（农业昆虫与害虫防治专业论文）褪黑素与意大利蜜蜂行为发育关系的初步研究.pdf

摘要褪黑素( 5 一甲氧基一n 一乙酰色胺，m e l a t o n i n ，) ，在脊椎动物中，是由松果体分泌的具有典型光周期信号作用的内源激素。褪黑素在生物界中存在广泛，从低等的单细胞生物到脊椎动物甚至植物中都有褪黑素的存在。经试验证实，在蜜蜂中褪黑素集中在头部。本文应用放射免疫法( r i a ) 对不同行为发育和表现的意大利蜜蜂的褪黑素进行了测定。结果表明意大利蜂头部的槌黑素不仅与其分工相关，并且具有一定的节律变化的特点具体结果如下：1 、不同日龄的工蜂，其头部褪黑素含量不同，采集期维持高含量水平，在2 1 日龄达到最大值，达到2 1 3 1 4p e d 头，是最低值1 日龄6 0 8p e , 头的3 5 倍。2 、不同分工的工蜂与其体内的褪黑素的含量水平有关：外勤蜂体内的褪黑素的含量高于内勤蜂的褪黑素含量。含量最高的采粉蜂数值达4 0 4 1 2p 头，最低的是哺育蜂，含量达1 1 3 1 p 头。最高值与最低值间差异大约是3 0 倍。3 、褪黑素具有日节律变化，具有两个高峰值，分别在早上7 ：2 0 和晚上1 9 ：2 0 左右，褪黑素含量分别是1 6 7 1 6p g 头和1 2 3 8 3p e g 头，是最低值凌晨1 ：2 0 ，为2 6 2 7p e g 头的6 3 6 倍和4 7 l 倍。两个峰值出现的时间分别为工蜂出巢采集的时间和回巢休整的时间，初步证实了褪黑素作为光周期信号的一个特征。4 、全年不同月份工蜂褪黑素的测定结果表明，采集期间采粉蜂褪黑素的含量水平很高，并具有两个峰值，分别出现在3 月和l o 月；哺育蜂的褪黑素含量从3 月到1 0 月中旬，相对稳定。在1 1 月份到来年2 月份各类蜂的褪黑素水平都相对较低。关键词：褪黑索，意蜂，放射免疫测定( p a a ) j ia b s t r a c tm e l a t o n i n ，n - a c e t y l 一5 一m e t h o x y t r y p t a r n i n e ，s e c r e t e db yt h eb r a i nc e l l si nh o n e y b e e s ，i sat y p i c a lp h o t o p e r i o d i cs i g n a ln e u r o n - h o r m o n e i t sw i d e l yd i s t r i b u t e do v e rl o t so fl i v i n go r g a n i s m sa sd i f f e r e n ta sp r o k a r y o t e sa n dv e r t e b r a t e s ，e v e ni np l a n t s w et e s t e dt h ew o r k e r sm e l a t o n i ni n4 肪m e l l i f e r al i g u s t i c as p i n o l ao fd i f f e r e n tb e h a v i o rd e v e l o p m e n t sb yr i a ( r a d i o i m m u n o a s s a y ) m e t h o d i ts h o w e ds o m ec o r r e l a t i o nb e t w e e nm e l a t o n i n ，t h ew o r k e r sa g e ，a n dt h ew o r k e rl a b o rd i v i s i o n ，a n dt h e r ew e r eam e l a t o n i nd a i l yr h y t h ma n day e a rr h y t h mo f t h ew o r kb e e s f o l l o w i n gi st h er e s u l t s ：1 i ts h o w e dt h a tt h em e l a t o n i nc o n c e n t r a t i o ni sr e l a t e dt ot h ea g eo f w o r k e rb e e s t h em e l a t o n i nc o n c e n t r a t i o nw a sh i 曲e rf r o mt h ef o r a g e rw i t h21d a y sc o m p a r e dw i t ht h eo t h e ra g e s t h eh i g h e s tm e l a t o n i nl e v e lc a m ef r o m2 1 d a y s b e e ( 2 1 3 1 4p g b e e ) a n dt h el o w e s tl e v e lw a si d a y sb e e( 6 0 8 p g b e e ) ，t h ef o m e r sw a sg r o s s l y3 5 t i m e sh i g h e rt h a nt h