（农业昆虫与害虫防治专业论文）bt毒蛋白cryiabac基因在毕赤酵母gs115中的表达研究.pdf

摘要 苏云金芽胞杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ) 是农业生产中运用得非常广泛的一种 重要的杀虫微生物。由于在使用过程中存在一些不足和害虫抗药性的产生，人们通 过生物技术的手段将b t 毒蛋白基因转入其它植物或微生物中，扩展了b t 的杀虫谱 并降低害虫对其的抗性。本研究将b t 毒蛋白基因c r y l 4 b m c 克隆到毕赤酵母g s l l 5 中，构建带有c r y l a b a c 基因的工程菌。 运用p r i m e r 5 软件设计带有限制性内切酶n o tl 和e c o ri 酶切位点的引物，通 过p c r 的方法扩增c r y l a b m c 基因带编码毒蛋白3 个结构域的1 8 k b 序列，并对这 两条基因片段进行了亚克隆，构建出载体p m d - c r y i a b m c 。将建载体p m d - c r y l a b a c 进行序列测定，其中c r y l a b 基因有2 个碱基发生改变，编码一个氨基酸发生改变， 但不编码毒蛋白的活性中心：c r y l a c 基因与原基因序列相同。选择毕赤酵母表达载 体p p i c 9 k ，利用限制性内切酶n o ti 和e c o ri 双酶切p m d - c r y l a b a c 和表达载体 p p i c g k ，再通过t 4 连接酶连接，构建出分泌型重组载体p p i c 9 k - c r y i a b a c 。用电 转化方法转化到毕赤酵母g s l l 5 ，筛选出阳性转化子。p c r 鉴定证明c r y i a b m c 基 因已成功转入毕赤酵母g s l l 5 中。 在甲醇的诱导下，刚6 阴c 毒蛋白都得到了有效分泌和表达。通过s d s p a g e 凝胶电泳分析，c r y l a b a c 基因表达的重组蛋白都在7 0 k d a 左右。当诱导p h 值为 6 6 时，摇瓶诱导发酵7 2 小时的蛋白表达量都达到最大。生物测定结果表明， c r y l a b m c 毒蛋白对甜菜夜蛾和二化螟都有较强的毒杀作用。c b 剃c 毒蛋白对甜菜 夜蛾的：5 0 为o 2 即咖l ，刚6 毒蛋白对甜菜夜蛾的l d s o 为o 7 6 z g m l ，c r y a b 毒蛋白对二化螟的“巯为0 删m l ，c r y l a c 毒蛋白对二化螟的u 为0 2 即g m l 。 关键词：苏云金芽胞杆菌，c r y i a b a c 基因，毕赤酵母，表达 a b s t r a c t b a c i l l u st h u r i n g i e n s i si sa ni m p o r t a n ta n dw i d e l yu s e dm i c r o o r g a n i s ma sm i c r o b i a l i n s e c t i c i d e si na g r i c u l t u r ep r o d u c t i o n b e c a u s et h e r ea r es e v e r a ld i s a d v a n t a g e sd u r i n gt h e a p p l i c a t i o na n dt h ed e v e l o p m e n to fi n s e c t i c i d er e s i s t a n c e , p e o p l eh a v et r i e dt ot r a n s f e rb t t o x i c p r o t e i ng e n e st op l a n t so ro t h e r sm i c r o o r g a n i s m st h r o u g hb i o t e c k n o l o g i c a lm e a n 8 t o e x p a n dt h er a n g eo fi n s e c t i c i d e sa n dd e c r e a s et h ep e s t - r e s i s t a n c et ot o x i cp r o t e i n i nt h i s s t u d y , c r y l a b m cw a sc l o n e da n dt r a n s f e r r e di n t op c h ap a s t o r i sg s l l 5a n dag e n e t i c m o d i f i e ds t r a i nw i t hc r y l a b a cw a sc o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l y p r i m e r sw i t hr e s t r i c t i o ne n z y m ec a t t i n gs i t er e c o g n i z e db yn o tia n de c o r1w e r e d e s i g n e dw i t ht h eh e l po fs o f t w a l en a m e dp r i m e r 5 ，c r y l a b a cg e n ea b o u t1 8 k be n c o d i n g