（农业昆虫与害虫防治专业论文）嗜线虫致病杆菌杀虫毒素的初步分离纯化及杀虫机理的研究.pdf

摘要 昆虫病原线虫共生菌是一种寄存于昆虫病原线虫( e n t o m o p a t h o g e n i cn e m a t o d e s ， e p n s ) 肠道内的共生细菌，革兰氏染色阴性，属肠道杆菌科( e n t e r o b a c t e r i a c e a e ) 。 线虫携带共生菌进入寄主昆虫体内，并将共生菌释放到寄主的血腔中：共生菌在昆虫 血腔内繁殖，产生杀虫毒素，导致昆虫患败血症并在4 8h 内死亡；共生菌能分解寄 主的营养物质，提供线虫所需的营养；同时共生菌产生的抗菌素，能抑制其它杂菌的 侵染，为线虫的生长、发育和繁殖提供理：铱的环境。 嗜线虫致病杆菌( x e n o r h a b d u sn e m a t o p h i l a ) h b 3 1 0 菌株是从河北省土壤中筛 选出的一株对多种昆虫具有高毒力的昆虫病原线虫共生菌。利用8 5 饱和硫酸铵盐 析法获得该菌胞内蛋白提取物，生物测定结果表明其具有胃毒活性和血腔杀虫活性。 通过制备型非变性凝胶电泳对胞内蛋白提】玟物进行分离和纯化，得到了4 种有杀虫活 性的蛋白毒素( 毒素i 、毒素i i 、毒素i i i 毒素v i i ) 。毒紊i 和毒索i i 对棉铃虫初孵 幼虫、3 龄小菜蛾、4 龄菜青虫有明显的胃毒活性，但没有血腔毒性：毒素i i i 和毒素 对5 龄大蜡螟、5 龄棉铃虫幼虫有很强的血腔注射毒性，但没有胃毒活性。 经毒素i l 饲喂处理的4 龄棉铃虫幼虫，食量减少，发育迟缓，但可正常化蛹。从 棉铃虫中肠切片和围食膜解剖可以观察到：6h 后围食膜前端破碎，中肠柱状细胞仲 长：处理1 2h 后中肠围食膜消失，柱状细胞严重变形，顶端出现大量囊泡：随着时 间推移，中肠柱状细胞排列疏松混乱，囊泡脱落进入肠腔；随着毒素作用的逐渐减弱 以及棉铃虫中肠细胞自身的修复再生，处理7 2h 后棉铃虫中肠围食膜又重新出现。 以同样剂量的毒素i i 饲喂处理的3 龄小菜蛾和4 龄菜青虫幼虫制作中肠切片观察，也 发现了类似的破坏作用，但由于不同昆虫对毒素的敏感性不同，毒素i i 对小菜蛾、菜 青虫中肠组织的破坏作用较严重，最终只剩下底膜。 血腔注射实验表明，不同的毒素导致昆虫死亡的症状不一样：血腔注射毒素i i i 后， 大蜡螟5 龄幼虫虫体很快变成灰黑色，随后开始失水、变软，1 2h 后开始死亡，解剖 后血腔组织明显变黑，血淋巴变成灰褐色，皿细胞被破坏：血腔注射毒素后，大蜡 螟5 龄幼虫呼吸急促，快速死亡，虫体不变色，解剖后组织的颜色与正常大蜡螟颜色 一样，血淋巴的颜色没有变化，血细胞没有被破坏。可能这两种血腔毒素作用机理不 同。 关键词：嗜线虫致病杆菌：杀虫毒索；杀虫机理 p u r i f i c a t i o na n di n s e c t i c i d a lm e c h a n i s m o fi n s e c t i c i d a lp r o t e i n s f r o mx e n o r h a b d u sn e m a t o p h i l ah b 3 1 0 c a n d i d a t e ：n a n g o n gz i y a n a d v i s o r s ：p r o f e s s o rw a n g q i n y i n g s p e c i a l t y ：a g r i c u l t u r a l i n s e c ta n dp e s tc o n t r o l a b s t r a c t x e n o r h a b d u si sh a r b o r e da ss y m b i o n t si nt h ei n t e s t i n eo ft h ei n f e c t i v ej u v e n i l es t a g e o fn e m a t o d e sb e l o n g i n gt o t h e f a m i l y s t e i n e r n e m a t i d a e n en e m a t o d e sc a r r i e dt h e b a c t e r i ai n t ot h eh e m o l y m p ho ft h eh o s ti n s e c t sa n dr e l e a s e d t h e m t _ 1 1 e nt h eb a c t e r i a r a p i d l yk i l l e dt h ep e s tl a l v a b e s i d eo ft h i sn a t u r a lc o n d i t i o n ，i nm o s tc a s e st h eb a c t e r i a a l o n ei sa l s oh i g h l yv i r u l e n tt os o m ck i n d so fp e s t s i nt h i ss t u d y , t w