el a t t e r s 2 t h em e l a t o n i nc o n c e n t r a t i o ni sr e l a t e dt ot h ew o r k e rl a b o u rd i v i s i o n t h em e l a t o n i nc o n c e n t r a t i o ni nf o r a g e r sw a sh i g h e rc o m p a r e dt oy o u n g e rb e e s t h eh i g h e s tm e l a t o n i nc o n c e n t r a t i o no f p o l l e nc o l l e c t o rw a s4 0 4 1 2p g b e ea n dt h el o w e s tw a st h en o r s eb e e so f 】1 3 1 p g b e e ，t h ef o m e r s sw a s3 0t i m e sh i g e rt h a nt h el a t t e r s 3 t h em e l a t o n i nc o n c e n t r a t i o nf r o mw o r k e rb e e ss h o w e dad a i l yr h y t h m ：t h eh i g l l e s tl e v e la p p e a r e da t7 ：2 0 a ma n d1 9 ：2 0 p m ，t h em e l a t o n i nl e v e lw a s1 6 7 1 6 p g b e ea n d1 2 3 8 3 p g b e er e s p e c t i v e l y ；t h el o w e s tl e v e lw a s2 6 2 7 p g b e ea p p e a r e da t1 ：2 0 a m ，t h ef o m e r sw a s6 3 6 a n d 4 7 1 5 t i m e sh i g h e rt h a nt h el a t t e r s 4 t h em e l a t o n i nc o n c e n t r a t i o nf r o mw o r k e rb e ec h a n g e dw i t hm o n t h t h eh i g h e s tc o n c e n t r a t i o nf r o mf o r a g e r sa p p e a r e da tm a r c ha n do c t o b e r ；t h ec o n c e n t r a t i o nm a t a i n e das t e a d yl e v e lf r o mm a r c ht oo c t o b e rf o r t h en o n f o m g e m t h em e l a t o n i nl e v e l sw e mr e l a t i v e l yl o w e rf r o mn o v e m b e rt on e x ty e a r sf e b u r a r yf o rd i f f e r e n tk i n d so f b e e s k e y w o r d s ：m e l a t o n i n ，却括m e l l i f e r a l i g u s t i e a s p i n o l a ，k i ai i i独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生虢扬旗帆一年月7 7 日关于论文使用授权的说明本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：毒为豁时间：掰年多月夕r导师签名：弋吣同：爱卯年善马f7 日中国农业文学硕士学位论文第一章引言皇詈鼍曼! 曼i i i , 曼舅曼曼曼蔓量曼皇昔鼍曼! ! 曼苎曼曼曼舅曼曼第一章引言行为是生物自身很多生化反应综合作用的结果，是生物为更好的适应环境、生存、繁衍而调整自己的生活方式的活动。动物行为的一个中心问题就是研究调节胚后行为发育( b e h a v i o r a ld e v e l o p m e n t ) 的机制，特别是对于高度可塑性的行为发育。行为发育是研究生物行为的产生及发展的新学科。它对了解生物，尤其是社会性生物行为变化、行为模式的形成及其与环境条件的关系是十分重要的。对生物行为模式的协调与改造也离不开来自其行为发育机制的研究结果。蜜蜂表现出了复杂的社会组织和精确的与年龄相关的行为发育特性蜜蜂易于接近，易于修正对其行使的操作措施，因而成为行为学研究的极好材料。褪黑素( m e l a t o n i n ，m l t ，n a c e t y l 一5 m e t h o x y t r y p t a m i n e ) 又名松果体素。是在脊椎动物中，主要由松果体分泌的一种神经内分泌激素，是带有碍i 哚环的生物胺源。