（农药学专业论文）多杀菌素及其代谢物在棉田土壤、棉叶和棉籽中的残留研究.pdf

摘要 多杀菌素( s p i n o s a d ) 是在9 0 年代初期开发的一类大环内酯化合物。该类化合物有很高的生 物活性，对非靶标生物的毒性很低。该化合物代谢物成分复杂，极性强，仅在低波段有紫外吸收， 给残留分析带来困难。虽然国外已有h p l c 法报道但仍有许多问题尚未解决，杂质干扰大，使 分析回收率偏低。 法。 本实验优化了多杀菌素残留分析前处理步骤和色谱分析条件，建立了一套可行的残留分析方 本实验在比较不同色谱条件的基础上选用c ，e 色谱柱，以甲醇+ 乙腈+ 2 乙酸铵= 3 2 + 6 4 + 5 为 流动相，快速准确的分析了多杀菌素及其代谢物。在样品前处理步骤的改进中，研究了d h 值 干燥剂，不同萃取小柱的效果，优化了前处理实验条件。 根据上述优化的参数，建立了多杀菌素残留分析方法，本方法在0 0 2 o 1 0m g k g 水平的 添加回收试验中，棉籽中的添加回收率在7 6 1 9 1 4 ( 变异系数2 3 5 1 1 3 4 ) ，在土壤中的 添加回收率在7 7 2 9 3 5 ( 变异系数2 9 7 7 5 6 ) ，在棉叶中的添加回收率在7 7 0 9 3 3 ( 变异系数3 2 1 7 2 6 ) ，在土壤中的最低检出浓度为0 0 0 3 m g k g ，在棉籽中最低检出浓度为 0 0 0 5 m g k g ，符合残留分析要求。 本实验采用l c m s 的方法研究了多杀菌素及其代谢物在土壤中的残留分析方法，方法的最低 检出浓度为5 p p b r 在5 p p b 5 0 0 p p b 浓度范围内方法符合定量分析要求，根据1 c 煅方法所具有 的良好排除干扰能力，本试验简化了前处理步骤，并验证了方法的回收率。 田间试验部分，采用2 5 s p i n o s a d 悬浮剂按推荐最高剂量8 0 m l m u 及2 0 倍推荐剂量 1 6 0 r a l m u 、施药3 _ 4 次、间隔期7 一1 4 天喷药多杀菌素及其代谢产物在棉籽中的最终残留量均 未检出( 小于晟低检出浓度0 0 2 m g k g ) ，在棉田土壤样中检出s p i n o s y nb0 0 2 m g k g 外，其余 处理均未检出( 低于最低检出浓度0 0 2 m g k g ) ，用2 5 s p i n o s a d 悬浮剂1 6 0 m l m u 喷药。多杀 菌素及其代谢产物在棉叶和棉田土壤中快速降解。s p i n o s y na 在棉叶中的半衰期为3 o l 天，在 土壤中的半衰期为2 1 8 天，s p i n o s y nd 在棉叶中的半衰期为1 9 6 天，土壤中的半衰期为2 2 9 天：包括其代谢产物b 和bo fd 在内的折合多杀菌素总残留量在棉叶和土壤中的半衰期分别为 3 6 l 天和2 5 4 天，多杀菌素母体化合物及其代谢物在1 2 天后均未检出不会在土壤和植株中积 累。 关键词：多杀菌素，残留，前处理步骤，液相色谱，l c m s ，棉田土壤，棉叶，棉籽 a b s t r a c t i nt h i s a r t i c l e ，c l e a n u pm e t h o d sa n dc h r o m a t o g r a p h i ca n a l y s i s m e t h o df o r s p i n o s a dr e s i d u e a n a l y s i sw a so p i t i m i s e da n d ar e l i a b l er e s i d u ea n a l y s i sm e t h o d sw a s d e v e l o p e d i nt h ee x p e r i m e n t ，r e v e r s e dc 1 3c o l u m nw a se m p l o y e d t h em o b l ep h a s ec o n t a i nm e t h a n o l ， a c e t o n i r o l ea n da c e t a t e da l u m i u mw i t hr a t i oo f 3 2 ，6 4a n d5w a su s e d t h ee f f e c to f p h v a l u e 、d r y i n ga g e n ta n d d i f f e r e n tt y p eo f s p ec o l u m ni nt h e c l e a n - u ps t e piw a s c o m p a r e d a c c o r d i n gt op r e v i o u sp a r a m e t e r ，as e l e c t i v ea n ds e n s i t i v em e t h o du t i l i z i n gl i q u i d c h r o m a t o g r a p h ( h p l c ) w a