oo r a li n s e c t i c i d a lp r o t e i n s ( t o x i nia n dt o x i n1 i ) a n dt w oi n j e c t a b l e i n s e c t i c i d a lp r o t e i n s ( t o x i ni i ia n dt o x i n 1w e r ep u r i f i e df r o mt h ei n t r a c e l l u l a rp r o t e i n o fx n e m a t o p h i l a h b 3 1 0b yn a t i v e p a g e b i o a s s a yr e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h eo r a l i n s e c t i c i d a la c t i v i t yo ft o x i n1 1w a sh i g l l e rt h a nt h a to ft o x i nit oh e l i c o v e r p aa r m i g e r a n e o n a t e s t h e h i s t o p a t h o l o g yo f t o x i n1 it oh a r m i g e r al a r v a ew a s s t u d i e db yd i s s e c t i n ga n d o l e f i ns l i c eo fm i d g u t n es y m p t o m ss h o w e dt h a tt h eh i s t o p a t h o l o g yo ft o x i n i io nh a r m i g e r am i d g u t w a ss i m i l a rt ot h a to fo t h e rn o v e lm i d g u t - a c t i v et o x i n s s u c h a st h e 6 ，e n d o t o x i n sf r o mb a c i l l u st h u r i n g i e n s i so r1 bf r o mp h o t o r h a b d u sl u m i n e s c e n sw - 1 4 t h em i d g u tt i s s u e so fh a r m i g e r ab e g a nt oc h a n g ea f t e rt a k e nt h et o x i n i i o r a l l y i n s i xh o u r s t h ee p i t h e l i u mw a sd e c o m p o s e dg r a d u a l l y t h ec e l l sw e r el o o s eo rd i s o r d e r e da t l a s t t h ep e r i t r o p h i cm e m b r a n ed i s a p p e a r e da f t e r1 2h o u r s ，b u ta p p e a r e da g a i na f t e r7 2 h o u r sf o l l o w i n g t r a n s i e n to rs u b l e t h a le x p o s u r et ot h et o x i n 硒es y m p t o m s s h o w e dt h a t t h eh i s t o p a t h o l o g yo ft h ep l u t u l l ax y l o s t e l l aa n dp i e r i sr a p a em i d g u t sw a ss i m i l a r t ot h a to f h a r m i g e r ab u tm o r e s e r i o u s , t w oi n j e c t a b l ei n s e c t i c i d a lp r o t e i n s ( t o x i ni i ia n dt o x i nv 1 1 ) h a v ed i f f e r e n te f f e c t so n g a l l e r i am e l l o n e l l af i f l h - i n t a rl a r v a e t o x i ni i i d e s t r o y e d t h ei n s e c t h e m o c y t e s i n t o f r a g m e n r y , a n d t h ec o l o u ro ft h eh e m o c o e lb e c a m eb r o w n t o x i nv i ic o u l dn o td e s t r o yt h