具有光敏感性，能接收外界光、暗信号，调节自身的分泌，从而调节动物的生理生化活动，影响动物的行为”。长期以来，人们知道蜜蜂对时问有感觉，并对他们的行为和代谢进行了研究。但却未见到褪黑素与蜜蜂行为节律关系报道。1 、意大利蜜蜂的生物学特性意大利蜜蜂，学名a p i sm e l l i f e r al i g u s t i c as p i n o l a ，是西方蜜蜂的一个亚种，简称意蜂。在分类学上属于节肢动物门( a r t h r o p o d a ) 、昆虫纲( i n s e c t a ) 、膜翅目( h y m e n o p t e r a ) 、细腰亚目( a p o c r i t a ) 、蜜蜂总科( a p o i d e a ) 、蜜蜂科( a p j d a e ) 、蜜蜂亚科( a p i n a e ) 、蜜蜂属( a p i s ) 、意大利蜜蜂( a p i sm e l l i f e r al i g u s t i c as p i n o l a ) 。意大利蜜蜂原产于意大利的亚平宁半岛。原产地地中海气候和蜜源条件的特点是：冬季短、温暖而湿润；夏季炎热而干旱，花期长。在类似以上的自然条件下，意大利蜂可表现出很好的经济性状：在冬季长而严寒、春季经常有寒潮袭击的地方，适应性较差。该蜂种适应于我国大部分地区的气候、蜜源特点，因此当2 0 世纪初由日本和美国引入我国后，深受各地欢迎，推广极快。成为我国当前饲养的当家品种。生物学特征：意蜂由于蜂王产卵无节制，消耗饲料多在逃避敌害，个体耐寒性方面不如中蜂。，意蜂性温驯，不怕光，提脾检查时，蜜蜂安静，产卵力强，春季群势发展较平缓，分峰性弱，能维持大群，从春到秋能保持大面积子脾，维持强壮的群势。工蜂对大宗蜜源采集能力强，善于采集持续时问长的大蜜源，泌蜡造脾力强，吻较长，可利用长花管蜜源，产浆力强。护脾和清巢能力强，盗性强，定向力较差，易迷巢错投，在较高纬度地区越冬性能较差，饲料消耗量大，抗蜂螨及幼虫病能力弱，采集蜂胶多。形态特征：蜂王的腹部多为黄色至暗棕色，尾部黑色。只有少数全部是黄色。工蜂腹部细长，腹板几丁质黄色；第2 4 腹节背板的前缘有黄色环带，黄色区域的大小和颜色深浅有很大的变化，一般以鼯个黄环为最多，体色较浅的意大利蜂常具有黄色小盾片，特浅色型仅在腹部末端有一棕色小斑，称黄金种蜜蜂。工蜂腹板几丁质黄色，第二至第四节腹节背板前缘有黄色环带。体长1 2 1 4 毫米，体表绒毛淡黄色；喙长6 2 6 9 毫米。雄蜂体长1 4 1 6 r a m ，蜂王体长1 6 - - 1 7 m m 。中国农业大学硕士学位论文第一章引言蜜蜂是一种以群体为单位生活且高度社会化的昆虫。蜂群的生长繁殖包括蜂群在一年四季的生长衰落的周期变化和分蜂的发生。蜂群中蜜蜂和蜂子的数量每年都有相似的周期性变化。在蜜源丰富的季节，蜂群一般有一只蜂王、几百到上千只雄峰和数万只工蜂组成j l “。工蜂在蜂群内参加何种工作，与其日龄、蜂群需要以及环境条件的变化有关。蜜蜂工蜂显示了一个行为发育的复杂模式，工蜂随着年龄变化而改变其工作，在蜂群中创造了一种与年龄相关的劳动分工：幼蜂( 1 2 周) 进行哺育幼虫和清理巢房；青年蜂( 2 3 周) 进行酿蜜和泌蜡造脾；3 周以上的工蜂则去采集或进行蜂群保卫工作( w i n s t o n ，r o b i n s o n1 9 9 2 ) 。这种发育程序不是固定不变的，可通过改变蜂群环境而加快或延缓【1 ”。为了更好的利用蜜蜂资源掌握蜜蜂的活动规律及其内在本质科学家对蜜蜂的生理节律及其引起蜜蜂的生理节律的因素进行了大量研究，提出了许多学说。2 、褪黑素的发现历程及分布褪黑素的发现最早可追溯到1 9 1 7 年，m c c o r d 和a l l e n 为寻找治疗白斑病的药，在做实验时把牛的松果腺体喂给蝌蚪吃，3 0 分钟后，蝌蚪皮肤、内脏变得透明，清晰可见。1 9 5 8 年，耶鲁大学l e m e r 等人用4 年的时间，从2 0 万头牛的松果腺体中，提取并纯化出使两栖类皮肤变白的激素类物质，并成功查明其结构是5 一甲氧基- n 乙酰色胺，当时命名为m e l a t o n i n ，意指褪黑素i ”4 2 , 4 3 1 。此后随着科学技术的发展与进步，在脊椎动物松果腺以外的组织中也发现了褪黑素，它能在视网膜、胃肠道中合成并释放，在唾液腺、血小板和哈德氏腺等组织中也有存在。1 9 6 9 年，j a c k s o n 在绣球百合h a e m a n t h k a t h e r i n a e 的胚乳细胞中检测出褪黑素。随后，不同的学者用高效液相色普法和放射免疫法在水稻、玉米、油菜、萝h 、姜、番茄、黄瓜、苹果、草莓、忍冬、和烟草等不同国家的被子植物的1 6 个科的2 9 种植物中检测到褪黑素。而且不同植物的叶、茎、根、果实、种子中的褪黑素浓度的波动范围很大，如，甜菜掇中褪黑素含量仅为2 p g g 湿重，而在高茎酥油草颗粒中却能超过5 n g g 干重。不仅高等植物中，在许多藻类植物中，也测到褪黑素的存在”q 。其中，单细胞藻类多边膝沟藻g o n y a u l a x p o l y e d r a 中，褪黑素的最大浓度大约为3 5 n g m g 蛋白质，与脊推动物松果腺中的褪黑索浓度相当。