sd e v e l o p e d f o r d e t e r m i n i n gr e s i d u e so f s p i n o s a di ns e v e r a lm a t r i c e s f o rc o t t o n s e e d ，t h em e t h o dh a dal i m i to f q u a n f i t a t i n n ( l o q ) o f 0 0 0 3 m g h c g f o rs o i l t h em e t h o d h a da nl o qo f 0 0 0 3 m g k g f o rc o t t o n s e e d , t h ea v e r a g er e c o v e r i e sr a n g e df r o m7 6 1 9 1 4 w i t h s t a n d a r dd e v i a t i o n sr a n g i n gf r o m2 3 5t o11 3 4 f o rs o i l , t h ea v e r a g er e c o v e r i e sr a n g e df r o m7 7 2 9 3 5 w i t hs t a n d a r dd e v i a t i o n sr a n g i n gf r o m2 9 7t o7 5 6 0 , f o rc o t t o nl e a f , t h ea v e r a g er e c o v e r i e s r a n g e df r o m7 7 0 9 3 3 w i t hs t a n d a r dd e v i a t i o n sr a n g i n gf r o m3 2 1t o7 2 6 s p i n o s a da n di t ss e v e r a lm i n o rm e t a b o l i t e sw a l s om e a s u r e db yl c m sm e t h o d t h em e t h o d h a v el i m i t so f q u a n t i t a f i o no f o 0 0 5 m g k gi ns o i l d u et ol c m sm e t h o dh a v ee x c e l l e n tp e r f o r m a n c ei n t h ee l i m i n a t i n gi n t e r f e r e ，t h ec l e a n - u p p r e s o d u r e w a s s i m p l i f i e di nt h i sa r t i c l e i nt h ef i e l d t r i a l ，n os p i n o s a dr e s i d u ew a sd e t e r m i n e di nt h ec o t t o u s e e dw h e nt h es p r a y c o n c e n t r a t i o nf r o m8 0 m l m ut o1 6 0 m l m uu s i n g2 5 s p i n o s a ds ci nt h ef i e l d b e s i d es p i n o s y nbh a v e ac o n c e n t r a t i o no f o 0 2 m g k gi nt h es o i l ，t h e r ei sn oo t h e r c o m p o u n d s h a r tb e e nd e t e r i m i n e di nt h es o i l r e s u l t sa l s od e m o n s t r a t e dt h a ts p i n u s a dr e s i d u e si nt h ec o t t o nl e a fa n dc o t t o ns o i ld i s s i p a t e dr a p i d l y s p i n o s y na h a dh a l f l i f eo f 3 0 1i nt h ec o t t o nl e a f 2 1 8i nt h ec o t t o ns o i l s p i n o s y ndh a dh a l f l i f eo f 1 9 6i nt h ec o t t o nl e a f , 2 2 9i nt h ec o t t o ns o i l t h eh a l fl i f eo f s p i n o s a dt o t a lr e s i d u ew h i c hi n c l u d i n g s p i n o s y nba n ds p i n o s y nd m s d w a s3 6 1i nt h ec o a o nl e a f 2 5 