l l 层、中性粒细胞 北京协和医学院中固医学科学院清华人学医学部硕i ：研究生学位论文 层、红细胞层，小心缓慢吸取中间的白膜层移至新的离心管内，不要吸到中性粒细 胞层，每管加入1 0 m l p b s e d t a 溶液反复洗涤细胞2 次，1 6 0 0 r p m ，离心1 0 r a i n ，洗去 f i c o l l ，弃去上清，加适量p b s e d t a 溶液将诸管合并为l 管，吸取少量稀释计数， 其余1 2 0 0 r p m ，带闸离心1 0 m i n 。 ( - - ) 细胞计数与活力测定 预先用9 5 乙醇清浸泡血球计数板及盖玻片，然后仔细用绸布拭干，在血球计 数板中央放置专用的盖玻片，用微量加样器吸取适量的细胞悬液，并作适当稀释， 0 4 台盼蓝与细胞悬液体积比为l ：9 ，混匀后吸取l oi i i 滴加到计数板与盖玻片的 缝隙旁，让它自然吸到缝隙内，不要产生气泡。l o x 物镜下计数四角大方格中的细 胞总数( 细胞压中线时，计上不计下，计左不计右) 并检查蓝染的细胞数( 死细胞) ， 求出拒染细胞( 活细胞) 百分比。本法要求细胞密度不低于1 0 4 m l ，细胞密度过高 时，可用白细胞稀释液( 2 冰醋酸) 稀释。按下列公式计算细胞总数和活力： 细胞总数= 4 个大方格细胞总数4 x 1 0 4 稀释倍数细胞体积。 细胞活力= ( 1 一台盼蓝染细胞数细胞总数) 1 0 0 ( 三) 单个核细胞接种与免疫磁珠分选c d 3 4 + 细胞 去除黏附细胞：用i m d m 重悬已经清洗的m n c 沉淀，吸取到t 7 5 的培养瓶中， 在5 c 0 2 温箱中3 7 ，孵育l 小时。 m n c 细胞接种：取出去黏附后的细胞，用4 0 m i p b s 再次清洗，1 2 0 0 r p m ，离 心1 0 分钟，接种在含t p o ( 1 0 0 n g m 1 ) i l 1 l ( 1 0 0 n g m 1 ) 肝素( 5 0 u m 1 ) 的无血清培养 基的1 2 孔培养板中，细胞终浓度为l 1 0 6 m l ，每孔终体积为l m l 。 c d 3 4 + 细胞分选：参照m i l t e n y ib i o t e c 公司的c d 3 4 + 细胞分选试剂盒说明书进 行。操作在超净台中进行，纯化过程具体如下每l x l o sm n c s 用3 0 0 i d 缓冲液重 悬，要先加入l o o i mf c r 阻断剂，吹打均匀后，再加入1 0 0 p 1 磁珠抗体，吹打均匀 于4 - 8 孵育3 0r a i n ，加入4 0 m l 缓冲液洗去未结合的磁珠，1 2 0 0 r p m 。带闸离心 1 0 m i n 。弃去上清，以5 0 0 p 1 缓冲液重悬细胞。磁性分选仪预先用紫外消毒，将磁性 分选柱正确安置于磁性分选仪上，5 0 0 p 1 缓冲液润洗磁柱，加入待分选的细胞悬液， 待流尽时加入缓冲液5 0 0 t d 添加液体时要等柱内液体流空，反复冲洗3 次直至落 下的液体清亮。向磁珠中加入l m l 缓冲液，迅速将磁柱移出磁场，用机械力按活塞 加压将柱内细胞冲出。再次过柱，重复上述步骤。冲出的细胞少量用于细胞计数及 细胞活力的计算，部分细胞用于制备流式标本以检测分选纯度，流式细胞仪( f ：愆s ) 鉴定其纯度。 c d 3 4 + 细胞接种：离心收集c d 3 4 + 细胞，接种于1 2 孔板中，每孔细胞终浓度为 l x l 0 m l ，每孔终体积为1 m i ，因子浓度为t p o ( 5 0 n g m 1 ) ，i l 1 l ( 5 0 n g m 1 ) ，肝素 ( 2 5 u m i ) 的无血清培养基。 ( 四) 流式分析 北京协和医学院中固医学科学院漓华人学医学部硕i ：r o f 究生学位论文 表型分析：在培养7 天，l o 天，1 4 天时，吸取细胞悬液，用p b s 清洗细胞两 遍，1 2 0 0 r p m ，离心l o 分钟，收集细胞，震荡重悬，体积为6 0 9 0 u l ，加入抗体， 阴性对照f i t c 标记的小鼠i g g i 和p e 标记的小鼠i g g i 抗体双标记p e 抗人c d 4 1 a ， f i t c 抗人c d 3 4 ，p e 抗人c d 6 1 每个抗体标记的细胞数大于2 1 0 5 ，4 度闭光 孵育3 5 分钟，再用p b s 洗细胞两遍。室温1 5 0 0 r p m 离心5 分钟后去除上清，5 0 0 u l ， 2 多聚甲醛固定，4 c 闭光保存，上机检测，至少收集lxl o 个。 +。 倍体分析：为了分析巨核细胞成熟情况j 我们分析了c d 4 1 r 细胞在不同时间 的倍体水平，我们采用了流式双标的办法，利用c d 4 1 + 细胞设门，分析它的倍体情 况。在培养7 天，1 0 天，1 4 天时，吸取细胞悬液，吸取细胞悬液至流式管每管 细胞数要大于2 xl o g 用p b s 洗细胞两遍去掉培养基，离心收集细胞，加入 f i t c 抗人c d 4 1 a ，4 度闭光孵育3 5 分钟，再用p b s 洗细胞两遍，用冷乙醇固定， 乙醇终浓度5 0 ，4 度闭光保存。在至少固定4 h 后，再用p b s 洗细胞两遍。去除 乙醇，加入p i 和r n a s e ，3 7 闭光孵育2 0 分钟，上机检测。 ( 五) 免疫组化分析 取培养7 天的细胞，进行细胞涂片，在甲醇：丙酮( 1 ：1 ) 固定液固定9 0s 后， 晾干，加入生物素一鼠抗人c d 4 1 在3 7 孵育4 0 m i n ，p b s 缓冲液洗3 4 次，加 碱性磷酸酶一链霉卵白素，3 7 c 孵育3 0 m i n ，p b s 缓冲液洗3 4 次，坚固红显色 1 0 2 0 m i n ，m a y e r 苏木素复染l h r ，0 5 氨水返蓝5 s ，自来水冲净晾干，镜下观察， 细胞核呈蓝色，胞膜或胞浆呈红色的为c d 4 1 阳性细胞：无红色的为阴性细胞。 ( 六) 透射电镜 将培养7 天的细胞( 1 1 0 e l l s ) 离心收集，用p b s ( 0 i m ，p h 7 2 ) 洗两遍， 血清洗一遍，2 5 戊二醛4 固定2 - - 3 h 后，再用l 的锇酸固定2 h ，丙酮梯度 脱水，环氧丙烷，8 1 2 环氧树脂浸透，6 0 聚合，超薄切片，枸橼酸铅，醋酸铀双 染，电镜观察。 ( 七) 统计学分析 用s p s s l l 0 统计分析软件进行分析，本文结果均以均值标准差( s d ) 表示，两组比较采用t 检验，三组比较采用o n e w a ya n o v a 检验，p 冻存 消化细胞( 消化方法同上) ，细胞计数后，收集细胞悬液至离心管中1 l o o r p m 离心 1 0 分钟，弃上清液。按照3 - 5x1 0 6 m l 加入冻存液。将悬液分至冻存管中，每管lm 1 。 将冻存管口封严。贴上标签，写明细胞种类，冻存同期。按下列顺序降温：室温一4 ( 2 0 分钟) 一冰箱冷冻室( 2 小时) 一低温冰箱( 一8 0 过夜) 一液氮。注意： 操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期检查，随时补充。 。 ( 2 ) 复苏 准备一个1 0 0 0 m l 的烧坏，内装2 3 杯3 7 的温水。从液氮中取出冻存管、迅速置 于温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在1 分钟之内融化。打开冻存管，将细 胞悬液吸到离心管中，加入d m e m 培养基2 0 m l 。1 2 0 0 r p m 离心1 0 分钟，弃去上清液。 细胞沉淀再加入l o m l 培养液，吹打均匀，再离心l o 分钟，弃上清液。 加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中，3 7 培养。 