e h e m o c y t e sa n dt h eh e m o c o e lc o l o u r d i dn o t c h a n g e p e r h a p st o x i n a f f e c t e do t h e r t i s s u e so ft h egm e l l o n e l l a k e y w o r d s ：x e n o r h a b d u s n e m a t o p h i l a ：i n s e c t i c i d a lp r o t e i n s ；i n s e c t i c i d a l m e c h a n i s m 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑i 垦盛些盘鲎或其他 教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：带眩白帮j 签字日期：娜年6 月冲日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑些盘些盘鲎有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查 阅和借阅。本人授权塑a 垦塞些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：节库向划 导师签名： 签字日期：h 年占月谬日签字日期： 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 兹力灸 柝 电话 邮编 月钟日 i 嗜线虫致病杆菌杀虫毒素的分离纯化及杀虫机理的研究 1 1 昆虫病原线虫共生菌简介 1 引言 近些年来，出于对人类生态环境安全的考虑，农业生防微生物及其代谢产物在防 治植物病虫害中发挥着重要作用。而得到世界各国的广泛重视。当前农业生产中所应 用的生防微生物如苏芸金杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ) 、昆虫病毒等远远不能满足生 产的需求，并且在实际生产中b l 生物杀虫剂的大量使用及表达b t 毒素的转基因植物 的大面积种植都会加速抗性昆虫种群的发展【1 , 2 j ，因此亟待筛选和开发新的杀虫毒素 并提供更多样化的生防微生物及杀虫基因。 在新一代的生防微生物中，线虫一共生菌复合体由于其杀虫能力强、杀虫谱广、 对生态环境安全等诸多优点，已逐渐成为引人注目的新型生物杀虫剂【3 l 。目前，线虫 一共生菌复合体是害虫防治中唯一一种不用通过生物安全性检测的生肪制剂。 昆虫病原线虫共生菌是存在于昆虫病原线虫( e n t o m o p a 山o g e n i cn e m a t o d e s ， e p n s ) 肠道内的类革兰氏阴性细菌，属肠道杆菌科( e n t e r o b a c t e r i a c e a e ) 1 4 】。现已 描述的共生菌有两个属嗜线虫属( x e n o r h a b d u s ) 和发光杆菌属( p h o t o r h b d u s ) ， 其中，x e n o r h a b d u s 与斯氏属线虫( s t e i n e r n e m a ) 共生，p h o t o r h a b d u s 与异小杆属线 虫( h e t e r o r h a b d i t i s ) 共生1 4 “。共生菌与线虫之阁互惠互利的共生关系可以概括为： 共生菌存在于侵染期线虫肠道内，线虫携带共生菌进入寄主昆虫体内，并将共生菌释 放到昆虫的血腔中；共生菌在昆虫血腔内繁殖产生毒素蛋白导致昆虫患败血症在 4 8h 内死亡，若生菌能分解寄主的营养物质，提供给线虫所需的营养，同时共生菌产 生的抗菌素能抑制其它杂菌的侵染，为线虫的生长、发育和繁殖提供理想的生存环境 “。由此可以看出，昆虫病原线虫一共生菌复合体对昆虫具有强致病力，共生菌在 其中起着关键性作用。 尽管在昆虫病原线虫一共生菌复合体的杀虫过程中，共生菌是关键的致病因子， 但是在自然状态下，由于共生菌在土壤和水中均不能存活，而携带共生菌的侵染期线 虫仅在遇到昆虫血淋巴时才会释放共生菌，共生菌也仅能在昆虫血腔中繁殖并杀死昆 虫【1 0 。“，因此限制了共生菌的广泛应用。b o w e n 等人( 1 9 9 8 ) 首次从发光杆菌 p h o t o r h a b d u sl u m i n e s c e n sw - 1 4 的胞外分泌物中分离纯化出具有极高口服杀虫活性的 毒素蛋白 i3 ，1 4 】，引起了人们的广泛关注，该篇报道成为昆虫病原线虫共生菌研究的里 程碑。随后人们发现x e n o r h a b d u sn e m a t o p h i l a 、x e n o r h a b d u sb o v i n e i i 等多种共生菌 在离体培养中都能产生具有很高口服杀虫活性的蛋白，并且其杀虫谱较b t 广 7 5 , 1 6 j 。 昆虫病原线虫共生菌口服杀虫蛋白及其基因的发现和研究为共生菌在害虫生物防治 中的应用开辟了条新的途径。