4i nt h ec o t t o ns o i l s p i n o s a da n di t s s e v e r a lm i n o rm e t a b o l i t a sr e s i d u ew a sn o td e t e r m i n e da f t e r1 2d a y i tw o u l dn o tb ea c c u m u l a t e di nt h e s o l la n d p l a n t k e y w o r d s ：s p i n o s a d ，p e s t i c i d e ，r e s i d u e s ，h p l c ，l c m s ，c o t t o n s e e d ，s o i l i i 独创性声明 n 6 5 9 6 0 6 , 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：时1 9 ：2 0 0 4 年6 月 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫播等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：时间：年月日 新铭：每扎 帆。y 年6 月加日 玢卜 n厶yi 刁可 中国农业大学硕士论文文献综述 第一章文献综述 1 1 农药残留分析的必要性 农业生产中病虫草害的发生是不可避免的，化学防治作为一种重要的植物保护手段具有快 速、高效、经济等特点，并在今后一定的时间内，不会被其它手段完全代替( 默涛等，1 9 9 2 ) 。 中国土地辽阔，农作物品种丰富。农药的生产和使用量较大。我国每年生产农药量按有效成 分计在2 0 多万吨使用量约2 2 万吨，防治面积约5 亿亩次，可挽回1 5 3 0 的经济损失，总价 值5 0 0 多亿元。农药的使用在保证农业稳产、高产，满足人们对农副产品需求方面发挥着巨大的 作用。 然而，任何事物都具有两面性。绝太多数农药，尤其是化学农药及其代谢物和杂质存在着对 人、畜、有益生物的毒害及对环境的影响等问题。已经引起了人们对农药污染及农药残留问题的 重视( 许永峰等译，1 9 8 3 ) 。 随着我国加入世贸组织，农产品贸易中由于农药残留造成的经济损失相当可观，这一点已经 引起我国政府的高度重视。并加强了农药残留问题的研究。 在我国农药产品结构中高毒有机磷品种仍然占据很大的比例，这种不合理现象是造成农药残 留问题的重要原因之一( 樊德方等，1 9 9 2 ) 。 由于缺乏合理使用农药的知识以及在经济利益的驱动下，有些农民违反国家有关安全合理使 用农药的规定，超范围、超剂量和超频率地滥用农药的现象十分突出，导致农药残留问题严重。 进而对人民健康、进出口贸易和农业生产带来不利影响( 邹俊生等，1 9 9 5 ) 。 食用农药残留超标的农副产品，将引起人和动物的急慢性中毒，导致疾病的发生，甚至影响 到下一代。 如今世界各国，特别是发达国家对农药残留问题高度重视，对各种农副产品中农药残留都规 定了越来越严格的限量标准。许多国家以农药残留限量为技术壁垒，限制农副产品进口，保护农 业生产。由于农药残留问题，我国农副产品出口遭到了很大的影响。 1 2 农药残留分析方法 1 2 1 总体情况 农药残留分析方法有个不断发展完善的过程。五十年代初期，仅用比色法和定量法检测农药 的残留( 李本昌等，1 9 9 5 ：钱传范等1 9 9 2 ：张乔，1 9 9 0 ) 。晟典型的是比色法测定d d t 和六六六， 将提取后的d d t 或六六六经消化后在碱性溶液中进行显色测定；也有偶氨法分析提取液中艾氏剂、 狄氏剂、异狄氏剂等某些环戊二烯类农药的残留。而在定量法中，一般先使有机氯分子中的氯离 子部分地按农药分子结构定量地释放出来，然后用硝酸银进行滴定，从提取液中存在的氯离予数 推算出残留的农药数量。上述方法的灵敏度均不高，且由于缺乏选择性和易受干扰，其测定结果 中国农业大学硕士论文 文献综述 亦不准确。随后发展了薄层层析法( t l c ) 。该方法是根据被分析的化合物在不同溶剂问的分配情 况不同而达到彼此分离的目的。t l c 法可以将被测对象与各类杂质、代谢及降解衍生物进行较好 地分离。操作简便，但灵敏度仍不够高。为了提高检测的灵敏度，人们结合使用酯酶或扫描仪等 进行显色或定量。同时又发展了分光光度法、荧光层析法、电化学分析法、原子吸收光谱法等， 并在层析技术的基础上发展了气相色谱( g c ) 并逐渐成为分析检测农药残留的主要手段，其检测 器的性能也不断完善，相继出现了电子辅获检测器( e c d ) 、火焰光度检测器( f p d ) 、热离子化检 测( t i d ) 等( 樊德方等，1 9 9 2 ) ，农药残留检测也因此得到了长足的发展，最小检出量一般可达 纳级，甚至皮级。虽然气相色谱现有的检测器可以广泛用于分析绝大多数类型的农药，( 如e c d 适用于分析有机氯农药，f p d 适用于有机磷农药等) ，但由于要求工作温度较高，又限制了一些在 高温下性质不太稳定的农药检测。