北京协和医学院中国医学科学院清华人学医学部硕l 研究生学位论文 3 脐血标本获取 方法同第一部分 3m n c 制备 方法同第一部分 4m n c 和f l 州s c 混合培养 消化f l m s c ，收集细胞悬液至离心管中，细胞计数。l1 0 0 r p m 离心1 0 分钟， 弃上清液。加入8 m l p b s ，l1 0 0 r p m 离心l o 分钟，洗去培养基，防止血清混入诱导 培养基中。制备好洲c ，按照i x l 0 5 f l - m s c 和l 1 0 6 脐血m n c 接种于l m i 含如 上因子的无血清培养基中，调整细胞密度，接种。培养条件为3 7 ，5 c 0 2 ， 每3 5 天半量换液，在第7 、l o 、1 4 天取出细胞胎盘兰计数 5 流式分析 方法同第一部分 6 免疫组化分析 方法同第一部分 7 透射电镜 方法同第一部分 8 统计学分析 方法同第一部分 北京* 目学院中国目 # r 镕$ 目学究生 论i 结果 1 f lm s c 细胞培养 细胞接种后2 4h 细胞变为长梭形、多角状，体积较大细胞均匀分布，无原代 细胞生长的集落形成。倒置显微镜下即可见培养瓶底有少量形态各异的贴壁细胞出 现，在接种后第3 - 4d 增长趋势晟为显著，数量明显增多，生长较均匀一致。培养 4 - - 5d 后，贴壁生长至8 0 0 旷9 0 汇合，可见贴壁细胞呈援形、多角形，细胞集落逐 渐增多、融合成片。以02 5 胰蛋白酶+ 00 1 e d t a 消化按12 l ：3 的比例传代。 2 共培养细胞形态 将f l m s c 与m n c 一起混匀后接种至无血清培养基中，m n c 细胞呈悬浮生长， 但通过倒置显微镜观察无血清培养基影响细胞贴壁，仅少量细胞能够贴壁。一些 细胞聚集生长( 图2 1 ) f i g2 lm o r p h o u so f i v l n cc o c u h u r e d w i t h m s c ( 1 e f l x4 0r i g h t 2 0 0 ) 3 扩增后c d 4 1 a + 细胞和c d 6 1 + 细胞数 以m n c 单独培养作为对照，单个核细胞训充质干细胞共培养，得到的c d 4 l a + 细胞 和c d 6 1 + 细胞数和阳性比例都明显增加，共培养组在1 0 天时得到的c d 4 1 f l * 细胞 和c d 6 l + 细胞数最多，见( 表1 和表2 ) 。 ：垡! 生! 兰旦! ! ! ：! ! ! ! ! ! ! 巴p ! 垡! 堑塑! g 竺! p 苎! ! ! 型! ：! ! ：! ! i ! ：i ! d a y 7 ( x1 0 5 m 1 ) d a y l 0 ( x1 05 m 1 ) d a y l 4 ( x1 0 m 1 ) 北京协和医学院中国医学科学院清华大学医学部硕：t 研究生学位论文 t a b l e2c d 6 1 + c e l l sc o m p a r e db yt w og r o u p sa td a y7 1 0 ，1 4 ( n = 3 ) 7 天时，共培养组的细胞总数相比单独培养组平均扩增了1 7 倍( p = 0 0 1 ) ，1 0 天时， 平均扩增了3 7 倍( p f f i 0 0 0 4 ) ，1 4 天时，平均扩增了1 7 3 倍( p = - 0 0 9 ) 。这表明共 培养组能有效刺激了细胞总数的增加( 图2 2 ) 。为了检测是否由于f l m s c 在无血 清培养基中的增值导致细胞总数急剧增加，将f l m s c 单独接种在无血清培养基中， 6 孔板每孔1x1 0 s m l ，在7 天后细胞大量死亡，在1 0 天时没有细胞存活。 