昆虫病原线虫共生菌有可能直接作为生防制剂用于防 治叶面害虫，其杀虫毒素基因也可能象b t c r y 基因一样用于培育转基因抗虫植物。 河北农业大学硕士学位论文 图1 昆虫病原线虫消化道中的共生茵x e n o r h a b d u sn e m a t o p h i l a f i g 1 x e n o r h a b d u sn e m a t o p h i l ai n s i d ev e s i c l eo f s t e i n e r n e m a 1 2 共生菌产生的杀虫毒素 现已有许多科学家从昆虫病原线虫基生菌离体培养液中提取出具有高杀虫活力 的毒素蛋白，这类蛋白具有杀虫谱广、高效安全等诸多优点1 1 5 , 1 6 , 1 9 - 2 1 】，可以很好的缓 解目前用于转基因抗虫植物的杀虫基因种类少、害虫抗性增加等不良局面。 共生菌所产生的高毒力毒素蛋白，一直都是国内外研究的热点。b o w e n 等人【1 3 , 1 4 】 ( 1 9 9 8 a ，1 9 9 8 b ) 用超滤及d e a e 离子交换层析的方法对只l u m i n e s e n s 、v - 1 4 发酵液粗 提，然后用h p l c 的方法对粗提物进行分离纯化，得到4 种毒素蛋白( t o x i n c o m p l e x 。 t c ) 侈 别称为t c a ，t c b ，t c c ，t c d ) ，s d s p a g e 表明每种t c 又由多个多肽组成； 分别用各毒素成分饲喂烟草天蛾( m a n d u c as e r t a ) 初孵幼虫，发现其中t c a 、t c d 在 毒素的杀虫活性中是必不可缺的。p a n 等人( 2 0 0 2 ) 首次从盖n e m a t o p h i l ab j 胞内分 离纯化出一种具胃毒活性的高分子量蛋白复合物x i n l 2 2 j 。最近b r o w n 等人( 2 0 0 4 ) 从xn e m a t o p h i l aa 2 4 菌株中得到一个4 2k d a 的血腔毒蛋白m 】。另外，王立霞( 2 0 0 0 ) 从xb o v i e n i i 的细胞培养液中分离出一种糖蛋白对棉铃虫、玉米螟有口服和血腔毒 性，并且这种糖蛋白和t c 一样也作用于昆虫中肠细胞，中肠的病理变化也与其它作 用于中肠的杀虫毒素类似1 2 m 。 t c 毒素和x p t 毒素都是由多个基因编码的复合蛋白，分离纯化比较困难，i 矧此 到目前为止，只从pl u m i n e s c e n sw - 1 4 共生菌培养液中直接分离纯化出t c 蛋白毒素 系列l l3 t ”l ，还没有从嗜线虫致病杆菌培养液中直接分离得到纯化的蛋白毒素，x p t 蛋 白毒素是通过构建基因文库一基因亚克隆一异源表达的途径获得的【2 ”。 此外，和许多革兰氏阴性菌一样，共生菌也能产生多种血细胞毒素如脂多糖 类( l p s ) 内毒素、c y t o l y s i n s 等毒素1 6 , 2 6 - 2 9 l 。对不同菌株的研究结果表明。不同种 类的共生菌及同一种类不同品系所表现的杀虫活性差别很大，所产生的毒素也不 嗜线虫致病杆菌杀虫毒素的分离纯化及杀虫机理的研究 同1 1 扣1 6 ，加，2 ”。到目前为止，除了对p l u m i n e s c e n s w - 1 4 菌株的t c 类毒素研究的比较 深入以外，对其它类共生菌毒素的研究很少，有关杀虫毒素作用机理、复合毒素 蛋白中各亚基间的关系及其在毒素蛋白杀虫活性中的作用、这些大分子复合物的 分泌机制等问题都需要进行深入的研究和探讨。 1 3 共生菌的杀虫毒索基因 目前，已从两种共生菌中克隆到与口服毒性有关的全长毒素基因。b o w e n 等人 ( 1 9 9 8 a ，1 9 9 8 b ) 从pl u m i n e s c e n sw 一1 4 中发现多个杀虫毒素基因，分别称t c a 、t c b 、t c c 、 t c d 【l3 ，“i 。w a t e r f i e l d 等人研究发现，t c c c 与t c d a 和t c d b 的联合表达对肛s e x t a 有明 显毒性，缺少t c c c 的t c d a 与t c d b 的重组质粒表达产物对ms e x t a 无明显口服毒性， 说明t c c c 蛋白在杀虫毒素的1 5 1 服毒性中超重要作用i 。m o r g a n 等人从x n e m a t o p h i l u sp m f l 2 9 6 品系的粘粒文库中筛选到一个粘粒克隆对大菜粉蝶幼虫( p i e r i s b r a s s i c a e ) 有口服毒性，该粘粒克隆所携带的毒素基因簇包括多个开放读码框( o r f s ) ， 其中x p t a l 、x p t a 2 、x p t b l 、x p t c l 、x p t d l 这5 个o r f s 的核苷酸序列和编码氨基酸 序列与只l u m i n e s c e n sw 1 4 的杀虫毒素基因及蛋白均有一定的同源性【3 1 1 。