褪黑素在低等生物腰鞭毛虫g o n y a u l a x p o l y e d r a h e 和一种细菌r h o d o s p i r i l l u mr u b r u m 中也被检测到。这种细菌在连续黑暗条件下比连续的光照下褪黑素浓度显著升高，且与合成酶的活力有关| l ”。在脊椎动物中，褪黑素是主要由松果体合成分泌的一种神经激素，黑暗刺激其分泌。褪黑素在血液中浓度白天低、夜间高，且褪黑素含量夜间高水平的持续时间与黑暗时间相一致。从哺乳动物的研究报道中可知，褪黑紊是一个内分泌信号，服瞎依据该信号接受明一暗信息。进而通知整个身体来调整睡。醒周期，褪黑素分泌水平的这种昼夜节律性变化作为光照变化的内分泌信号，参与调节许多生理节律和免疫功能，并能促进前胸腺激素的释放。此外，褪黑素对动物生殖系统、毛发替换和脂肪代谢、睡眠、心血管系统及抗氧化作用等方面都具有重要的调节作用 4 0 5 3 , 5 5 , 5 8 。从原生生物到最高级哺乳动物。褪黑素在生物界中分布极为广泛，特别是在原生生物中发现褪黑素，有力地证明了其在生物进化的早期阶段就已存在，并伴随着生物由低等向高等不断进化而保留至今，是生物进化的保守因子，具有进化的刻板性”“。中国农业大学硕士学位论文第一章引言3 、褪黑素在昆虫学中的研究从褪黑素被发现以来，对脊椎动物特别是哺乳动物的褪黑素水平及其作用机制进行了大量研究，相比之下，对昆虫褪黑素方面的报道却很少。3 1 褪黑素水平在昆虫体中的节律关于昆虫褪黑素的首次报遵是在1 9 8 4 年研究蝗虫复眼后做出的j 。此后，仅对儿种昆虫体内的褪黑素水平进行了研究。( 如家秋耕捌：果蝇【6 帕；豆娘【2 5 】；家蚕f 5 吼；蚜虫f 州；蟋蟀【2 3 】。这些昆虫中的大多数种类中检测到了褪黑素并发现其褪黑素水平也具有生理节律。1 9 8 4 年，v i v i e n 等首次利用放射免疫的方法检测到蝗虫复眼中存在褪黑素，每只复眼的浓度在1 0 5 2 6 5 p g 之间波动，并发现浓度高峰出现在夜间，光照末期其浓度最低，还发现褪黑素浓度具有年节律变化弘”。i t o h 等发现在蟋蟀产卵3 日后，卵中就出现褪黑索合成的关键酶n 一乙酰转移酶( n a t ) ，5 1 1 日后，在其卵中就可到测到褪黑素，并且呈现明显的昼夜节律变化1 2 3 j 。研究还提到，在昆虫体躯内的褪黑素含量很低或因太少而低于测量极限，而头部的褪黑素含量相对很高，所以通常把头部的褪黑素食量看作整个虫体的褪黑素含量。3 2 褪黑素对昆虫生殖的影响昆虫体内褪黑素对其机体的寿命的影响也有相关的试验结果。例如b o n i l t a 等研究了褪黑素在黑腹果蝇寿命中的作用。b o n i l l a 推测褪黑素起抗氧化和自由基清除工具的作用，这种激素能够预防飞行组织的氧化和降低老化过程。在饲料中补充浓度为1 0 0 微克毫升的褪黑索能够显著延陡果蝇的寿命。用褪黑素饲喂的果蝇最长寿命可达8 1 5 天，而对照即不补充褪黑素的果蝇最长寿命为6 1 2 天。饲喂褪黑素的果蝇的寿命相对增长了3 3 2 。此外，在进行过氧化物毒性的测试中用褪黑素处理的果蝇对百草枯的抵抗力也有所增加l o ”。捌黑索作为一种内源激素不仅对生物体的寿命有一定的影响，通过试验证实其对动物的交配能力也有一定的影响，这方面对昆虫的研究较其它动物深入一些，这也是由于昆虫比较容易观察，易于接近，改变其行为也比较容易的特点所决定的。v i v i e n - r o e l s 等研究发现给雌性黑腹果蝇( d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r ) 注射l n m o l 褪黑紊后发现其与雄性黑腹果蝇交配次数和产卵能力明显降低。这表明褪黑素对昆虫的生殖系统有影响，褪黑素对昆虫生殖系统具有一定的调控的作用1 6 0 l 。t i l d e n 等对豆娘e n a l l a g m ac f v 池和i s c h n e r av e r h c a l i s 的褪黑素水平进行了研究。z v e r t i c a l i s 是一雌一雄制，一生只交配一次，其雌虫成虫主要生活在水边产卵区，研究发现其褪黑素生理节律明显，在暗中期和低温周期中褪黑素在凌晨4 ：0 0 达到顶点，其褪黑素浓度范围为2 5 8 3 - - 4 6 7 5 p g 头，而e c i v i l e 的雌虫一生中则多次交配，而且只有交配和产卵时才出现在水边，对其褪黑素水平进行检测发现其褪黑素节律并不显著，在分别持续1 5 、2 5 。c 和3 0 c 下进行光照1 2 小时和黑暗1 2 小时为一周期测量其褪黑素水平都不显著，褪黑素水平大致为3 0 3 p g - 头1 2 5 】。在褪黑素对昆虫生殖的研究过程中，发现褪黑素与光照的关系极为密切。这与研究其它生物体的褪黑素得到的结果相一致。这是因为生物体繁殖、生态习性的年节律和昼夜节律都受到中国农业大学硕士学位论文第一章引言自然界的光周期调控，光周期是其繁殖和停育等生理过程的时间信号，因此作为光周期信号的褪黑素同光照的关系紧紧相连。例如6 a o 等对豌豆蚜( a c y r t h o s i p h o np f s w n ) 体内的褪黑素水平的研究发现：豌豆蚜在长日照的夏日象件下，进行无性生殖：秋天在短日照的作用下，就产生雄蚜和性母( 交配后产滞育卵) 的出现。