相比之下，高效液相色谱( h p l c ) 要优越得多。h p l c 的操作温 度较低，特别适用于分析极性较强或热不稳定的农药。h p l c 分析有机物一般采用c 。或c b 的色谱 柱，以甲酵、乙腈等水溶性有机溶剂作流动相的反相色谱，选择紫外检测器、荧光或二极管阵列 检测器。与g c 相比，i i p l c 的流动相参与分离机制，其组成、比例和翊值可灵活调节，采用离子 对试剂，使之得到良好的分离。据统计，液相色谱可以分析的物质约占世界上已知化合物的8 0 以上内喷射式和粒子流式接口技术可将液相色谱与质谱连接起来，已成功地用于分析一些对热 不稳定、分子量较大、难以用气相色谱分析的化合物。且具有检测灵敏度高、选择性好、定性定 量同时进行、结果可靠等优点p j c o ，y ，e ta 1 2 0 0 0 ) 。如果对一种用于毛细管电泳的新型电喷射接 口加以改进使其适用与液质联用仪，将可大大提高分析灵敏度。另外，研究开发毛细管液相色谱 与离子捕获检测器的配合将会大大拓宽液相色谱用于高灵敏度分析的范围，虽然液质联用对分析 技术和仪器的要求高，但它是一种很有利用价值的高效率、高可靠性分析技术。对以上分析进行 总结，可以看出国外已将各种先进的分析化学方法应用于农药残留分析。我们国家在加入w t o 后， 也非常重视农药残留分析方法的开发，从下面的中文农药残留文献聚类分析可以看出一些趋势。 1 2 2 由文献聚类分析看各种分析方法在农药残留分析中的应用 主题词是对文献内容最准确、最简捷的揭示，高频主题词提示了某一时期的研究热点( 赵玉虹， 2 0 0 4 ：郑华川，2 0 0 2 ) ，透过主题词的聚类排序，可以剖析某一学科研究热点的规律( 崔雷，1 9 9 6 ； 侯跃芳，2 0 0 4 ) ) 。以下统计分析通过对中文农药残留文献主题词的分析来反映本学科的研究热点 和内在规律： 由文献统计可看出人们对食品安全的关注： 从清华大学的中国期刊网光盘数据库( 以下简称中刊库) 采集文献，以“农药残留”和“食 品安全一为检索词，检索出1 9 9 4 2 0 0 3 年中刊库收录的相关论文( 见表卜1 ) ，再以年代为横坐标， 文献数量为纵坐标得到文献分布曲线( 见图1 1 ) ，由曲线的走势可以看出：从1 9 9 年到2 0 0 3 年 检索词“农药残留”和“食品安全”的报道量在逐年增加。从2 0 0 0 年开始曲线斜率有较大的变 化，文献量增加迅猛，可以看出人们对食品安全和农药残留造成的食物污染给予越来越多的关注a 2 中国农业大学硕士论文文献综述 表i i 检索词为“农药残留”和“食品安全”的文献统计 圈卜1 挂素词为。农药残留。和。食品安全”的文献趋势周 围1 _ 2 。农药残譬”和。食品安全中文文献增长量髓年代变化趋势围 对“农药残留”高频主题词的分析 在中刊库中共检出以“农药残留”为主要叙词的论文1 2 2 7 篇：检得文献涉及主题词6 5 5 8 个：以 出现频次5 次及以上为标准，确定高频主题词1 9 6 个( 见附表1 ) ，对高频主题词表中数据进行分析， 可以得到几个与农药残留密切相关因素的排名顺序，见表1 2 ： 中国农业大学硕士论文文献综述 表i - 2 几个与农药残留相关主题的频扶统计 具体农产品种类水稻苹果黄瓜烟草人参大豆柑橘花生 出现频次 墙1 31 08766 6 由以上表格中可以看出不同农产品种类，农药种类，各种农药残留分析方法在文献中出现的 频次存在较明显的区别。在各种农药残留分析方法中色谱法占的比例最高，并以气相色谱法排名 第一，占到了各种色谱方法的6 3 ( 见图卜2 ) 。 圈i - 2 各种农药残留分析方法所占比例图 4 中国农业大学硕士论文 文献综述 由上图可以看出，虽然色质联用法在各种检测方法中的比例有增长的趋势，但比例仍然较小， 有待进一步发展。 与其它领域色谱分析方法文献的对比 为了将农药残留分析中用到的分析方法与其它领域中的分析方法做一对比，在中刊库中分别 输入俭索词“气相色谱”、“g c ”、“液相色谱”、“h p l c ”、“g c m s ”、“气质联机”、“l c m s ”， “液质联机”就可以得到各种分析方法随年代的分布情况( 见表卜3 和图卜3 ) 。 寰卜3 各种色谱分析方法瞳年代的分布情况 圈1 - 3 各种色谱分析方法分布情况 由表3 和图3 中可以看出：从1 9 9 4 年到2 0 0 3 年色谱分析方法文献报道数量在逐年增加，而且 液相色谱的增长最快。由1 9 9 4 2 0 0 3 总计数字来看，气相色谱，薄层色谱法，6 c - i d s ，l c - m s 文 献数量比例为5 1 ：3 2 ：9 ：7 ；1 ( 见图卜4 ) 。 中国农业大学硕士论文 文献综述 围卜4 几种色谱分析方法文献统计比例围 将图3 中的各种分析方法百分比例与图1 2 中的农药残留分析用色谱法比较，可以看出，气相 色谱，气质联机和液质联机在农药残留分析中应用的比例高于分析化学中的其它领域，存在较明 显的区别。 1 3 大环内酯类农药多杀菌素的研究概况 总体情况 多杀菌素s p i n o s a d 是在9 0 年代初期开发的一类大环内酯化合物( 陆自强，2 0 0 2 ) 。