（农业昆虫与害虫防治专业论文）三叶斑潜蝇实时荧光pcr检测及地理种源关系研究.pdf

摘要 本文对欧洲、亚溯、北美等不同地区的三叶斑潜蝇标本群体进行了分子鉴定，并对其 c o i 区域进行序列测定和分析。根据测定序列设计了三叶斑潜蝇l i r i o m y z at r 咖l i i ( b u r g e s s ) 的特异性探针，建立了应用实时荧光p c r 快速鉴定三叶斑潜蝇的方法。根据g e n b a n k 及自 测的发生于中国广东与台湾、日本、菲律宾、以色列、德国、美国、墨西哥和洪都拉斯等 地的三叶斑潜蝇及其近缘种m t d n ac o l 基因部分序列，对差异最大的区域设计了t a q m a n 荧光探针，确定了检测条件和参数，建立了实时荧光p c r 方法，通过测试的1 4 个不同种 群的昆虫，证明探针的特异性，能有效的区分和鉴定三叶斑潜蝇，建立了快速、高效的检 测鉴定三叶斑潜蝇的实时荧光p c r 方法。对三叶斑潜蝇不同虫态个体的检测均有效。 用通用引物c 1 j 1 5 3 5 和t l - n 3 0 1 7 扩增供试群体m t d n a c o i 区域，产生了序列长 度1 5 0 0 b p 的片段，测序其中5 5 0b p 的片段。对中国各地种群与g e n e b a n k 中的序列b l a s t ， 发现各地群体同源性极高，达到1 0 0 ，进一步证实了种类形态鉴定的准确性。使用p a u p 4 0 b 1 0 软件进行简约原则下对全世界三叶斑潜蝇根据m t d n a c o i 进行系统发育关系分析， 构建系统树，发现中国新发种群与世界各地种群无差异。 关键词：三叶斑潜蝇，m t d n a c o l 基因，分子鉴定，实时荧光p c r ，序列分析 a b s t r a c t l i r i o m y z at r i f o l i i ( b u r g e s s ) ( d i p t e r a ：a g r o m y z i d a e ) i sa l li m p o r t a n tp e s to fv e g e t a b l ea n d c u t f l o w e rc r o p sa r o u n dt h ew o r l d l i r i o m y z at r i f o l i ii nc h i n am a i n l a n dw a sf i r s tr e p o r t e df r o m z h o n g s h a no fg u a t g d o n gp r o v i n c ei n2 0 0 6 w er e p o r th e r et h a tt h i sp e s th a sr e c e n t l ye x p a n d e d i t sd i s t r i b u t i o ni nc h i n a ，a l o n gw i t hah o s tp l a n tr a n g ee x t e n s i o na n dp o p u l a t i o ne x p l o s i o n t h em o l e c u l a ri d e n t i f y i n gl i r i o m y z at r i f o l i i ( b u r g e s s ) b a s e do nr e a l t i m ep c rw a se s t a b l i s h e di n h i sp a p e r u s i n gp a r t i a ld n as e q u e n c e so fm i t o c h o n d r i a lc o io fl t r i f o l i io c c u r r e di n g u a n g d o n ga n dt a i w a np r o v i n c e si nc h i n a , j a p a n ，p h i l i p p i n e s ，i s r a e l ，g e r m a n y , u s 气m e x i c o a n dh o n d u r a s ，a n dr e l a t e ds p e c i e sf r o mg e n b a n k ，t h e 三t r i f o l i i s p e c i f i cp r o b ed i s t i n g u i s h i n g f r o ml s a t i v a eb l a n c h a r di sd e s i g n e d i to b t a i n e dt h es a n l er e s u l t si ni n d i v i d u a l so fd i f f e r e n t s t a g e s i ti sas e n t i t i v e ，f a s ta n dl e s sc o s t l ya s s a ys y s t e mc o m p a r e dt oo t h e rm o l e c u l a rm e t h o d ， s u c ha sr a n