在长日照的条件下，利用褪黑素处理蚜虫可以出现孤雌胎生蚜，而且发现雄蚜和中间雌蚜( 孤雌胎生蚜) 的出现率与食物中褪黑素的浓度相关。高浓度褪黑素饲喂的蚜虫后代雄蚜比率要远远高于低浓度褪黑素饲喂的蚜虫。即不间断饲曜高浓度的褪黑素会出现短日照或者长黑赔的条件f 才出现的结果，并且所有用褪黑素处理的蚜虫产生的后代都比只用纯净饲料饲喂的蚜虫产生的后代少。研究还发现用低浓度褪黑素处理的蚜虫其成年前的死亡率在1 9 2 - 2 7 3 之间变化，但是差别不显著。而用高浓度褪黑索处理可使蚜虫的成年前死亡率达到5 8 6 l z 4 l3 3 褪黑素对昆虫行为的影响褪黑素作为自然界广泛存在的分子，同生物机体为适应环境而发生相应的行为改变也有一定的联系。对其行为的改变有些是通过褪黑素含量的改变使体内其它激素的水平变化来实现的。r i c h t e r 等研究了褪黑素对美洲小蠊促前胸腺激素的影响。促前胸腺激素是头部的一种神经肽，能够刺激蜕皮腺产生蜕皮激素。1 0n m o l l 的褪黑素对促前胸腺对促前胸腺激素的作用产生一定影响。大脑中促前胸腺激素释放的作用会受到褪黑素的前突触受体l u z i n d o l e 的抑制。该实验首次证实了褪罴素在昆虫神经系统中对神经激素释放的作用“。人们一直认为保幼激素( j h ) 是蜜蜂行为发育的调节因子之一。囡为采集蜂具有高浓度的保幼激素，而青幼年蜂的含量却很低。此外，用保幼激素类似物处理青幼年工蜂，可促进使其提前采集p ”。然而近年来s u l l i v a n 等的试验表明当把工蜂分泌保幼激素的咽侧体( c o r p o r aa l l a t a ) 除去后，工蜂仍可去采集。此外，当把没有保幼激素的低龄工蜂放迸一个没有老蜂的蜂群后，它们仍可以出巢采集。可见保幼激素不是激发工蜂采集的根本原因。因此有人猜测褪黑素可能是调节蜜蜂行为发育的重要激素物质，可能会对蜜蜂分工、行为发育等发面发挥重要作用。此项研究还在进一步进行中。3 4 褪黑素分子生物学在昆虫学中的研究展望褪黑素在生物体内的合成受控于两个酶的催化，一个是n a t ( s e r o t o n i nn * a c e t y l t r a n s f e r a s e ) ，另一个是h 1 0 m t ( h y d r o x y i n d o l e o m e t h y l t r a n s f e r a s e ) 。目前，对h i o m t酶的分子生物学研究较少，仅见到少量报道：面研究的较多的是上述第一个酶( n a t ) 。在人、一些哺乳动物和一些昆虫中发现该酶的活性与体内褪黑素的分泌量相关密切；该酶的分子量r n a 和d n a 等生化和分子生物学特性也有深入的研究和报道。这为人们深入了解褪黑素的产生、生理生化代谢与行为调控的关系奠定了基础m 。“。总之。昆虫作为生物界一类数量庞大种类繁多的生物，因其具有生活周期短，培养代价小易于接近，也易于修正对其行使的操作措施等特点决定了昆虫是研究褪黑素多种功能的适当材料。昆虫褪黑素的深入研究对人们深入了解不同昆虫的生活习性、行为发育、生理节律、生殖繁衍以及与环境关系等方面都是十分有意义的。例如可以通过外源键黑素量的补给使一些有害中国农业大学硕士学位论文第一章引言昆虫的产卵能力下降来达到防治和减少损失的目的；也可通过对其褪黑素水平的调控改变目标昆虫的活动和繁殖节律而得以人工调控。当然这些都是建立在对褪黑素在昆虫体内作用机制研究清楚的基础上才能进行的。目前，对昆虫褪黑素的研究还处于初始阶段，相信随着研究和开发的深入，褪黑素也必将逐步进入昆虫领域，担当起昆虫活动、繁殖、行为调控、抗性等方面的重要角色4 、褪黑素的主要测定方法褪黑素含量测定方法包括放射免疫法r a 、酶联免疫法e l i s a 、紫外分光光度法u v 、气相色谱法和气相色谱一质谱联用法g c m s 、高效液相色谱法、高效液相色谱一质谱联用法l c - m s 及毛细管电泳法和化学发光法等。本研究采用放射免疫法( r a d i o i m m u n o a s s a y , r i a ) 。放射免疫分析的基础是标记抗原和非标记抗原对特异抗体的竞争性抑制反应。1 9 6 0 年，y a t o w 和l k r s o n 在研究胰岛素免瘦测定的基础上，利用胰岛素抗体和标记胰岛索作为关键性试剂，建立了放射免疫测定方法。这种方法是将免疫学中的高度特异性与放射性示踪原子的高度灵敏性结合，产生的一种体外检查的超微量分析法i ”i 。褪黑素的r i a 测定是利用标记褪黑素与特异的兔抗血清结合，待反应平衡后，加入待测样品，放在4 温度下，反应充分平衡，分离，然后测量计数。该技术用在褪黑索研究中的好处是褪黑素不必提纯就可以测量，而且本法可测范围是1 5 3 1 1 5 0 0 p g 每管，批内变异系数6 7。批间变异系数是1 4 8 ，灵敏度高，特异性强，重现性好，最低浓度值是0 5 p g l l 4 ”。放射免疫测定技术因为具有高度灵敏性、强特异性、简便操作等优点，为较多研究者采用。到目前为止，可应用的测定楗黑素的标记抗原有两大类，一类是“5 i 一褪黑索，另一类是3 h 褪黑素。