t h r e es t r u c t u r ed o m a i no ft o x i cp r o t e i nw a sa m p l i f i e d b yp c ra n dt h et w og e n e f r a g m e n t sw e r es u b c l o n e dt oc o n s t r u c tt h ev e c t o rn a m e dp m d - c r y l a b a c t h ev e c t o r w a ss e q u e n c e da n dt h e r ea l e2b u s e sh a sc h a n g e di nc r y a bg e n ew h i c hc a t l 始t h ec h a n g e o fc o d i n gt oo n ea m i n oa c i db u tn o ta f f e c tt h e c o d i n go fa c t i v ec e n t e ro ft o x i c p r o t e i n , c r y a ch a v et h es a m es e q u e n c e 笛t h eo r i g i n a lo n e c h o o s ep p i c 9 k a se x p r e s s i o n v e c t o r , d i g e s t e dt h ep m d - c r y l a b a ca n de x p r e s s i o nv e c t o rp p i c 9 kw i t he c o ria n dn o t i ， a n d r e j o i n w i t ht 4 l i g a s e t oc o n s t r u c ta s e c r e t o r y r e c o m b i n a n tv e c t o r p p i c 9 k - c r y l a b a c t r a n s f e r e dt op i c h i ap a s t o r i sg s l l 5b ye l e c t r o t r a n s f o r m a t i o n ，t h e p o s i t i v et r a n s f o r m a n t sw e l es e l e c t e d p c rr e s u l tp r o v e dt h ec r y l a b a cg e n eh a sb e e n t r a n s f e r r e di n t op i c h i ap a s t o r i sg s l l 5 s u c c e s s f u l l y w i t ht h ei n d u c t i o no fm e t h a n o l , c r y l a b m ct o x i cp r o t e i nh a sb e e ne f f e c t i v e l y s e c r e t e da n de x p r e s s e d b ys d s p a g eg e le l e c t r o p h o r e s i sa n a l y s i s ，a l lt h em o l e c u l a r w e i g h to fr e c o m b i n a n tp r o t e i ne x p r e s s e db yc r y l a b a cg e n ea 托a r o u n d7 0 k d a t h e i n d u c e dp r o t e i ne x p r e s s i o ni sa tt h eh i 曲e s tl e v e li nf e r m e n t a t i o nf l a s kf o r7 2h o u r sa tp h 6 6 b i o a s s a yr e s u l t ss h o w e dt h a tt h et o x i cp r o t e i nc o d e db yc r y l a b a ch a sas 仃o n gt o x i c e f f e c tt ob o t hs p o d o p t e r ue x i g u ea n d 劬f f ds u p p r e s s a l i s 如oo fc r y l a ct o x i cp r o t e i n t h es p o d o p t e r ue x i g u ei s0 2 8 h g m 1 c r y l a bt o x i cp r o t e i no nt h es p o d o p t e r ue x i g u ei s 0 7 6 t g m 1 t h el c 5 0o fc r y i a bt o x i cp r o t e i no nt h ec 新f ds u p p r e s s a l i si s0 4 0m n “，t h e l c 5 0o fc r y l a ct o x i cp r o t e i no nc h i l os u p p r e s s a l i si so 2 8 # g m 1 k e yw o r d s ：b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s