071 01 4 d a y s f i g2 2t n cn u m b e ro fm n c a n dm n cc u l t u r e dw i t hm s c 4 t p o 浓度测试 t p o 是刺激巨核细胞体外扩增的关键因子，为了观察是否由于f l m s c 分泌t p o 导致细胞总数增加，我们进行了t p o 的浓度梯度分析它对巨核细胞扩增的影响。设 计了1 0 0n g m l ，2 0 0 n g m l ，4 0 0 n g m l 三个浓度( n = 3 ) 。经过两周的培养，在7 天， 1 0 天和1 4 天的活细胞计数和流式分析，发现增加t p o 浓度对扩增单个核细胞总数 和提高c d 4 1 a 和c d 6 1 阳性率作用并不明显，经统计学分析没有意义( 表3 ) ，这 说明，f l m s c 是通过其它因子，或直接接触造成的细胞总数增加，无法通过调节 现有因子组合来增加细胞总数。 一【一mo o o _ 【一u z b | 匕京协和学十目医学科学院清华大学e 学部 究生学论i t a b l e3 pv a l u eo f c d 3 4 + c e l l sc d 4 1 a n d c d 6 1 c e l l s c d 3 44 ( 7 i ) 4 1 a + c e l l s n u m b e r s i n 廿l r e e t p o c o n d i “o n c d 4 i fc e l l sc d 6 】_ c e l l s 7d a y 1 0 d a y 02 3 1 4 m t h ec e l l sw e r ec u l t u r e dw l t h1 0 0 n g m lt p o ，2 0 0 a g m l t p oa n d4 0 0 n g ，m j t p od a mc o l l e c ta t d a y7 ，1 0 ，1 4 ( r 1 2 4 ) + s h o w e d l l l oc e l l s 5 巨核细胞形态 培养至1 4 天取细胞，免疫组化观察巨核细胞形态，细胞核呈蓝色，c d 4 1 阳性细胞 的胞膜或胞浆呈红色：阴性细胞无色。与共培养组相比单个核单独培养组能观察到 一定比例的多倍体巨核细胞，即成熟产板型巨核细胞，共培养组多倍体巨核细胞较 少。但单独培养的c d 4 1 + 细胞的细胞核与共培养组形态有一定差别( 图23 ) 。 八、 蘩 f i g23h i s t o c h e 皿so fc i m l + c e l l sas h o w e dm o r p h o u so fc d 4 1 + c e l l si n d u c e df r o mm n cb s h o w e d m o 呻o u s o f c d 4 1 + c a l l s r e d u c e d f r o m m n cc u l t u r e d w i t hf l o m s ct h e p o i n t t oc e l l n u c l e u s o f d l f f e m n ts h a p eb e t w e e n t w o g r o u p sc w a sc o n t r o l f o r a a n d b ( 4 0 0 ) 进一步观察细胞内微观结构我们作r 电镜分析，发现巨核细胞胞浆发育比较成熟 可见有明显的颗粒形成，膜系统发育完整，但细胞核仍呈现较原始状态( 图24 ) 。 叠 誊，警； 北京悱和学r 十日学羊_ 院卅牛 学医学顿l 兜生学位论史 f i g2 4t h ec y l o p l a s mo fm e g a k a r y o c y t eo b s e r v e db yt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p y as h o w e d m e g a k a r y o c y t eg e n e r a t e df r o mm n cbs h o w e dm e g a k a r y o c y t eg e n e r a t e df r o mm n cc u l t u r e dw i g m s c( 6 5 0 0 0 ) 同时我们用流式细胞仪检测了1 4 天细胞的d n a 水平，以c d 4 a 设门，检测c d 4 1 a + 细胞的倍体水平，结果与组化结果相符，巨核细胞以二倍体、四倍体细胞为主，单 个核细胞单独培养组多倍体较多。 