d o m a m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a p c r ，p c r - r e s t r i c t i o nf r a g m e n t - l e n g t h p o l y m o r p h i s m ，d n as e q u e n c i n ga n dm u l t i p l e xp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n t h ep a r t i a lc o l s e q u e n c eo f m t d n af r o m1 4l e a f m i n e r sp o p u l a t i o n sw e r ea n a l y z e d t h ep r o b e sa n dp r i m e r sf o r l 吮白l i iw e r ed e s i g n e db a s i so nt h ea l i g ns e q u e n c eo f t h ea m p l i f i e dc o im t d n a o f l i r i o m y z a s p p b yu s i n gt h ec l u s t s a l1 8 1o ft h es e q u e n c es o f t w a r e t h ep r o b ew a s l a b e l e dt w o f l u o r e s c e n td y e s ，t h a ti sar e p o r t e ro f6 - c a r b o x y - f l u o r e s c e i n0 ：a m ) a tt h e5 e n da n daq u e n c h e r o f6 - c a r b o x y - t e t r a m e t h h y l r h o d a m i n e ( t a m r a ) a tt h e3 e n d t h er e a l t i m ep c rm e t h o d d e v e l o p e di ni d e n t i t i f y i n gl t r i f o l i ii n t h i ss t u d yw a si n4 h r s ，i ti sas t a b l ea n dp r e c i s e i d e n t i 助n gm e t h o d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h em i t o c h o n d r i a lc y t o c h r o m eo x i d a s eig e n es e q u e n c e df r o m1 4 p o p u l a t i o n sc o l l e c t e df r o mz h u h a i ，n i n g b o ，t a i w a n ，z h o n g s h a ni nc h i n aa n dj a p a n ，i s r a e l ， g e r m a n ya n du s a w e r ei d e n t i c a l n og e n e t i cv a r i a t i o nw a so b s e r v e db e t w e e np o p u l a t i o ne i t h e r f r o md i f f e r e n tg e o g r a p h i c a ll o c a l i t i e so rf r o md i f f e r e n th o s tp l a n t s t h ep h y l o g e n e t i ca n a l y s i s i n d i c a t e dt h a tc h i n ap o p u l a t i o nw a sg r o u p e di n t ot h et r i f o l i i wc l a d e ，b e l o n g i n gt oan o n p e p p e r l i n e a g e ，w h i c ha l s oi n c l u d e so t h e rr e c e n t l yi n t r o d u c e da s i a np o p u l a t i o n s k e yw o r d s ：l i r i o m y z at r i f o l i i ，m t d n ac o lg e n e ，m o l e c u l a ri d e n t i f i c a t i o n ，r e a l t i m ep c r ， s e q u e n c ea n a l y s i s i i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽 我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过 的研究成果，也不包含为获得湖南农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了 谢意。 