该类化合 物不仅有很高的生物活性，而且对非靶标生物的毒性很低，对人和其他哺乳动物非常安全。多杀菌 素从发现、确定生物活性到早期开发的整个过程历时1 2 年。产生该类化合物的土壤放线菌 s a c c h a r o p o l y s p o r s s p i n o s am e r t z & y a o 是美国礼来公司对大量的土样进行筛选后于1 9 8 5 年发现 的。到1 9 9 9 年多杀菌素已经在2 4 个国家、1 0 0 多种作物上进行了注册登记( t e s c a r i , 2 0 0 0 ； m i l e s , 2 0 0 0 ) 。 多杀菌素类化合物是野生型菌株s s p i n o s a 在培养介质中经有氧发酵而得的次级代谢产物 ( 李荣贵。2 0 0 3 ：苏建亚，2 0 0 3 ：吴红字，2 0 0 3 ) 。从结构上看，这些化合物属大环内酯类，分子内包 含一个独特的四核环系，并连结着两个不同的六元糖。四核环系由一个5 ，6 ，5 - 顺一反一反三环系统 稠合一个十二元大环内酯组成，一个n ，b 不饱和酮和个独立的双键嵌在四核环系中。四核环部 分在两个相反端分别由两个羟基取代，与其相连的两个六元糖其中一个是氨基糖f o r o s a m i n e ，另 一个是鼠李糖。在四核环系上有多个手性中心，这是全台成中的一个难点。在天然多杀菌素分离 提取物中，两个最高活性组份s p i n o s y na 和d 的混和物被称为s p i n o s a d ( 李妲，2 0 0 3 ) ，中文通用 名为多杀菌素，它是商业化产品的主要成分。另外，还有一些比例较小的组份。s p i n o s y n a 在乙醇一 水溶液中能够很好地结晶。由质谱和核磁以及单晶x 一射线衍射研究证实了有关c 9 、c 1 6 、c 1 7 和 c 2 1 的立体化学结构。两个取代糖一个为d 一( + ) 一f o r o s a m i n e ，另个为l - r h a m n o s e ( 鼠李糖) 。 6 多杀菌素的结构式如下： r 1 图1 - 5 多篆菌素厦其代谢物的分子结构式 f i g s t r u c t u r eo f s p i n o s a da n di t sm e t a b o l i t c s s p i n o s y nar i = n ( c h 3 h ，r 2 = h ，a n dr 3 = c h 3 s p i n o s y ndr a = n ( c h 3 h ，r 2 = c h 3 ，a n dr 3 = c h 3 s p i n o s y nbr i = n h ( c h 3 ) ，r 2 = h ，a n dr 3 = c h 3 s p i n o s y nd m s dr i = n i - i ( c h 3 ) ，r 2 = c h 3 ，a n dr 3 = c h 3 o r 3 多杀菌素为浅灰白色的固体结晶( d u t t o n , r ，2 0 0 3 ) ，带有一种类似于轻微陈腐泥土的气 味。在水溶液中p h 值为7 7 4 ，对金属和金属离子在2 8 d 内相对稳定，商业化产品的保质期为3 年。 多杀菌素在空气中不易挥发，蒸气压大约为1 3 1 0 1 0 p a ，在环境中通过多种途径组合的方式进 行降解，主要为光降解和微生物降解，最终变成碳、氢、氧、氮等自然组份。表卜4 概括了多杀菌 素a 和d 的一些物理、化学性质( t o s c a r i ，2 0 0 0 ) 。 裹1 - 4 多杀菌素a 和d 的物理与化学性质 在己知的害虫防治产品中，多杀菌素的作用机制非常新颖和独特( s a l g a d o ，v l ，1 9 9 8 ) 。实验 7 中国农业大学硕士论文文献综述 证明它对昆虫存在快速触杀和摄食毒性通过刺激昆虫的神经系统，导致非功能性的肌收缩、衰竭 并伴随颤抖和麻痹。这种作用结果和烟碱性乙酰胆碱受体被激活的结果是一致的。多杀菌素同时 也作用于y 一氨基丁酸受体，这有可能进一步提高其杀虫活性。如此的作用模式可谓独一无二。迄 今为止，尚未发现某类产品能以相同的作用方式影响昆虫的神经系统，而且尚无有关多杀菌素交 叉抗性的报道。从1 9 9 0 年开始，在全球范围内广泛开展了多杀菌素的各项试验。试验证明多杀菌 素能有效地控制鳞翅目、双翅目和缨翅目害虫，另外它还可以很好地防治鞘翅目和直翅目中某些 大量吞食叶片的害虫种类。文献中列举了一些多杀菌素产品标签上标明的可用以防治的害虫对象 ( c i s n e r o s j2 0 0 2 ；s c o t t , j g ，1 9 9 8 ；h a l l ，t s ，2 0 0 0 ) 。 多杀菌素具有高杀虫活性的同时，对捕食性昆虫还表现出较低毒性( m i c h a u d l p , 2 0 0 3 ； w i l l i a m s ，l ，2 0 0 3 ) ，对鳞翅目害虫而言，多杀菌素是已发现的杀虫剂中选择性最高的化合物之一 ( 潘登明，2 0 0 1 ：薛元海，2 0 0 2 ) 。