对只 l u m i n e s c e n sw - 1 4 和xn e m a t o p h i l u sp m f l 2 9 6 克隆到的毒素基因进行功能分析发现， 共生菌对昆虫的口服毒性与多个基因的联合表达有关i ”。“。 d a b o r n 等人从只l u m i n e s c e n sa k h u r s t i iw - 1 4 品系中克隆出一个可使昆虫幼虫瘫 痪的8 8k b 毒素基因一致软基因m c g e n e ) ，该基因转染到ec o l i 中表达后可使ec o l i 保留在昆虫体内并杀死昆虫【3 3 】。崔龙利用构建粘粒文库的方法从xn e m a t o p h i l ab p 菌株中筛选出1 个杀虫阳性克隆，部分序列的测定显示该克隆所含毒素基因与x n e m a t o p h i l ap m f l 2 9 6 同源性很高，同时也发现x p t 基因簇中部分基因的缺失会导致杀 虫活性的降低或消失i ”l 。“u 等人已经成功地将只l u m i n e s c e n sw - 1 4 中的t c d a 杀虫 毒素基因在拟南芥中表达，得到的2 8 3k d a 的毒索蛋白对ms e x t a 、d i a b r o t i c a u n d e c i m p u n c t a t a 等多种农业害虫有一定的杀虫活性，但是杀虫活性比较低【”】。 前人所做的大量有关共生菌杀虫毒素基因的工作表明共生菌杀虫毒素是一种由 多个基因联合调控表达的复合蛋白，从而可以很好的解释为什么杀虫毒素蛋白的纯化 物比总蛋白生物活性小以及单一毒素基因外源表达无法获得高杀虫活性的毒素蛋白。 共生菌杀虫毒素基因的破译和基因之间相兰i 作用关系的逐渐明了，可以进一步用来在 细菌或植物中大量表达毒素蛋白，开发新一代的生防制剂和转基因植物。 1 4 共生菌对昆虫中肠的影响的研究现状 目前，已知的具有强杀虫活性的细菌蛋白包括b t 和b a c i l l u ss p h a e r i c u s 的晶体毒 素( 6 一内毒素) 、b t 的v i p 毒素、s t r e p t o m y c e ss p p 的胆固醇氧化酶，所有这些毒 素都能溶解破坏昆虫寄主的中肠上皮细胞【3 5 , 3 6 l 。近期的研究发现pl u m i n e s c e n 5 和 五n e m a t o p h i l a 这两种共生菌所产生的毒素蛋自在昆虫血腔内对中肠也有类似的影响 河北农业大学硕士学位论文 3 7 , 3 ”，已经确定的能够作用于昆虫中肠的毒索有来自只l u m i n e s c e n s 的t c 毒素、致 软毒素( m c f ) 及来自xn e m a t o p h i l a 的x p t 毒素、a 2 4 t o x 毒蛋白【1 3 2 3 ，3 1 j 3 1 。t c a 抗体 标记测定显示，在昆虫血腔一侧的发光杆菌也能产生t c a 毒蛋白，但是产生的时间是 在寄主昆虫死亡之后，因此推测此时t c a 的功能主要是分解中肠组织【3 5 ，3 9 1 。昆虫血 腔注射绿色荧光蛋自标记的共生菌，发现共生菌最初聚集在昆虫中肠前端肌肉周围的 胞问质中，随后逐渐扩散到整个中肠，最后附着到上皮细胞上，导致中肠上皮细胞凋 亡，其侵染过程与口服共生菌毒素的类似【3 7 , 3 8 】。 b o w e n 等人对只l u m i n e s c e n s w - 1 4 菌株的杀虫毒蛋白t c a 的研究表明，口服或注 射该毒素对腻s e x t a 幼虫的中肠都有同样的破坏作用，即首先会在寄主中肠前端上皮 组织出现空洞，在肠腔中出现细胞碎片，4 8h 后柱状细胞消失，幼虫停止取食直至最 后死亡f 1 3 , 1 4 j 。 目前对共生菌在昆虫血腔中生活史研究的较为透彻，但是对于共生菌在中肠肠腔 内的存活及作用机理还不清楚，如共生菌在中肠内的侵染过程? 共生菌或其毒素是如 何破坏昆虫中肠围食膜和中肠上皮细胞进而：杀死昆虫的? 这些问题还有待进一步深 入研究。 1 5 研究目的与意义 我国有着非常丰富的昆虫病原线虫资源，其中一定存在着具有较高杀虫活性的共 生菌菌株。本实验在前期工作中从河北省土壤中筛选出一株具有高毒力的共生菌菌株 一嗜线虫致病杆菌h b 3 1 0 菌株，并且发现该菌株发酵液的胞内上清和胞外上清中都 存在高活性的杀虫物质l 加j 。本实验利用盐析的方法提取h b 3 1 0 菌株的胞内总蛋白， 利用制备型非变性凝胶电泳的方法纯化得到杀虫毒素，并饲喂寄主昆虫，目的在于通 过组织解剖和切片观察研究毒素对昆虫中肠的组织病理学影响，揭示通过口服和血腔 注射毒素对昆虫的中肠和血腔组织病理学影响。本实验有助于探明共生菌或其杀虫毒 素能否成为新- 4 4 的生防因子，为共生菌的开发利用奠定良好的理论基础。 4 嗜线虫致病杆菌杀虫毒素的分离纯化及杀虫机理的研究 2 1 实验材料 2 1 1 供试昆虫： 2 材料与方法 棉铃虫( h e l i c o v e r p aa r m 如r e m ) 、大蜡螟( g a l l e r i am e l l o n e l l a ) 、小菜蛾( p l u t e l l a x y l o s t e l l a ) 、菜青虫( p i e r i sr a p a e ) 均由害虫生防实验室养虫室提供。 