研究生签名 增鬈 时高： z 唧参月多 关于论文使用授权的说明 本人完全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交 论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保 存、汇编学位论文。同意湖南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文 的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生虢磁窆 导师签名 帆z 咖年6 月苫日 时间：2 0 0 7 锡月胛 1 前言 1 1 三叶斑潜蝇概述 1 1 1 名称 学名：l i r i o m y z at r i f o l i i ( b u r g e s s ) 英文名称：a m e r i c a ns e r p e n t i n el e a f m i n e r , c h r y s a n t h e m u ml e a f m i n e r 1 1 2 分类地位 三叶斑潜蝇l i r i o m y z at r 咖胁口u r g e s s ) 属于昆虫纲，双翅目，潜蝇科a g r o m y z i d a e 。 1 1 ，3 国内外分布 国家质检总局和原国家动植物捡疫局将该虫列入潜在的检疫性有害生物名录。三叶斑 潜蝇于上个世纪6 0 年代首先在北美发现( m i n k e n b e r g & o p j ，m ，1 9 8 8 ) ，随后2 0 年扩散 到世界各地，已知发生地区如下：美洲、欧洲、非洲和亚洲的塞浦路斯、以色列、黎巴嫩、 土耳其、也门、菲律宾( 1 9 8 4 ) 、我国台湾( 1 9 8 8 ) 、日本( 1 9 9 0 ) 、印度( 1 9 9 3 ) 和韩国 ( 1 9 9 4 ) 等( m i n k e n b e r g & o e j m ，1 9 8 8 ) 。我国由检疫系统于2 0 0 5 年1 2 月在广东省中 山市出口基地的小白菜上采集到( 陈乃中，内部报告，2 0 0 6 ，公开) ，中国检验检疫科学 院陈乃中研究员鉴定为三叶斑潜蝇，并得到中国农业科学院植物保护研究所问锦曾研究员 和中国科学院动物研究所汪兴鉴研究员的一致确认。 目前三叶斑潜蝇的发生地区如下：我国台湾、韩国、日本、菲雄宾、印度、塞浦路斯、 以色列、黎巴嫩、土耳其、也门、奥地利、比利时、保加利亚、克罗地亚、捷克、丹麦、 芬兰、法国、德国、匈牙利、冰岛、意大利、马耳他、荷兰、挪威、波兰、葡萄牙、罗马 尼亚、俄罗斯、斯洛伐克、斯洛文尼亚、西班牙、瑞典、瑞士、英国、南斯拉夫、贝宁、 象牙海岸、埃及、埃塞俄比亚、几内亚、肯尼亚、马达加斯加、毛里求斯、马约特岛、尼 日利亚、留尼汪、塞内加尔、南非、苏丹、坦桑尼亚、突尼斯、赞比亚、滓巴布韦、加拿 大、美国、巴哈马、巴巴多斯、百慕大、哥斯达黎加、古巴、多米尼加共和国、瓜德罗普、 危地马拉、马提尼克岛、特立尼达和多巴哥、巴西、哥伦比亚、法属圭亚那、圭亚那、秘 鲁、委内瑞拉、美属萨摩砭、密克罗尼西亚、关岛、北马里亚纳群岛、萨摩亚、汤加( 其 中有的国家或地区声称已根除) 。 1 1 4 三叶斑潜蝇的生物学特性 成虫在植株叶片上取食、产卵。卵产在叶表下，历期2 5 天。幼虫孵出后，即潜食叶 片，分三龄，在2 0 0 c 3 0 0 c 下，历期4 7 天，在土壤表层或叶面上化蛹。上述温度下，蛹 历期7 - 1 4 天。每年可发生多代，条件许可则周年繁殖。 成虫取食花蜜，雌虫通过刻点产卵，少则2 5 粒，多则6 3 9 粒；喜短日照作物，并选 择植株高的产卵和为害；成虫有飞翔能力，至少飞行1 0 0 m ，在自然界和温室内，可从寄 主植物上迁移到杂草上交替繁殖；幼虫在土中化蛹，并在其中越冬；成虫对黄色较敏感 ( c a b i e p p o ，1 9 9 7 ；e p p o ，2 0 0 5 ) 。 该虫主要以卵和幼虫随植株( 或部分) 叶片远距离传播。蛹和成虫也有可能被包装材 料和交通工具传带。菊花、扶朗化、番茄苗以及一些带叶的蔬菜是该虫的重要传播、扩散 载体( c a b i e p p o ，1 9 9 7 ；e p p o ，2 0 0 5 ) 。据称，该虫就是随扶朗花进入台湾的。该虫扩散速 度极快。随切花和蔬菜的调运即可在很短的时间内扩散开来。 此虫有比美洲斑潜蝇更高的产生抗药性的能力。在美国的加州，氯菊酯登记2 年后， 该虫对它的抗性增强了2 0 倍；在加拿大，对定菌磷敏感性1 年即下降了1 5 倍，而温室种 群对它的抗性达到了1 5 5 倍；在日本，开始时期佳硫磷很有效，后来效果也明显降低：美 国佛罗里达州治理三叶斑潜蝇的农药有效期平均不超过3 年，旱芹受害一度不能生产就是 因为无药可治。已发现该虫对有机磷农药多个品种，如一o 五九、毒死蜱和三唑磷等有交 互抗性。据日本和美国等地的试验，脱离农药一定时期，并不能使该虫恢复对药剂的敏感 性。