应用前者的放射免疫测定虽然灵敏度较高，但需氧化制备及高压液相色谱分离；此外，“5 1 褪黑素的生化特性改变较大，3 h 一褪黑素的生化特性与褪黑素无显著差异；“1 放出是硬b 射线，而且射程长，比起。h 对实验者更容易引起意外伤害：购买的“i 褪黑素常会被不明化合物污染：“5 i 的探测效率高，可以不用闪烁液，而。h 褪黑素则需要脂、水两溶的闪烁液激发测定，所以对所需抗体的效价要求高。因此，相对而言，应用3 h 褪黑素作为标记抗原的方法比较简单可行。在整个测定的过程中，竞争反应后抗原抗体结合的褪黑素与未结合褪黑素的分离问题也是关键，根据小分子褪黑素与特异性兔抗血清结合后整个的分子变大，可采取葡聚糖碳来分离法，二抗沉聚法或者固体吸附法。该方法的缺点：只能测定具有免疫活性物质，被测物和标准物都不能全部参与反应，影响因素较多，有的流程较长，存在放射线辐射和污染等阀题。5中国农业大学硕士学位论文第一章弓l言5 、研究的主要内容及目的褪黑素与蜜蜂行为发育关系的研究是昆虫行为学的一项基础研究。近年来中国农业大学昆虫系与美国密西根州立大学蜜蜂研究室进行合作，使用意大利蜂研究初步发现，生活在黑暗蜂箱中的青幼年蜂的活动没有节律，而采集蜂有明显的节律。蜜蜂作为具有高度社会组织的昆虫，明确其行为调控的因子，有利于我们了解蜜蜂及其它昆虫行为发育机制。本论文通过设计，使用意大利蜂研究褪黑素是否是调节蜜蜂行为发育的重要化学物质，并研究高含量和有节律的褪黑素是否与工蜂年龄及任务之间存在定性与定量关系。其结果将为从分子水平上进一步揭示褪黑素对蜜蜂行为发育机制的调控提供依据。研究主要内容：1 研究测定不同日龄工蜂体内的褪黑素的含量。2 研究测定不同不同任务工蜂体内的褪黑素的含量。3 研究测定相同日龄期不同时辰工蜂体内的褪黑素含量的日变化。4 研究测定不同月份的采粉蜂及哺育蜂体内的褪黑素含量的年变化。6第二章材料与方法1 、实验仪器和用具高速离心机、液体闪烁测定仪、振荡器、匀浆器、旋转蒸发仪、漩涡混合器、超低温冰箱、冰箱、微量天平、微量进样器、移液枪( 1 0 m ! 、1m l 、2 0 0 u 1 ) 、1 0 m l 闪烁杯、离心管( 1 6 1 2 5m m ) 、玻璃管( 1 2 x 7 5 m m ) 、巴氏吸管、玻棒、烧杯、量筒、远红外快速干燥箱、数显恒温水浴锅。2 、试剂的配制2 1 、缓冲溶液的配制i ) i m n a o h 溶液的配制4 0 9 n a o h 溶于1 l d g d w ( 双蒸水) 中，制成i m 溶液待用。置于4 c 的冰箱中待用。2 ) t r i e i n eb u f f e r 的配制1 7 9 9t r i c i n e 溶于8 0 0 m ld g d w ( z y , 蒸水) 中，在搅拌中用1 mn a o h 溶液调整p h = 5 5 ，后加d g d w 至1 l ，置于4 c 冰箱中( 有效期为一周) 。3 ) a s s a y b u f f e r ( 分析缓冲液) 的配制1 7 9 9 t r i c i n e 、9 0 9 n a c i 、l g g e l a t i n ( 明胶) 加至8 0 0 r n ld g d w 中搅拌加热至5 0 。c ，待g e l a t i n 溶解后，冷却，用1 mn a o h 溶液调整p h = 8 0 ，然后加d g d w 至1 l 。保存于4冰箱中( 有效期为一周) 。2 2 、d c c 的配制2 0 0 m la s s a y b u f f e r 、4 9c h a r c o a l ( 木炭) 和4 0 r a g d e x t m n ( 葡萄糖) 混合于烧杯中，在冰水中磁力搅拌一小时，保存于4 冰箱中，待用。2 3 、闪烁液的配制二甲苯7 0 0 m l ，曲拉通3 0 0 m l ，p p o ( c 1 5 h 1 1 n o ) 5 9 ，p o p p o ( 闪烁纯：c 2 4 h 1 6 0 2 n 2 )0 5 9 混匀、静置一周后待用。3 、放射性标记褪黑素( 3 h m e i a t o n in ，1 m e j m i ) 的稀释1 ) 取2 5 0 u 1i m c i m l 贮备液，加入纯乙醇( e t h a n 0 1 ) 2 4 7 5 m l 混匀，配成2 5 m l1 0 0 e i l m l 溶液；2 1 取出2 5 0 p l ( 1 0 l c f f m l ) 溶液加入2 4 7 5 m la s s a yb u f f e r 缓冲溶液混匀，配成2 5 m lo 1 n c u m l ( o 1 p e i m l = 2 2 2 0 0 d p m 1 0 0 1 ) 的溶液。( 含褪黑素浓度2 8 3 p g m 1 )3 )稀释后的溶液置于- 2 0 的冰箱中保存待用。74 、抗体的稀释1 ) 向原装的1 0 0 , u ! a n t i b o d y 中加入l m ld g d w 配成溶液，按2 0 y 1 分装t f 斤( 稀释1 0 倍) 茸丁- - 8 4 。c 保存：2 ) 取山上述溶液2 0 , u l ，加入a s s a yb u f f e r 缓冲溶液 9 8 0 9 l ，配成2 m l 溶液( 稀释1 0 0 倍) 。