2 1 2 供试菌株 嗜线虫致病杆菌h b 3 1 0 菌株( xn e m a t o p h i l ah b 3 1 0 ) 由害虫生防实验室经土壤 分离获得。 2 1 3 培养基： n a 培养基：牛肉膏5g ，牛肉蛋白胨1 0g ，琼脂2 0g ，加8 0 0 m l 蒸馏水，调 p h ：7 2 7 5 ，定容至1 0 0 0m l ，分装，高压灭菌，4 保存。 n b t a 培养基“：营养琼脂4 5g ，溴百里酚蓝( b t b ) 0 0 2 5g ，氯化三苯基四 氮唑( 1 t r c ) 0 0 4g ，水1 0 0 0m l ，p h ：7 2 7 4 ，分装，高压灭菌，4 c 保存。 牛肉汤培养基：牛肉蛋白胨1 0 9 ，牛肉膏3g ，氯化钠5g ，水1 0 0 0 m l ，p h ：7 2 7 4 ， 分装，高压灭菌，4 保存。 2 1 _ 4 试剂 牛肉蛋白胨、牛肉膏、营养琼脂均为北京双旋微生物培养基制品厂产品：丙烯酰 胺( a c r ) 、甲叉双丙烯酰胺( b i s ) 、考马斯亮蓝r 2 5 0 、甘氨酸为s i g m a 公司产品； n ，n ，n ，n 四甲基乙二胺( t e m e d ) 为f l u c a 公司产品；氯化三苯基四氮唑( t 1 ) 、 溴百里酚蓝( b t b ) 、氯化钠、十二烷基苯磺酸钠( s d s ) 、丙酮、二甲苯、丙三醇等 均为国产分析纯。曙红( 生物染色试剂) 为北京化工厂出品：苏木精( 生物染色试剂) 为北京化学试剂公司出品；2 ，4 ，6 - 三硝基酚( 苦味酸) 为化学纯，广东台山化工厂 出品；石蜡( 熔点6 0 6 2 ) 为上海华永石蜡有限公司出品。 2 1 5 仪器及透析袋 高速冷冻离心机( c e n t r i f u g e 5 8 1 0r e p p e n d o r f 公司) e c p 3 0 0 0 三恒电泳仪( 北京市六一仪器厂) i - i z q q 全温振荡器( 哈尔滨东联公司) 5 河北农业大学硕士学位论文 超声波破碎仪( s o n i c sv i b r oc e l l ) 转移脱色摇床t s 一8 0 0 ( 中国科工卫仪器仪表公司) 台式冷冻切片机( 江苏金华科迪仪器厂) 透析袋( 美国产d 1 6m m 、截留分子量为8 0 0 0 一1 4 0 0 0 d a ) 2 1 6 石蜡切片试剂的配制 苏木精染色液：3g 苏木精溶于1 5 0m l 9 5 酒精中，加入蒸馏水1 5 0m l 后加入 甘油1 5 0 m l 。硫酸铝钾4 5g 溶于1 5 m l 冰醋酸中。最后将两者混合 呈淡红色，用纱布封好，时时摇动，一个月后可使用。 曙红染色液：5g 曙红溶于4 9 5m l 9 5 酒精中。 梅氏蛋白贴片剂：鸡蛋清与甘油等体积混合。 1 盐酸酒精分化液：2m l 盐酸加入到5 0 0m l 7 0 酒精中。 1 氨水分化液：5m l 氨水加入到5 9 0 m l t 0 酒精中 波恩固定液：1g2 - 4 6 一三硝基酚( 苦味酸) 溶于7 5m l 蒸馏水中，再加入2 5 m l 4 0 甲醛和5m l 冰醋酸。 2 2 实验方法： 2 2 1 h b 3 1 0 菌株的胞内蛋白的分离纯化及杀虫活性测定 2 2 1 - 1h b 3 1 0 菌株胞内蛋白的提取 h b 3 1 0 菌株发酵液经1 0 0 0 0r p r n 、4 c 离心2 0m i n ，取其上清过o 4 5p m 滤膜， 在其中加入硫酸铵至8 5 饱和度，在4 c 静置1 2h 1 5h 后，于1 0 0 0 0r p m 、4 。c 离心 2 0m i n 。离心后的沉淀用少量的去离子水稀释，装入透析袋内，在4 c 去离子水中透 析，每隔4h 左右更换1 次去离子水，透析4 8h 。透析后所得即为胞外蛋白提取物， 置于一8 0 保存备用。 h b 3 1 0 菌株发酵液离心后所得的细胞沉淀，先用磷酸缓冲液( p b s ) 洗三次，每 次在1 0 0 0 0r p m 、4 c 离心1 5m i n ，再用适量p b s 悬浮细胞沉淀，在冰上用超声波破 碎仪破碎细胞，然后于1 0 0 0 0r p m 、4 c 离心2 0m i n ，所得上清过0 4 5 m 滤膜，其它 步骤同胞外蛋白的提取方法最后得到的胞内蛋白提取物置于一8 0 保存备用。方法 参考文献1 4 2 1 。 2 2 1 ，2h b 3 1 0 菌株胞内蛋白提取物的n a t i v e p a g e 电泳 将盐析所得的胞内蛋白提取物，通过n a t i v e p a g e 制各性电泳进一步分离纯化。 嗜线虫致病杆菌杀虫毒素的分离纯化及杀虫机理的研究 n a t i v e p a g e 采用5 浓缩胶、6 8 分离胶。