抗药性的产生意味着防治办法的选择受到限制，防治更加困难( s a i t o ，1 9 9 3 ) 。 1 1 5 三叶斑潜蝇的寄主范围和危害性 三叶斑潜蝇的寄主范围比美洲斑潜蝇更广，寄生2 5 个科，主要为害菊科。是北美菊 花上的主要害虫，也为害蔬菜，1 9 8 0 年美国旱芹因此虫损失9 0 0 万美元，使印度西红柿 减产2 5 ，能为害柿花及多种观赏苗木花卉，有可能成为棉花生产大害虫，现在是欧洲 许多国家温室的重要害虫。该虫能传播病毒和细菌( 如菊巨属假单胞菌p s e u d o m o n a s c i c h o r i i ) 。可为害重要花卉、果、蔬、棉和牧草等2 0 余科植物。重要的寄主作物包括菊花、 扶朗花、大丽花、百日菊、石竹花、丝石竹花、黄瓜、南瓜、甜瓜、西瓜、旱芹、番茄、 辣椒、马铃薯、豌豆、菜豆、豇豆、甜菜、菠菜、蒜、韭、洋葱、青菜、白菜、莴苣、苜 蓿和棉等。其中菊科、茄科、葫芦科和旱芹是三叶斑潜蝇的嗜食寄主。据印度4 省的调查， 有3 0 余种作物被害，2 0 余种杂草取食。意大利有为害大麦叶片的报道( s p e n c e r ，1 9 8 2 ) 。 本种主要以幼虫潜食寄主叶肉，与美洲斑潜蝇的危害程度相近。为害叶片，时片上刺 孔形成刻点破坏细胞，降低光合作用。严重时导致落果落叶。幼虫在叶片和叶柄内取食， 被害部表面形成油渍状斑点，最后形成桔死斑。致死幼苗；使果实出现伤疤( s m i t he ta l ，1 9 6 2 ； m u s g r a v ee ta 1 。1 9 7 5 ) 。据报道，美国每年造成的损失高达十亿美元，仅加利福尼亚州菊花 每年损失达9 3 0 0 万美元，佛罗里达州旱芹一度不能生产；土耳其温室中石竹被害株率5 8 3 ， 室外菊花被害株率达3 0 ，巴勒克埃西省豌豆被害株率l 0 0 9 6 ；印度番茄减产2 5 ，棉花受害 造成枯萎，蓖麻叶上虫道覆盖面积达6 0 ；韩国樱桃番茄被害叶片率高达6 0 以上；该虫在 南非已上升为第2 大蔬菜害虫。该虫还是多种植物病毒的媒介昆虫，能传播病毒和细菌( 如 菊巨属假单胞菌p s e u d o m o n a sc i c h o r i i ) ( z i t t e r e t a l ，1 9 8 0 ) 。该虫是北美菊花上的主要害虫。 也为害蔬菜，1 9 8 0 年北美旱芹因此虫损失9 0 0 万美元( s p e n c e r , 1 9 8 2 ) 。此虫有比美洲斑潜蝇 更高的产生抗药性的能力( t r u m b l e ，1 9 8 1 ；p a r r e l l ae ta 1 ，1 9 8 4 ) 。如果不及早采取有效措施进 行防控，一旦蔓延扩散开来，该虫对蔬菜、花卉生产威胁极大。由于该虫具有高的产生抗 药性的能力( t r u m b l e ，1 9 8 1 ；p a r r e u ae ta 1 ，1 9 8 4 ) ，很可能给治理工作带来巨大困难和无穷的 后患。 1 1 6 三叶斑潜蝇的形态识别要点 成虫小型，体长约1 3 t u r n 左右，主要为黑色和黄色。额黄色，内、外顶鬃均着生于 黄色区域，触角第3 节黄色。中胸背板黑色，带灰白色绒毛被。翅长约1 3 1 7 m m ，m 3 + 4 脉末段长是次末段长的约3 _ 4 倍。雄外生殖器阳茎与美洲斑潜蝇近似，但端阳体中间偏端 部位的缢缩更明显，柄部较长，与其后部分长度相当。 卵米色，半透明，大小为0 2 0 3 m m o 1 0 。0 1 5 m m 。 幼虫老熟时长3 m m 。第1 龄幼虫刚孵化时无色，渐变为浅橙黄色。2 龄以后幼虫橙黄 色。幼虫( 和围蛹) 有l 对形似三突锥的后气门，每侧后气门有3 个孔与外界相通，每孔 位于所在锥突的顶端。 围蛹椭圆形，腹面略扁平，1 3 2 ，3 m m x 0 5 - 0 7 5 r a m ，颜色有变化，浅橙黄色，常黑 化为金褐色。 成虫取食刻点为直径在o 1 3 0 1 5 r a m 之间的白色斑点，产卵刻点小( o 0 5 r a m ) ，且圆。 幼虫潜道白色，带湿黑和干褐区域，典型的蛇状，绕曲，形状不规则，随幼虫成熟变宽。 与近缘种的区别： 该虫与美洲斑潜蝇l i r i o m y z as a t i v a e b l a n c h a r d 非常近似，不同之处主要在于后者内项 鬃着生于黑黄交晃区域；中胸背板亮黑色，没有灰白色绒毛被；阳茎端阳体中间偏端部位 的缢缩不如本种明显，柄部短，长度不超过其后部分长度的一半( 陈乃中，1 9 9 9 ) 。 1 2 昆虫分子系统学研究概况 总体来说，应用分子标记比较成功地解决了昆虫低级阶元的系统发育关系。目前，多 数研究集中在探讨亚种、种和属级的亲缘关系，这主要是由于现在普遍使用的分子标记最 初是为解决种级问题设计的缘故。在探讨高级阶元的系统发育关系时，通常由于选样的不 足，只能是一个大致的了解。 w h i t i n g ( 1 9 9 7 ) 等很成功地探讨了昆虫纲各目之间的亲缘关系。研究类群包括完全 变态各目的昆虫共8 5 个分类单元( 其中2 0 个为非完全变态昆虫) ，基于1 8 sr d n a 、2 8 s r d n a 和形态数据，探讨了迄今为止最全面的昆虫系统发育关系。除s t r e p s i p t e r a 外，他们 的结论与基于形态数据的假设一致。 