共稀拜t o ) ( 1 0 0 = 1 0 ( 1 0 倍。5 、标准褪黑素溶液的稀释l gm e l a t o n i n 加5 0m l 纯甲醇( m e t h a 0 1 ) ，配置成2 0 m g m l 的溶液a 。置于冰箱的- 2 0 保存特州。取上述a 溶液0 ，5 m l ，加入9 5 m l d g d w ，配制成1 0 r a l 的溶液b ( i m g m i ，40 c 保存) 。从b溶液中取出i 0 0 1 ，加入d g d w ，在容量瓶中调至1 0 0 m l ，得到溶液c ou m l ，4 保存) 。取出5 0 0 u1 溶液c ，加入d g d w ，在容量瓶中调至5 0 m l 的溶液d ( 1 0 n g m l ，4 c 保存) 。取出1 2 5u1 上述溶液，加入2 3 7 5u1a s s a yb u f f e r ，配制成2 5 m l ( 5 0 0 p g j n j ) r 作溶液d fw o r k i n gs o l u t i o n ) ，随用随配。6 、蜂源2 0 0 3 年6 月份向中国农业科学院蜜蜂所( 位于北京香山) 购买3 箱意火利蜂，记为1 箱、2 箱、3 箱；2 0 0 4 年5 月份在北京石景山吒再购买3 箱，记为4 箱、5 箱、6 箱。蜂群放二f 中国农业大学东侧的中国农业科学院原子能所院内饲养。幽2 1 蜂箱巢脾上的意丈利蜜蜂87 、蜂样的采集7 1 、自然蜂群的取样71 1 分工不同的蜜蜂1 ) 、2 0 0 4 年5 月2 8 日，上午8 ：0 0 - - 1 0 ：0 0 进行蜂样的采集，每一样本采集2 0 只蜜蜂。所有的蜜蜂样本来自1 、2 、3 蜂箱。蜂样编号如f 所示：j - i ：哺育蜂：从蜂箱中提出蜂脾，崩镊子提取探身于蜂房，哺育幼蜂的蜜蜂；j 一2 ：守fj 蜂：镊子捉取在蜂箱门口，闲散踱步的蜜蜂：j - 3 ：清尸蜂：置死蜂于蜂箱内，捉取对蜜蜂尸体进行拖，拉，拽，推并携带尸体e 蜂箱的蜜蜂；j _ 4 ：兵蜂：人为振动蜂箱，捉取从蜂箱内出来攻击的蜜蜂；j ，5 ：采粉蜂：堵住蜂箱门口，取在后足周围花粉篮内盛满花粉的采集归来的蜜蜂；j 6 ：采蜜采水蜂：堵住蜂箱门口的蜂路，捉取采集回来的肚子圆润，后足花粉篮里没有携带花粉的蜜蜂。2 ) 、2 0 0 4 年7 月3 日，上午8 ：0 0 一1 0 ：0 0 再次进行蜂样的采集，方法同上，记作p - 1 ，p - 2 ，p 3 ，p 4 ，采集的蜜蜂置于保鲜膜内，封口，放在盒子里，放置丁- 8 4 。c 的低温冰箱内保存待测。图2 2 蜂箱门u 采粉归来的意峰及守门蜂图2 3 蜂箱底部负责清理的清j1 蜂7 1 2 不同月份的蜜蜂按月采集采粉蜂和哺育峰( 休眠期内则捕捉蜂箱内成年蜂)每月1 2 日取样，中午1 0 ：o o 1 1 ：0 0 取样。2 0 0 4 年3 月份记作i - 12 0 0 4 年4 月份记作i - 22 0 0 4 年5 月份记作i - 32 0 0 4 年6 月份记作i - 42 0 0 4 年7 月份记作【- 592 0 0 4 年8 月份记作i - 62 0 0 4 年9 月份记作i ，72 0 0 4 年l o 月份记作i - 82 0 0 4 年1 1 月份记作1 - 92 0 0 4 年1 2 月份记作i 1 0中用农业人学顾j 学位论文筇幸利料1j 方法i i i i i i i2 0 0 5 年1 月份记作i - 1 12 0 0 5 年2 月份记作i - j 2采集的蜜蜂置r 保鲜膜内，封口，放在盒子里，放置r 一8 4 c 的低温冰箱内保存。其中，例2 0 0 4 年1 1 月份采样时发现蜜蜂逃逸，无法继续采集原蜂箱1 ：蜂，敞丁别处采集i 蜂样本，至2 0 0 5 年2 ，l j 7 2 、同龄蜂群的取样7 21 不同龄期的蜜蜂2 0 0 4 年5 月1 8 口，丁蜂箱内，提出蜂干多的蜂脾，振动，驱除成年蜜蜂只留已封盖的蜂脾，放在特殊的密闭网笼内，并放同原蜂箱。2 0 0 4 年5 月1 9 日标记新羽化出的1同龄蜜蜂用丙酮胶标记后放入蜂箱。以此类推至5 月2 7 日停止。共标记约3 0 0 0 只放入3 、4 箱中。并开始按照1 日龄，3 日龄。的顺序取不同日龄的蜂样。每样箨墩1 5 只，取争3 5 口龄。记做k 1 k 1 8 。丙酮胶的制法：选择可密封的小瓶( 如青霉素小约瓶) ，洗净干燥，将白色乒吒球用剪刀剪幽2 4 巢脾j 一标记t 蜂碎，放入瓶中，向小瓶中注入丙酮液，密封浸泡4 小时以上，调匀待川。一般初配制时，只制作小瓶中一牛的餐，以便在使用前调节丙酮胶的浓度。如果太浓加丙酮液稀释；太稀可打开瓶盖使部分丙酮挥发。丙酮胶的浓度可在试标记时做好。作向色标记不需添加颜料其它颜色的丙酮胶可在加入丙酮液前加入油画颜料。颜色的选择可在北蜜蜂上试标记，看是否能有利丁分辩。在标记操作时必须圃定蜜蜂，但义不能伤害蜜蜂，只宦标记在蜜蜂的中胸背板，不能误粘在头部、腹部、翅足等上面。我们标记蜜蜂多为刚羽化出房的幼蜂，州手小心按住蜜蜂胸部背扳两侧，将丙酮胶点在蜜蜂胸部背板上采集的蜜蜂置t 保鲜膜内，封口，放在盒子里，放嚣于8 4 c 的低温冰箱内保存。