已有数据表明。较之传统的氯氰菊酯，多杀菌素对一些重要的有 益昆虫都显示出较低的杀虫活性，而在防治鳞翅耳害虫时，多杀菌素和氯氰菊酯两者的活性强度 通常不相上下。多杀菌素的另一个优点是对哺乳动物和鸟类相对低毒，对水生动物也只是轻微的 中等毒性，此外，哺乳动物的慢性毒性试验表明，多杀菌素无致癌、致畸、致突变性或神经毒性。 文献总结了多杀菌素对哺乳动物、水生动物和鸟类的急性毒性数据( c l e v e l a n d 。c b ，2 0 0 1 ； t h o m p s o n , g , 1 9 9 9 ) 。 目前，多杀菌素商业化的品种有用于棉花的t r a c e r ，用于蔬菜类的菜喜( s u c c e s s ) ，以c o n s e r v e 和s p i n t o r 。我国目前使用的有用于蔬菜的菜喜。在美国，多杀菌素产品标签上标明可应用1 0 0 多种作物，同时它还在其他2 4 个国家进行了注册登记，并在全世界范围内为广 大农民所接受( j o n e s t ，2 0 0 2 ) 。 多杀菌素及其代谢物残留分析进展 目前用于多杀菌素及其代谢物残留分析的方法有i w l c 法、i i p l c m s 法和免疫法。 h p l c 法 本方法将样品用适宜的有机溶剂提取，经过周相萃取小柱( 硅胶小柱及环己烷小柱) 净化后 采用高效液相色谱分析。国外在如下几个方面进行了报道： 1 ) w e s t - s d 等人1 9 9 6 年报道了棉籽及相关产品中多杀菌素及其代谢物的残留分析( w e s t , s d ，1 9 9 6 ) ，将样品用6 0 正己烷4 0 丙酮提取，经过硅胶小柱净化后采用高效液相色谱分析，方 法的l o q 值为0 0 1 u 6 g ，l o d 值为0 0 0 3u g g 。在1 9 9 7 年时报道了土壤、沉淀物、水中多 杀菌素及其代谢物的分析( w e s t , s d ，1 9 9 7 ) 样品用6 0 m lm e o h 5 n a c i i n n a o h ( 6 5 ：2 7 ：8 ) 提 取，经过固相萃取小柱净化后采用高效液相色谱分析，对于土壤和沉淀物本方法的l o q 值为 o o l u g g 及l o d 值为o 0 0 3i l g ，g ；而对于水样l o q 值为0 0 0 l u g g 及l o d 值为0 0 0 0 3u g ，g ， 文中还谈到干燥剂对分析结果的影响，作者由于采用了不同厂家的无水n a 2 s 0 4 ，使s p i n o s y n a 和 d 的回收率相差了2 7 。为了验证方法的可靠性，作者选用了7 0 种常用农药考察对方法的干扰 性，结果证实此方法可以较好的排除其它农药的干扰。 2 ) l i t a i ny e h 等人在1 9 9 8 年报道了叶菜、辣椒、西红柿中多杀菌素及其代谢物的分析c y e h ， 8 中国农业大学硕士论文 文献综述 l ，1 9 9 7 ) ，作者采用c 1 8 小柱代替液液分配，分析了六种样品，方法的回收率为7 7 9 7 ，变 异系数为2 - 7 。通过对谱图的观察可以发现用c 1 8 小柱代替液液分配后，极性杂质成分对目标 物的干扰明显减少。 3 ) w e s t - s d ；t u m e r - l g 等人在1 9 9 8 年报道肉蛋奶中多杀菌素及其代谢物的分析( w e s t , s d ，1 9 9 8 ) ，试验中奶牛饲料中添加水平为0 、l 、3 、和1 0 u g g 并在2 8 天内监测了s p i n o s a d 的总 含量，母鸡饲料中添加量为0 、o 1 、0 3 、1 和5 u g g 在4 2 天内监测了s p i n o s a d 的总含量，最后 发现多杀菌素在脂肪组织中的残留量明显高于其它组织。对于鸡肉脂肪此方法的l o q 为0 0 2 u e c g 及l o d 为0 0 0 6u g g 对于其它鸡肉组织，牛肉组织，牛奶，奶昔，l o q 为0 0 1u g g 及l o d 为o 0 0 3u g g 。在0 0 0 3 1 0u g g 浓度范围内s p i n o s y na 的平均回收率为8 4 l1 4 s p i n o s y nd 的 为7 7 1 1 2 s p i n o s y n b 的为9 3 1 1 4 以及n - d e m e t h y l s p i n o s y n d 的为8 2 1 0 6 。 4 ) 在2 0 0 0 年时报道了柑橘树和相关产品中多杀菌素两种活性成分( s p i n o s y n s a 和d ) 及其代 谢物( s p i n o s y nb ，k ，a n dn - d e m e t h y l s p i n o s y nd ) 的残留分析( w e s t , s d ，2 0 0 0 ) ，对于干果肉和橘油， 方法的l o q 值为o 0 2u g c g 及l o d 值为0 0 0 6u g g ，对于其它材料( 全果，可食部分，果汁，和 果皮) 方法的l o q 值为0 0 1u g g 及l o d 为o 0 0 3u g g 。 