尽管对系统发育关系的理解取得了最要的进展，但分子系统学对昆虫分类学的影响还 是很小的。分子技术对鉴定特殊的基因型是非常适合的。但昆虫分类学还是更多地依靠经 典的分类方法和体系。不过有些种的描述已部分地基于分子数据了。 1 3 用于昆虫分子系统学研究的分子标记 用于昆虫系统发育地理学最频繁的基因是m t d n a 、转录间隔区( i t s ) 和微卫星 ( m i c r o s a t e l l i t e s ) 。 1 3 1n r t d n a 线粒体d n a 是目前用得最多的分子标记。a r i s e ( 1 9 8 7 ) 和s i m o n ( 1 9 9 4 ) 等详细地讨 论了线粒体d n a 的特点。线粒体分子标记广泛应用的原因主要是由于它比较容易分离和 扩增。s u n n u c k s 等和z h a n g 等详细地论述了线粒体基因的核拷贝( p a r a l o g o u s n u c l e a rc o p y ) 和假基因( p s e u d o g e n e ) 等问题；这些问题会严重地影响系统发育分析结果的可靠性。而 在探讨昆虫的系统发育关系时，几乎忽视了假基因的存在。当我们用线粒体基因进行系统 发育分析时，z h a n g ( 1 9 9 5 ) & h e w i t t 的建议值得考虑。 m t d n a 为双链闭环分子，昆虫线粒体d n a 大小为1 5 4 - - 1 6 3 k b 左右，其中含有编码 2 个r r n a ( 1 2 s r r n a ，1 6 s r r n a ) ，2 2 个t r n a ，1 个细胞色素b ( c y t b ) ，3 个细胞色素氧化酶 ( c o i 、c o i i 、c o i i ) ，6 个n a d h 降价酶( n d l - - - 6 ) 和2 个a t p 酶的基因。其中用 得最多的是c oi 、c o i i 和1 6 s r r n a ；也有的用1 2 s r r n a 。可以根据研究需要，选择特 4 定的区域。c o i i i 、n d 5 和细胞色素b 基因( c y t b ) 也在一些研究中涉及。n d 2 、n d 4 和n d l 很少受到注意，剩下的m t d n a 基因涉及更少( m i c h a e le ta l ，2 0 0 0 ) 。 m t d n a 因为进化快，且不发生重组，已广泛用于多种昆虫的种群研究( a v i s e ，l9 8 9 ； a v i s e ，1 9 9 1 ：s i m o ne ta l ，1 9 9 4 ) 。m t d n a 很多区域是保守的，因此通用引物能够用在 不同昆虫中。线粒体d n a 的变异能够通过测序或r p l p 检测出来。对于核d n a 来说， m t d n a 的序列含有更多的信息，在推测单倍型或种群历史上应该更加有用。m t d n a 将继 续承担昆虫系统发育地理学研究基本工具的角色。 同时，m t d n a 有以下几个影响分析和解释数据的重要特征： 第一，因缺少重组，它的基因仅代表单一基因位点，因此，虽然不同的m t d n a 基因 可能揭示不同层次的变异，但它们不能作为独立的位点来解释变异； 、 第二，由于m t d n a 单倍体和母性遗传的特性，可用于分析的有效基因数量比核d n a 少( a v i s e ，1 9 9 i ) ； 第三，m t d n a 的母性遗传使得它在用来分析基因漂流时，父性遗传将被忽略。因为雌 雄昆虫在迁移和开拓领地能力上的差异( d e n n oe ta l ，1 9 9 l ；r o d e r i c ke ta l ，19 9 2 ) ， m t d n a 会错误解释种群迁移的历史( r o d e r i c ke ta l ，19 9 5 ) 。 1 3 2 转录间隔区( i t s ) r r n a 内转录间隔区( i n t e r n a lt r a n s c r b e ds p a c e r , i t s ) 序列包括i t s l 和i t s 2 。i t s l 位于1 8 s 和5 8 s r r n a 之间，i t s 2 位于5 8 s 和2 8 s r r n a 之间。i t s 可被看作单拷贝基因。 核r r n a 顺反子产生的前体r n a 在形成r r n a 时，i t s l 和i t s 2 就会被剪切掉，不 参加核糖体的形成，因此受到的选择压力小，进化速度快，可用来研究种群分化。i t s 也 可以通过通用引物扩增。 i t s 在用于研究系统发育地理学的最主要局限是在单一个体中存在很多变异，因此很 难或不可能寻找到同源d n a 。用i t s 研究种群时，必须对每个种进行复核。 1 3 3 微卫星 微卫星是分布在生物核基因组的短重复序列( 2 6 b p ) 。由于微卫星的重复片段容易增 加或减少，因此这些区域序列长度快速进化。微卫星可以用引物进行p c r 扩增，片段大 小变化可通过电泳看到。微卫星为遗传变异提供了大量有价值的信息，特别是在别的标记 提供有限变异的情况下，该标记特别有用( r o d e r i c ke ta l ，1 9 9 5 ) 。