北京协和医学院中田医学科学院清华人学医学部颂i j 研究生学位论文 结论 胎肺间充质干细胞能有效刺激细胞总数增加，也对巨核细胞发育产生影响。共培养 是体外扩增巨核细胞一个可行的补充方法。 北京协和医学院中国医学科学院清华人学医学部硕i ：研究生学位论文 讨论 因为缺少骨髓供者，脐i t l i ( c b ) j 蒸渐成为继骨髓、动员的周血( m p b ) 之后的又 一h s c 的来源，其中含有丰富的造血干，祖细胞，有着多向分化的潜能；，在临床治 疗中，脐血干细胞移植无来源限制，免疫原性低，不易受病毒或肿瘤污染。随着脐 血干细胞移植技术的不断完善，它可能会代替目前自体外周血干细胞移植的地位， 在临床应用有较大潜力。但是成人移植所需干细胞的量是巨大的，如将它应用到成 人则受到了限制，需要克服几个难题，必须要有足够的造血干细胞的数量满足成人 的需要o o ，4 3 ，4 4 ) ，必须要有足够的巨核祖细胞数。否则会导致移植后血小板恢复 延迟( 4 5 ) 。已经有很多实验室对体外扩增巨核细胞进行了广泛的研究( 1 8 ) 。但是对于 从脐血干细胞来扩增巨核细胞，仍然有很多问题存在。如最佳产生巨核祖细胞的培 养条件，脐血干细胞本质的能力问题。有很多研究表明脐血干细胞不能得到最终的 成热的多倍体细胞( 4 6 4 8 ) ，有实验表明是由于细胞内微环境的不同造成巨核细胞成 熟程度不同，细胞大小不同( 4 9 ) 。体外扩增巨核细胞输注作为一种新的治疗手段已 开始进入临床i i i 试验阶段，临床结果表明输注体外扩增得到的巨核细胞较安全， 并且初步显示出一定的临床疗效，不过用于成人移植的巨核细胞主要来源于外周血 c d 3 4 + 细胞的扩增( 5 0 ) 。 脐血来源的c d 3 4 + 细胞诱导的巨核细胞，很少出现1 6 及其以上倍体，外周血来 源的c d 3 4 + 细胞则很容易产生3 2 倍体甚至6 4 倍体也很明显( 4 6 4 。n 。而血小扳的释放可 能主要依赖于成熟的多倍体巨核细胞，所以解决脐血c d 3 4 + 细胞诱导为多倍体巨核 细胞，对于移植后血小板的快速恢复，可能是一个很重要的应用问题。所以在体外， 我们可以尝试用一些因子诱导脐血c d 3 4 + 细胞产生成熟的多倍体巨核细胞。在体外 诱导巨核细胞分化的因子中i l 1 l 是一个促进巨核细胞成熟的重要的因子( 5 1 ) ，它 的作用是由t p o 介导的。在没有i l 1 l 的存在下，脐血巨核细胞很难产生成熟的多倍 体细胞，t e w e ic h e r t 等人使用7 种因子t p o ，i l 3 ，s c f , i l 6 ，f l ，i l 9 ，a n dg m c s f 大量的扩增的了巨核细胞，但没有添加i l 1l ，得到的巨核细胞在培养一周和两周时 检测没有发现1 6 倍体和3 2 倍体。g i a n f r a n c om a t t i a 等人( 4 7 ) 证实在培养1 2 天后，动员 的外周血来源的干细胞得到的巨核细胞2 n = 3 5 8 ，4 n = 2 7 4 ，8 n - - 1 8 8 ：，1 6 n = 1 2 3 ，3 2 n = 4 3 6 4 n 1 4 0 3 ：而来源于脐血的巨核细胞2 n = 8 3 9 ， 4 n = 1 3 5 ，8 n = 2 6 ，他们同样没有添加i l 1l 。 在我们的实验中，使用i l 1 l 后，在7 天时得到了部分成熟的多倍体巨核细胞，但在 1 0 天到1