72 2 同日龄蜜蜂在2 4 小时内取样2 0 0 4 6 1 5 凶禁新羽化出的1 日龄蜂，装入无籽脾的笼中放入3 蜂箱。2 0 0 4 7 1 4r 取不同时液的蜂样，全天取蜂，每礴个小时一次，每次取1 5 只，一共取1 2 次。记录对间是取蜂的时间。1 09 ：2 0h 11 1 ：2 0h - 21 3 ：2 0h 一31 5 ：2 0h 41 7 ：2 0h 51 9 ：2 0h 68 、测定方法2 1 ：2 0h 一72 3 ：2 0h 81 ：2 0h 93 ：2 0h 1 05 ：2 0h 1 l7 ：2 0h 一】28 ，1 、原理本实验采片j3 h 褪黑素作为标记抗原，葡聚糖碳未分离的放射免疫测定法。放射免疫分析的基础是被测物质与其放射性标记物对特异结合试剂的竞争抑制反应。我”j 州s 表示被测物，埘+ s 表示标记被测物，用r 表示特异结合试荆。在反应系统中，当没有被测物s 时反麻生成标记被测物一特异结合试剂复合物( + s - r ) ，反应物与产物可保持可逆的动态平衡。当反府系统中育标记物s 时，则反应生成被测物特异结合试剂复合物( s r ) ，反应物与生成物也保持可逆的动态平衡。当被测物s 与标记被测物+ s 两者并存时，j l ! i j 两种产物都生成，日形成一个动态半衡。s 与+ s 竞争和r 结合，两者任何一个的浓度减少，相应的产物就减少。如果将+ s r 与朱结合的游离态的+ s 分开，并且分别测定其放射性活度，以b ( b o u n d ) 代表+ s r 的苗，以f( f r e e ) 代表游离s 的昔，则结合比率b f 与s 的龄存在函数关系。证实际t 作中，先配制一系列已知浓度的标准被测物( s ) 然后分别向其中加入等鼙的标记被测物( + s ) 和等量的特异结台试剂( r ) ，使各自发生竞争抑制反应，然后将复合物s r与游离+ s 分离，分别测定其放射性活度b 和f ，再以被测物s 的浓度为横坐标，以对应的b为纵坐标作图，所得曲线称为标准竞争抑制反应曲线。在分析样品时，只要_ f j 同样的方法，测得待测样品的b 值，即可从标准曲线中查出被测物s 的相应浓度。8 2 、褪黑紊系列标准曲线溶液的配制a 、r 面表格2 - 1 为浓度配制标准。配制标准曲线溶液时，每一浓度作两个重复。表2 - 1 标准f f i 线浓度目d 制测址缓冲瀚a s s a yb u f f e t中国农业大学硕士学位论文第二章材料与方法8 3 、蜂样的准备a 、取蜜蜂头部放。- 玻璃研磨器内，加入7 5 0 ult r i n c i n eb u f f e r 后，研磨、匀浆，2m i n后转移到离心管t u b ea ( 1 6 1 2 5 m ) 中，并分别用2 0 0u l 、2 0 0 u 1 、1 0 0u 1t r ir i g i n eb u f f e r冲洗研磨器三次，合并洗液于t u b ea 内。每一个蜂样做五个重复；b 、向每一个t u b e a 内加入l m l 乙酸乙酯，于涡旋振荡器上振荡5 s ，然后置于冰水中1 0 m i n ，再放在涡旋振荡器上振荡5 s ：c 、离心：在4 c 下以3 9 8 0 转分( 2 0 0 0 9 ) 离心8m i n ，然后用巴氏管收集上清液( 尽量多，但注意不能把残液取上) ；再向除去上清夜的t u b ea 内加入l m l 乙酸乙酯，重复b 、c 两步，收集上清夜：d 、将所得上清液转移到t u b eb ( 1 2 7 5 m m ) ，用旋转蒸发仪除去溶剂，再加入1 2 5 0 9 la s s a yb u 脑r 后待用；8 4 、放射免疫测定a 、向预先编号的试管中分别加入下列试剂：l 2 管( 总计数t ) ：a s s a yb u f f e r11 0 0 i | t t ；3 4 管( 非特异性结合，n s b ) ：a s s a yb u f f e r6 0 0 i _ t l ；0 5 6 管( 特异性结合，b 。) ：a s s a yb u f f e r5 0 0 9 l ；7 - 2 2 管( 标准曲线，b ) ：标准曲线系列溶液各5 0 0 r d ；2 3 管( 样品t u b eb ) ：5 0 0 斗1 样品溶液。以上每管做一个重复。b 、向除外的试管中各加入1 0 0 p , l 稀释a n t i b o d y ；c 、所有试管在涡旋振荡器上振荡5 s 后，在室温下放置3 0 分钟：d 、向所有试管中加入1 0 0 9 l3 h m e l a t o n i n ，涡旋振荡后，在4 冰箱中放置1 8 个小时；e 、由冰箱中取出d c c 溶液，放于冰水中搅拌3 0 分钟；取出上述各管在冰水中放置3 分钟；f 、向上述各管( 除) 中迅速加入d c c 溶液各5 0 0 i _ t l ，在冰水中放置3 分钟。然后在高速离心机上以4 v ，3 9 8 0 转份( 2 0 0 0 9 ) ，3 6 号转头，离心1 0 分钟。迅速拿出，并将上清液倒入液闪杯中，加入闪烁液8 m l ，振荡3 0 分钟，后在l s c ( 液闪计数仪) 上计数。各管按下表2 - 2 所示的顺序和条件进行加溶液1 2中国农业大学硕士学位论文第二章材料与方法表2