已经广泛应用于种或 种以下水平的研究。它们高的突变率确保了高度多态性，因此特别适用于昆虫个体间和种 群内品种间的关系研究。不足在于为了定位重复序列，必须先建立或购买基因库。如果对 一种生物可用的引物能够扩增相关种的不同的微卫星位点，建立或购买基因库可以省掉 限o d e r i c ke ta l ，1 9 9 5 ) 。但该方法已经发展到没有全基因文库的情况下能检测微卫星位 点。在社会昆虫协同进化过程中的行为研究和亲缘选择假说中有大量应用。同时，为精子 竞争、亲缘关系和种群结构提供了有用的预见( m i c h a e le ta l ，2 0 0 0 ) 。 系统学家和种群遗传学家已将注意力集中在基因组大量的非编码区域内。这些非编码 区主要由重复单位组成：卫星d n a ( s a t e l l i t ed n a ) ，在染色体结构和功能方面起着重 要作用。约占整个基因组的4 5 左右；主要位于染色体的中心区，较为保守。小卫星 ( m i n i s a t e l l i t ed n a ) ，它的数量与繁殖活动有关。微卫星( m i c r o s a t e l l i t ed n a ) ，因 重复单位较短而命名( 两个碱基的重复单位最常见) ；已广泛地用于种和以下阶元的遗传 变异分析。微卫星d n a 的高变异率导致了高的多态性，在研究种群个体之间和繁殖群体 之间的关系非常适合。对某一类群微卫星位点的开发是非常费时费力的；但有时会比想象 的容易些。在没有基因组文库的情况下，筛选微卫星位点的技术已得到了很大的发展。某 些昆虫( 如蝴蝶) 微卫星位点的开发明显地要比其它昆虫难些。微卫星技术最成功的应用 是在k i n 选择和社会性昆虫个体行为互作上。对理解精子竞争和父子关系、社会性起源和 种群结构等现象提供了有力的理论依据和技术支持。 1 4 生物化学技术 测序通常是最适用于研究的方法，然而，种内种群结构可以用更加快捷的方法解决， 如同工酶电泳，限制片断长度多态性( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m s ，r f l p ) ， 分子杂交( m o l e c u l a rh y b r i d i z a t i o n ) 或一些基于d n a 配对的技术，如单链构造多态性 ( s i n g l e s t r a n dc o n f o r m a t i o n a lp o l y m o r p h i s m s ，s s c p ) 、双链构造多态性( d o u b l e s t r a n d c o n f o r m a t i o n a lp o l y m o r p h i s m s ，d s c p ) 、扩增片断长度多态性( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t h p o l y m o w h i s m ，a f l p ) 或者随机扩增多态d n a ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y r n o r p h i cd n a , r a p d ) 。解决某个问题的最好途径通常是测序加上以上1 种或几种方法的组合( h i l l i se t a 1 1 9 9 5 ) 。 1 4 1o n a 测序 d n a 测序很显然已经用于比较分子信息的重要方法。主要有丽个优点：( 1 ) 序列数 据在不同研究的可比较性一连续性；( 2 ) 从碱基序列多样性足以推断出系统进化过程 ( a v i s e ，l9 9 4 ) 。 d n a 序列分析是通过直接比较不同种群个体同源核酸的核苷酸排列顺序，构建分子 系统树，并推断种群闻的系统演化关系( 成新跃等，2 0 0 0 ) 。自从d n a 自动测序技术成 熟以来，该方法一直用于昆虫系统发育地理学的研究。 s j s c h e f f e r 等( 2 0 0 5 ) 对来自于全球1 3 个国家的8 个不同寄主的2 4 个美洲斑潜蝇 l i r i o m y z as a t i v a e 种群共1 1 0 个体的c oi 进行测序研究，发现有3 个种群的分支：种群a 、种 群w 和种群l 。种群a 和种群w 寄主是豆、西红柿和葫芦科植物，种群l 对羽扇豆属植物嗜好。 c oi 基因的变化表明种群a 仅分布在佛罗里达、危地马拉和洪都拉斯；种群l 仅分布在科 罗拉多野生羽扇豆属植物上；种群w 广布世界各地，是入侵世界各地的种群。 a b r e i n a l d o 等( 2 0 0 2 ) 对来自南美3 1 地区和黎巴嫩及澳大利亚4 个地区共6 0 头果蝇 d r o s o p h i l ab u z z a t i i 的c o l5 端6 4 6 b p 进行测序分析，巴西东北部种群高的核苷多样性和嵌套 进化分析表明果蝇在巴西的分布比以前的被动分布假设所认为的要旱。从第四纪的地质时 期就在巴西和阿根廷有分布。 1 4 2r a p d r a p d 是由j g k w i l l i a m 等( 1 9 9 1 ) 发展起来的基于p c r 的一项分子标记技术。