h p l c m s 法 s c h w e d l e r - d a ；t h o m a s - a d 等报道l c l l s 的方法可用于那些采用h p l c - u v 方法很难分析的苜 蓿草、麦草、麦秸、高梁杆、玉米杆中多杀菌素及其代谢物的残留( s e h w e d l c r , d a 2 0 0 0 ；w e s t , s d ，2 0 0 0 ) ，此方法将样品用乙腈和水的混合液提取，c 。e 小柱及硅胶小柱净化后用l c m s 分析， 文中作者列出了多杀菌素及其各代谢物的质谱图，并根据谱图选出了每种化合物的特征离子，进 行了l c m s s i m 分析，本方法的平均回收率为6 9 9 6 ，变异系数为4 1 5 ，l o q 为0 0 1 u g g ，l o d 为0 0 0 3u g g ，同时此方法为一种多杀菌素残留分析最终确认方法。 免疫法 y o u n g - - d l ，m i h a l i a k - c h 等报道了磁性粒予免疫检测盒用于3 4 种食品和环境样品中多杀菌 素的检测( y o u n g , d l ，e ta 1 ，2 0 0 0 ；m a y e o e k , r c ，1 9 9 6 ；r u t h e r f o r d ，b s ，e ta 1 ，2 0 0 0 ) ，有些样品( 水 样、牛奶、沉淀物、牛肉组织) 采用适宜的溶剂提取后，不需进一步净化，添加稀释剂后便可以 检测。而对于另一些样品( 玉米面) 在免疫检测前需经过液液分配及固相萃取小柱净化。此方法 只能对多杀菌素总含量( 包括s p i n o s y n sa 、d 、b ，k ，和n 一甲基s p i n o s y nd ) 进行分析而 不能用于单独成分的检测，对于水样此方法的l o q 为0 0 0 0 1u g m l ，沉淀物为0 0 5u g g ，作物 和动物组织中为0 0 1 0u g g 。最后作者把免疫法与h p l c - u v 法在准确性和耗用时间方面进行了比 较：1 ) 将9 8 个样品分别用h p l c - u v 法和免疫法进行分析后比较二种方法的平行性。2 ) 作者指 出在采用h p l c - u v 法分析1 0 一1 5 个样品时需8 h 时间，而采用免疫法4 8 h 内可以分析2 5 个样品， 说明了此方法在操作时间方面的优势。 为保证分析的准确性和精确性，文中还提到了试验中的注意事项：1 ) 为了防止水样中 s p i n o s y n sa 和d 的降解，需添加一些稳定剂。2 ) 为防止三乙铵中的降解物对分析产生影响， 每瓶三乙铵的使用期不得超过三个月。3 ) 每一批环己烷小柱在使用前均需确定其洗脱性能4 ) 整 个操作过程中为了防止多杀菌素的光解，应尽可能避光操作。 9 中国农业大学硕士论文文献综述 对现有分析方法的总结 从以上讨论可以看出，可用于多杀菌素残留分析的方法有液相色谱法( h p l c - i j v ) 、l c m s 法 和免疫法，其中液相法和l c m s 法仍然处于发展的初始阶段，方法的前处理过程繁杂，耗用时间 长。免疫法具有高特异性和操作简便性，但只能用于多杀菌素总含量的分析而不能用于各单独组 分的分析。总之，从现有多杀菌素检畏6 方法来看，残留分析方法中仍然存在一系列的问题，要在 短时间内准确完成大批量样品的检测仍有困难，仍需发展简便、灵敏、高准确度的检测方法。 1 0 中国农业大学硕士论文多杀菌素及其代谢物残留测定方法的改进 第二章多杀菌素及其代谢物残留测定方法的改进( 液相色谱法) 2 1 仪器装置及试验材料 色谱议：l c i o a 系列色谱议及工作站 色谱柱：c m 柱、苯基柱、氰基柱 标准样的制备：四种标样分别由陶氏公司提供，纯度分别为：s p i n o s y na ( 8 6 3 ) ，s p i n o s y n d ( 9 4 o ) ，s p i n o s y nb ( 9 3 5 ) ，s p i n o s y nd m s d ( 9 7 4 ) ，精确称取以上四种化合物配成分别 为2 p p m 的混合标样，再进一步稀释成0 0 5 p p m ，0 i p p m ，i p p m ，2 p p m ，5 p p m ，l o p p m 的标准溶液 备用。 萃取小柱：w a t e r s 公司s p es i l i c a 小柱、s e p e l c o 公司s p es i l i c a 小柱及自填装的玻璃小柱。 旋转蒸发装置：德国b t l c h i 公司 甲醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷：h p l c 级 无水c u s o 、无水n a = s 0 4 、n a c i 、n a o h 、盐酸：分析纯 士样及棉籽样：采自湖南长沙地区。 