凝胶、电泳缓冲液、染色液、脱色液 的配制参照文献 4 3 , 4 4 电泳所用缓冲液 浓缩胶缓冲液：1 0m o l l t r i s h c i ( p h = 6 8 ) 分离胶缓冲液：1 5m o l l i r i s h c i ( p h = 8 8 ) p a g e 电极缓冲液：3 0 3g t r i s ，1 4 4 1g 甘氨酸( p h = 8 3 ) ，用去离子水定容至1 0 0 0 1 1 3 l 。 凝胶加样缓冲液：甘油2m l ，1m o l l 溴酚蓝4m g ，浓缩胶缓冲液1m l ，加去离 子水并定容至2 0m l 。 染色液：0 2 5g 考马斯亮蓝r 一2 5 0 ，4 5m l 无水甲醇，1 0m l 冰醋酸，加去离子水 定容至1 0 0 m l 。 脱色液：4 5 m l 无水甲醇，1 0 m l 冰醋酸，4 5 m l 去离子水。 电泳条件：4 条件下电泳4h 5h ，浓缩胶恒压5 0v ，分离胶恒压1 0 0 v 。 n a t i v e p a g e 凝胶按表1 配制： 表16 一8 n a t i v e - p a g e 凝胶的配制 。 t a b l e1 p r e p a r a t i o no f 6 - 8 n a t i v e p a g eg e 蛋白质条带的定位及蛋白样品的洗脱：从胶板的两边各切下1 个泳道的胶条，用 考马斯亮蓝染色2h ，其剩余的胶置于4 c 冷藏保存。然后根据染色的胶条上蛋白条 带的位置，从未染色的凝胶上仔细切下每一个蛋白条带，分别置于离心管中充分捣碎， 加入适量的p b s 缓冲液，4 c 、1 2 0 0 0r p m 离心2 0m i n ，除去凝胶碎片，回收上清液 编号即为各号蛋白毒素，置于- 8 0 c 保存备用。 2 2 1 3 h b 3 1 0 菌株胞内蛋白提取物的s d s p a g e 电泳 胞内蛋白提取物进行s d s p a g e 电泳。电泳采用5 的浓缩胶、8 的分离胶，具 河北农业大学硕士学位论文 体方法参照文献 4 3 ，4 4 。 磷酸盐缓冲液( p b s ) ：在8 0 0m l 蒸馏水中溶解8g n a c l ，0 2gk c l ，1 4 4gn a 2 h p 0 4 和0 2 4gk h 2 p 0 4 ，再用h c i 调节溶液的p h 值至7 4 ，加水定容至1 l 。 电泳所用缓冲液： 浓缩胶缓冲液：1 0m o l l t r i s h c i ( p h = 6 ，8 ) 分离胶缓冲液：1 5m o l l t r i s h c i ( p h = 8 。8 ) 5 s d s - p a g e 电极缓冲液：1 5 1g t r i s ，9 4g 甘氨酸( p h = 8 3 ) ，1 0 s d s3 0 m l ， 加去离子水定容至1 0 0 0m l 。 2 s d s p a g e 凝胶加样缓冲液：1 0 s d s 4m l ，巯基乙醇1m l ，甘油2m l ，o 1 溴酚蓝o 5m l ，浓缩胶缓冲液1m l ，加去离子水1 5m l 混匀。 染色液：4 5m l 无水甲醇，1 0m l 冰醋酸，在其中溶解o 2 5 9 考马斯亮蓝r 一2 5 0 ， 去离子水定容至1 0 0 m l 。 脱色液：4 5 m l 无水甲醇，1 0 m l 冰醋酸，4 5 m l 去离子水。 电泳条件：常温条件卜电泳4h 5h ，浓缩胶恒压5 0 v ，分离胶恒压1 0 0 v 。 s d s p a g e 凝胶按表2 配制： 表28 s d s p a g e 凝胶的配制 ! 些堡! ! 堡兰兰塑! ! ! ! 丝i 旦! ：垦箜呈壁! 浓缩胶：m l ) 5 分离胶( m l ) 8 2 2 l 4h b 3 1 0 菌株胞内蛋白纯化物的杀虫活性生物测定 胃毒活性的测定方法 以棉铃虫初孵幼虫为试虫，以h b 3 1 0 菌株发酵液、胞内总蛋白、胞内各号蛋白 条带上清为供试样品，以无菌水为对照。每一处理设三次重复，每重复2 4 头幼虫。 每处理按1 0 0 y l 样品g 饲料的比例混合样品和饲料，混匀后分装于2 4 孔生测板内， 每孔放1 头幼虫，盖上盒盖，置于( 2 6 1 ) 、1 4h 光照的生化培养箱中。每天记 嗜线虫致病杆菌杀虫毒素的分离纯化及杀虫机理的研究 录死亡虫数，第5d 时记录活虫数并称量活虫体重，分别计算幼虫生长抑制率和死亡 率，筛选出具胃毒活性的蛋白条带。 血腔活性的测定方法 用微量注射器取1 0 # l 胞内总蛋白和胞内各号蛋白条带上清，从5 龄大蜡螟的第 一对腹足之间注射到体腔内。每处理重复3 次，每个重复1 0 头幼虫，注射后放在培 养皿中，不再给予人工饲料，注射p b s 为对照，放在( 2 6 4 - 1 ) 生化培养箱中培养。 第3d 时记录其死亡虫数，筛选出具血腔活性的蛋白条带。 2 2 1 5 h b 3 1 0 菌株胞内蛋白纯化物的蛋白含量测定 蛋白标准曲线的测定 标准蛋白质溶液：准确称取牛血清蛋白o 1g ，用少量蒸馏水溶解，并定容至1 0 0 0 ml ，备用。 考马斯亮蓝g 一2 5 0 蛋白试荆的制备：1 0m g 考马斯亮蓝g 2 5 0 溶于5m l 9 5 7 , 醇中，再加入1 0m l 8 5 的磷酸溶液，角蒸馏水定容至1 0 0 m l 。