其原 理是用一系列随机合成的单个引物( 通常8 1 0 b p ) ，以基因组d n a 为模板进行扩增，扩增 产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳分离，e b 染色，在紫外灯下观察扩增产物的多态性。分 析r a p d 结果的取决于种群内等位基因的频率。根据种群间等位基因的相似频率建立系统 树( g e o r g e ，19 9 6 ) 。 此方法的优点是：快速、简便、价廉，整个实验能在2 4 h 内完成。此方法的缺点是： 可重复性低，p c r 条件稍有改变或样品保存的差异都会改变结果，要求样品的搜集保存、 d n a 提取、扩增过程都严格一致；不能区分杂合子和纯合子，需要通过测序、s s c p 或杂 交等方法来加以辅助( m i c h a e le ta l ，2 0 0 0 ) 。 c l w i l l i a m s 等( 1 9 9 4 ) 对新西兰的阿根廷萝h 象l i s t r o n o t u sb o n a r i e n s i s 的地理起源进 行r a p d 研究，搜集南美的9 个种群、新西兰5 个种群和澳大利亚1 个种群。分析显示，新西 兰的阿根廷萝p 象种群来源于南美东部沿海。 m a s c a t a g l i n i 等( 2 0 0 0 ) 运用r a p d 对南美墨西哥棉铃象的地理来源和分布进行研究。 分析了来自阿根廷、巴西、巴拉圭、墨西哥和美国的9 个种群。使用的4 个引物揭示4 1 个“匿 名”位点。基于n e i 的距离和每代的迁移值建的n e i g h b o r - j o i n i n g 树显示：墨西哥与阿根廷 标本的遗传相似性高于别的南美种群。这个结果支持了在棉花大量种植前，墨西哥棉铃象 已经在南美自然分布的假说。种群的暴发与棉田面积的增加有关。 k s k i m 等( 2 0 0 4 ) 也运用r a p d 对美国8 个州和墨西哥东北部共1 8 个地点的墨西哥棉 铃象种群的数量和遗传变异进行研究。所有种群的遗传距离与地理距离是正相关的，反映 了大种群地理隔离的方式。中南、西部和东部地区的基因漂流是有限的，但是在同一地区 不同地点的迁移是相当频繁的，达至0 3 0 0 4 0 0 k i n 的距离。 ， 1 4 3r f l p 分析 当d n a 序列的差异发生在限制性内切核酸酶的识别位点时，或当d n a 片段的插入、缺失或 重复导致基因组d n a 经限制性内切核酸酶酶解后，其片段长度的改变可以经凝胶电泳区分 时，d n a 多态性就可应用限制性内切核酸酶进行分析，这种多态性称为限制性片段长度多 态性( r f l p ) 。 当一个基因组较小时，进行琼脂糖凝胶电泳就可观察多态性。对于大分子d n a ，要借 助分子杂交技术，用某一段标记的d n a 片断作探针，与电泳后的d n a 片断进行杂交，与 探针片断有高度同源性的d n a 片断就可以被检测出来( w i l l i a m se ta l ，1 9 9 5 o 目前，大多研究采取r f l p 与p c r 相结合的方法，即a f l p 或p c r - r f l p 。先用特定引 物将某一片断进行p c r 扩增、纯化和克隆，然后再进行r f l p 分析。 该方法有以下优点： ( 1 ) 能够揭示种内的广泛差异( h ee ta 1 1 9 9 8 ；e r n e ye t a l ，1 9 9 6 ) ；( 2 ) 具有高度的重复性；( 3 ) 快捷、经济地筛选大量个体；( 4 ) 引物和p c r 条件可适用于不同的种。但该方法与r a p d 和同工酶电泳一样，不能区分杂合子和纯合子 ( g e o r g e ，l9 9 6 ) 。 m h e 和d s h a y n e r ( 1 9 9 9 ) 用p c r - r f l p 对来自7 个国家2 6 个不同种群的地中海实蝇一 c e r a t i t i sc a p i t a t a 葡萄稽一6 一磷酸脱氢酶基因( z w ) 进行研究，r s al 和t a qi 消化p c r 产物。 表明入侵美国加州的种群不是单一的同源种群；危地马拉最有可能是加州某些种群的来 源。 k s ，k i m 等( 2 0 0 4 ) 对来自美国8 个州和墨西哥东北部共2 0 个地点的4 1 9 个墨西哥棉铃 象a n t h o n o m u s g r a n d i s b o h e m a n m t d n a l 2 4 k b 进 t p c r - r f l p 分析。共2 8 个不同的m t d n a 单倍 型中，1 7 种单一地分布在1 个地区。南部种群比北部种群基因多样性高；北部种群中，东 边的比西边的基因多样性高，东部和西部种群遗传变异复杂，系统学分析表明主要有2 个 种群，这些研究结果与墨西哥棉铃象从墨西哥传入美国东南部并在高原地区定殖吻合。还 显示东、西部种群基因漂流有限，但在东部地区的种群间相当高。 1 4 4 同工酶电泳 同工酶电泳在过去4 0 年一直沿用于分析昆虫的地理分布。该方法价廉、快速。