2 2 试验方法 2 2 1液相色谱分析条件的优化 化合物在色谱柱上的分离是与化合物本身的性质，色谱填料性能和流动相等存在密切的联 系，本试验为了选择最佳的分离条件分别对流动相组成、流动相配比、色谱柱类型、样品溶解 用溶剂等进行了优化选择并绘制了标准曲线具体试验设计如下： 2 2 1 1 色谱柱的选择 根据文献中报道的分析多杀菌素的流动相及多杀菌素本身的物化性质，采用甲醇和水( 9 0 ： 1 0 ) 为流动相，分别比较了c ，。柱、苯基柱、氰基柱的分离效果并比较了四个化合物在不同色谱 ， 柱上的保留行为的差别。 2 21 2 流动相的选择 根据2 2 1 1 的试验结果，在采用c ”柱的情况下，实验中分别比较了流动相组成为甲醇和 乙酸铵溶液，甲醇和乙酸铵溶液组成的梯度洗脱系统乙腈和乙酸铵溶液，乙腈和乙酸铵溶液组 成的梯度洗脱系统，甲醇、乙腈和乙酸铵溶液时四个化合物的分离情况并通过比较对分离度的影 响，选出了最佳流动相组成，采用的各种流动相具体组成如下： 璺窒些查学硕士论文多杀菌素及其代谢物残留测定方法的改进 袭2 - 1 ，流动相组成 寰2 2 甲醇和乙酸技溶液组成的梯虞洗脱系统组成 衰2 - 3 乙蘑和乙稳铵溶液组成的梯虚洗脱系统组成 2 2 。1 3 样品溶解用溶剂的选择 在有关文献中报道，当流动相中含有较高比例的水相时。样品采用单纯有机溶剂溶解，会对 色谱峰起到展宽作用，使柱效降低，在本实验中分别将四种化合物用甲醇、乙腈、流动相等溶解 后，采用上述优化的色谱条件来分析，比较不同溶解样品用溶剂对理论塔板数的影响，理论塔板 数( n ) 采用下式( 1 ) 计算： 式中t r ：保留时间 w 半峰宽 n = 5 5 4 ( t i w 2 ( 1 ) 1 2 2 2 1 4 标准曲线的绘制 待色谱稳定后：对浓度为0 0 5 p p m ，0 1 p p m 1 p p m ，2 p p m ，5 p p m ，l o p p m 的混合标样进行检 测，绘制浓度一面积标准曲线。 2 2 2 样品前处理步骤的改进 2 2 2 1样品前处理过程中造成多杀菌素损失的主要来源 根据文献报道多杀菌素残留分析含有以下几个步骤： o 褫调节 o 加蝴节 o 用无水n a 2 s 0 4 干燥 过s p e 小柱 围2 1 多杀菌素残留分析步骤框图 中国农业大学硕士论文多杀菌素驶其代谢物残留测定方法的改进 用试剂按上述步骤做空白试验，并分别在在步骤处加入多杀菌素标准品，采用h p l c 测定找出影响回收率的因素。 2 2 2 2 样品前处理方法的改进 根据步骤2 2 2 1 的实验结果，分别设计了如下实验，优化前处理步骤： 萃取过程中调酸阶段参数优化 将目标物从样品中提取后，需调节整个系统的酸度，使s p i n o s a d 成份进入到水相中、杂质 类分配到有机相中，通过丢弃有机相来达到初步除杂的目的。文献中报道的数值互相之间存在较 大差异为了更充分地使s p i n o s a d 分配到水相中，在试验中将酸度分别调节为p i l l 4 、1 9 、 2 t 、2 7 、3 0 。测试其分配系数，由此来确定合适的p h 值范围。 萃取过程中调碱阶段参数优化 在萃取调酸后将上层的有机层弃掉，继续加入部分有机溶剂并加入n a o f l 水溶液调节水相为 碱性。使有效成份分配到有机相中，起到进一步除杂的作用。文献中只给出较宽的一个p h 值范 围，试验中通过调节n a 0 h 的加入量将系统p h 值设为9 5 ，1 0 5 ，1 1 - 5 ，1 2 0 ，1 2 5 ，测试其分 配系数，由此来确定合适的p h 值范围。 干燥剂对有效成分的吸附 在调碱后s p i n o s a d 将集中到有机相中然后采用无水n a u s o , 来去除有机相中少量水分国 外文献中报道了n a 2 s 0 。对s p i n o s a d 的吸附，在实验中我们也发现存在此问题，为此设计了确认 试验：将各类干燥剂放到三角漏斗中，准确加入1 0 u g 的混合标样，采用足量的淋洗剂淋洗后计 算干燥剂对s p i n o s a d 的吸附情况。 不同小柱净化效果的比较 样品液液分配处理后，经各种类型小柱净化，比较其除杂效果。采用的小柱有；w a t e r s 公 司的商品化s p es i l i c a 小柱、s e p u l c o 公司的s p es i l i c a 小柱、白填的硅胶小柱( 粒经分别为 1 0 0 2 0 0 目，2 0 0 3 0 0 目) 。 2 2 3 多杀菌素残留分析方法的建立 根据上述试验结果建立多杀菌素在土壤、棉籽和棉时中的残留分析方法，为了验证本方法的 准确性、专一性并找出最低检出限，分别设计了如下试验： 空白对照试验 采用改进的方法测定未添加标准品的空白土壤、棉籽和棉叶观察待测目标物保留时间处有 无杂质干扰，由此来判断方法的专一性。 添加回收率试验 向土壤、棉籽和棉叶样品中定量添加0 0 2 0 1 0m g k g 水平的多杀菌素各成份，采用改进的 方法测定后，计算添加回收率，验证方法的准确性。 1 4 中国农业大学硕士论文 多杀菌素及其代谢物残留测定方法的改进 最低检出限的确定 将多杀菌素标准品逐级稀释后采用h p l c 测定。与仪器的噪音进行比较，确定方法