取6 只干净的试管， 按表3 数据配置牛血清蛋白溶液各1m l 。 表3 标准蛋白溶液的配制 t a b l e3 p r e p a r a t i o no fs t a n d a 【r dp r o t e i ns o l u t i o n 管号12 345 6 _ _ 一- 一 标准蛋白赝溶液( m l ) 0 00 2 0 40 6 0 , 81 0 蒸馏水( m l ) 1 00 80 6 0 40 2 0 里皇垦查! ! 丝! ：! ! ! ! ! 竺 ! 竺 准确吸取所配各管溶液o 1m l ，分别放入另外6 只试管中，加入5m l 考马斯亮 蓝g 一2 5 0 蛋白试剂后混匀，室温放置1 5 分钟后，用7 5 2 型紫外分光光度计5 9 5n m 下 比色，以蛋白含量为横坐标，所测o d 值为纵坐标绘制标准曲线。 制备反应液 剐胞内提取物，按1 7 u l 提取物加8 3 l 蒸馏水和5 m l 考马斯亮蓝g 一2 5 0 蛋白 试剂混匀；对n a t i v e - p a g e 胶回收蛋白直接取1 0 0 t l 样品，室温放置1 5 m i n ，在5 9 5 n m 下比色，重复三次，取其平均值，即可从标准曲线上查取所测o d 值对应的蛋白 质含量。 2 2 2 h b 3 1 0 菌株毒素蛋白对昆虫中肠组织病理学影响 2 ，2 2 1 试虫处理： 棉铃虫毒素饲喂处理： 9 河北农业大学硕士学位论文 在2 2 1 4 步骤中筛选出的具胃毒活性的毒素设定为毒素a 。先将室内饲养的4 龄棉铃虫幼虫饥饿2 4h ，然后将2 0 , u l 的毒素a 样品滴到0 4c m 3 的棉铃虫人工饲料 上，单头饲喂棉铃虫。对照为同等体积人工饲料加2 0u l p b s 饲喂的4 龄棉铃虫幼虫。 待棉铃虫幼虫取食完加有样品的饲料后，补充不加任何样品的人工饲料。试虫放在( 2 6 1 ) 、光照1 4h 的培养箱内培养。其中一部分棉铃虫幼虫在饲毒1 2 0h 后比较其 生长发育状况；另一部分棉铃虫幼虫在饲毒6h 、1 2 h 、2 4h 、3 6h 、4 8h 、6 0h 、7 2h 、 9 6h 后，解剖中肠或围食膜，观察其外观变化及制作中肠切片。 棉铃虫围食膜的毒素a 体外处理： 取室内饲养的4 龄健康棉铃虫幼虫完整围食膜，单条分装于1 5m l 离心管中。 然后将2 0 “l 的毒素a 样品滴加到装有围食膜的小管内。对照组加2 0 弘l p b s 于围食 膜上。各管均放置于室温条件下，在处理1 2h 、2 4h 、4 8h 后，观察比较围食膜变化。 小菜蛾毒素a 饲喂处理： 先将室内饲养的3 龄小菜娥幼虫饥饿1 2h ，然后将2 0 l 的毒紊a 样品涂抹在 约4 c m 2 的甘蓝叶片上，饲喂小菜蛾幼虫。对照为同等面积叶片加2 0u l p b s 饲喂的3 龄小菜蛾幼虫。试虫放在( 2 6 1 ) 、光照1 4h 的培养箱内培养。小菜蛾在饲毒1 2 h 、2 4h 、4 8h 、7 2h 及死亡后，解剖取中肠制作切片。 菜青虫毒素a 饲喂处理： 先将室内饲养的4 龄菜青虫幼虫饥饿1 2h ，然后将2 0 肛l 的毒素a 样品涂抹在 约4 c m 2 的甘蓝叶片上，饲喂菜青虫幼虫。对照为同等面积叶片加2 0 “l p b s 饲喂的4 龄菜青虫幼虫。试虫放在( 2 6 1 ) 、光照1 4h 的培养箱内培养。菜青虫在饲毒1 2 h 、2 4h 、4 8 h 、7 2h 及死亡后，解剖取中肠制作切片。 2 2 2 2 共生菌杀虫毒素对棉铃虫、小菜蛾、菜青虫中肠组织石蜡切片观察 将各处理组的试虫中肠放入波恩固定液中固定2 4h ，制作石蜡切片r 切片厚度5 - 8 “m ) ，用苏木精一伊红双染法染色，封片后在光学显微镜下观察并拍照j 。试虫中肠 组织石蜡切片的制作步骤： 取材：取各处理组的试虫，取出中肠将其展直后立即投入固定液。 固定：将组织材料在固定液中固定2 4h ，固定后用7 0 酒精洗涤若干次，直至脱 去黄色。 脱水：采用酒精系列脱水法，3 0 酒精一5 0 酒精一7 0 酒精一8 0 酒精一9 0 酒精一9 5 酒精一1 0 0 酒精。 透明：将脱水后的组织材料浸入二甲苯，透明2 0r a i n ，至材料呈透明或半透明。 浸蜡：将石蜡熔化后，在水浴锅中保温。先用滤纸吸去多余的透明剂，将材料放入 熔融的石蜡中，浸蜡1 _ 5h 。 包埋：折叠好适当大小的纸盒，将材料随石蜡一起倒入纸盒中，把材料摆放整齐， 纸盒置于冰盒上冷却，至石蜡完全凝固。 切片：将蜡块修好，固定在木块上用切片机切片，厚度为缸m 。 1 0 嗜线虫致病杆菌杀虫毒素的分离纯化及杀虫机理的研究 贴片：将切下的组织在3 5 4 0 c 水中展片，然后贴于涂有梅氏蛋白的载玻片上，将 其在酒精灯上晃动加热至石蜡熔化，最后摆放于染色架上置于3 8 c 培养箱 内烘片3 - 4h 。 染色：二甲苯( 重复两次) 一1 0 0 酒精一9 5 酒精一8 5 酒精一7 0 酒精一蒸馏 水一苏木精一自来水冲洗一1 盐酸酒精分化液一蒸馏水一l 氨水分化液 一蒸馏水一7 0 酒精一8 0 酒精一9 0 酒