然而， 同功酶电泳有以下值得注意的缺点： ( 1 ) 在使用前，昆虫必须是活体或超低温冷冻( t a y l o re ta l ，1 9 9 4 ) ；( 2 ) 有些昆虫( 特 别是很多寄生蜂) 带型显示出很少的变异性( e d a r d s ，1 9 9 3 ) ；( 3 ) 有相同迁移率的条带 被误认为是同源的；( 4 ) 出现的条带并不符合孟德尔遗传规律；( 5 ) 同工酶变异仅仅揭 示遗传变异的一部分( l e w o n t i n 。l9 9 1 ) ；( 6 ) 上一代和下一代不同等位基因的带型不 可能定义。基于后两个原因，同工酶电泳分析不能揭示等位基因闻的历史关系 ( l e w o n t i n ，1 9 9 1 ) 。 1 4 5s s c p 和d s c p s s c p 和d s c p 是近年新发展的d n a 检测技术，其基本原理是：由于突变，引起d n a 分子双 螺旋构象的改变，通过s s c p 和d s c p 分析，可检测d n a 特定片段的分子变异情况。该法较r a p d 稳定，由于使用保守引物进, 行p c r 扩增，所以扩增条带是稳定的，可重复性高，而且，较 r f l p 能得到更多的标记，因而此方法是得到分子标记的一条快捷的途径，对变异的条带克 隆测序，比全序列测定节约经费( 成新跃等，2 0 0 0 ) 。 但l - a t l d n s o n ( 1 9 9 7 ) 认为，由于很多d n a 序列可产生相同的电泳带型，所以，潜在序列 的差异不能估计，s s c p 和d s c p 不能用于系统发育分析。 m f a c c o l i 等( 2 0 0 5 ) 用s s c p 和测序方法分别分析了纵坑切梢小蠢t o m i c u s p i n i p e r d a 和 1 1d e s t r u e n s 8 个种群的c o i3 6 8 b p 长的片段。发现属于后者的意大利南部种群和中部种群与 北部种群有很大区别：纵坑切梢小蠢欧洲和亚洲种群相似，由于纵坑切梢小蠢的主要寄主 p n u s s y l v e r s t r i s 的分布地区继续扩散和松木材国际贸易的发展，纵坑切梢小蠹的遗传变异 是不规则的。 1 5 利用d n a 序列构建系统树的方法 1 5 1 系统发育关系分析方法 s w o f f o r d 等很详尽地总结了重建脊椎动物系统发育关系的方法，关于昆虫的系统发育 关系却提得很少。用d n a 序列数据进行系统发育关系分析包括最基本的5 步。 1 、序列首先必需进行比对( a l i g n m e n t ) ；以便能够对同源位点( 比较单位) 进行分 析。如果序列间的差异很小或者变化都是由替代( s u b s t i t u t i o n ) 产生的，那么序列的比对 会非常容易。当序列间的变异很大或者插入( 或缺失) 碱基很多时，序列的比对就很难。 比对是系统发育分析时最麻烦和最难理解的。c l u s t a l x 是应用最多的进行比对的软件。蛋 白质基因，只要氨基酸序列比较保守( 尽管存在内含子等问题) ，序列的比对就很容易。 相比之下，核糖体基因的比对就难得多，尤其是那些含有大量插入( 或缺失) 碱基的区域。 2 、序列比对后，需评价所含系统发育信息。如果所有序列完全相同，就没有分析的 必要了；相反，如果序列变异太大，势必会出现系统发育关系随机性的结果。通常情况是 介于这两者之间：一些位点高度保守( 在各分类单元中保持不变) ，其它位点的变化比较 自由( 如密码子的第三个位点) 。我们可以对进化速率不同的d n a 片断进行分区比对( 如 内含子对外显子) ；并根据具体的阎题对相应的区域进行分析。因此，全面地评价序列数 据的系统发育信息是十分必要的。评价方法有序列的两两比较法( p a i r w i s ec o m p a r i s o n s ) 和树长分布图法( 即g l ；t h es h a p e o f t h e t r e e l e n g t hd i s t r i b u t i o n ) 。 3 、序列中如果存在系统发育信息，接下来就是选择分析系统发育关系的原则( 或标 准) 。合理的选择取决于对以下问题的考虑：是否有相对更为广泛的进化模型可供选择? 目的序列进化参数的选择? 研究类群的进化速率如何? 研究的目标是否要重建准 确的分支长度、各分支的亲缘关系及各位点的进化方式等。研究的目标是否包括对数据 集的综合分析或比较等。各分析方法对数据集大小和计算机运算能力的要求等。可供选 择的方法有基于性状( c h a r a c t e r - b a s e d ) 的方法( 如p a r s i m o n y ，m a x i m u ml i k e l i h o o d 和m e t h o d o f i n v a r i a n t s ) 和基于距离( d i s t a n c e b a s e d ) 的方法( u p g m a 和n e i g h b o r j o i n i n gm e t h o d ) 。 4 、在选择了合适的原则以后，接下来就是选择搜索最佳树( 或树集) 的方法。共有 三种搜索方法可供选择：h e u r i s t i cs e a r c h i n g ，b r a n c ha n db o u n ds e a r c