c r y l a b a c p i c h i a p a s t o r i s e x p r e s s i o n 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 如需保密，解密时问年月 日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下述行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：1 调荀 时陬 0 6 - 7 年月谚日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存汇 编学位论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论 文的全部或部分内容 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书 学位论文储始桶导师签二：貔- 锵 签名日期：嘭叩年月膨日签名日期：伽年6 月，8 日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之问 第一部分前言 1 苏云金芽胞杆菌( b a c i l 胁st h u r i n g i e n s i s ) 研究进展 1 9 0 9 年，日本病毒学家i s h i w a t a 在感病的蚕蛾中发现了一种致病菌( i s h i w a t a ， 1 9 0 1 ) ，但当时没有保存下来。1 9 0 9 年，b e r l i n c r 从德国苏云金省的地中海粉螟上又 重新分离到了这种致病菌，并正式命名为苏云金芽胞杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ， 简称矾) 。苏云金芽胞杆菌是一种杆状的格兰氏阳性细菌。能形成内生芽胞，广泛 存在于各种生态环境中。在形成芽胞的同时能够形成一种伴胞晶体，其中含有一种 或几种杀虫晶体蛋白( i n s e c t i c i d a lc r y s t a lp r o t e i n s ，简称i c t s ) ，即d - 内毒素。自从 首次分离得到苏云金杆菌以来，在世界范围内已分离到超过4 0 0 0 0 个菌株。对其杀 虫谱的了解，由最初的对鳞翅目的毒性逐渐扩展到双翅目、鞘翅目、直翅目等9 个 目的昆虫，同时还发现有些菌株对扁形动物门、线形动物门、原生动物门中的某些 有害种类有毒杀作用。由于其具有高效性和安全性，b t 制剂在农产品安全性和农业 生态环境的保护上具有重要意义，已发展成为目前世界上应用最为广泛的微生物杀 虫剂。 1 1 苏云金芽胞杆菌晶体毒蛋白的分类 自从1 9 8 1 年w h i t e l e y 等人从库斯塔克亚种l i d 1 菌株中克隆出第一个苏云金 芽胞杆菌的杀虫晶体蛋白基因c r y l a a l 以来，每年都有大量的新i c t s 基因被分离 和克隆，2 0 0 2 年已增至2 3 0 余种。1 9 8 9 年h o f l e 和w h i t e l e y 根据基因的杀虫活性 和同源性，将当时克隆的4 2 种基因分为5 群1 4 类：c r y i 、c r y l i 、c r y i l l 、c r y i v 、 c y t 。其中c r y l 对鳞翅目、c r y l l 对鳞翅目和双翅目、c r y m 对鞘翅目、c r y l v 对双 翅目、c y t 对双翅目有杀虫活性。1 9 9 5 年，c r i c k m o r e 等在无脊椎动物病理学年会 ( s 口) 上首次提出、并于1 9 9 8 年发表了一个新的c r y 杀虫晶体蛋白的分类方法。 这种分类方法是根据氨基酸同源性，而不是根据d - 内毒素氨基酸序列的同源性将 i c p s 进行分级分类，因而形成了一个开放式的分类系统：同源性在4 5 以下为第一 等级，用阿拉伯数字表示；同源性在4 5 7 8 之间为第二等级，用大写英文字母 表示；同源性在7 8 9 5 之间为第三等级，用小写英文字母表示，同源在9 5 以 上为第四等级，用阿拉伯数字表示。只要满足来自b t 的伴胞晶体，对目标生物具 有毒性，或者与已知的c r y 或c y t 蛋白具有高同源性，就可以纳入这一分类系统。 目前，已发现2 9 9 种杀虫晶体蛋白基因，分属于4 4 群( c r y 基因4 2 群，c y t 基因2 群) ，1 3 6 种模式基因( 图1 ，图2 ) 。 l 2 4铲 晕 。忙 i l l - 广匕三 ， _ 1 r e 一 厂 _d ” 一 r 1 慕一 一 u li r 1 1 叫 。 m t x - 涨e b i n 舶 i o 3 6铲 c i c n u ij 一 l i o l 叫 厂一一 e g i 一 j e ： l q l i 一 一 ，一j “ l 一1 w o 一 l c 1 j 一一t ： i li l li e ￥ 图2 ：苏云金芽胞杆菌其它c r y 蛋白树状分类图 f i g 2p h y l o g r a md e m o n s t r a t i o na n l i n oa c i ds e q u e n c ei d e n t i t ya m o n go t h e rc r yp r o t e i n s f r o m b a c i l l u st r n g e n a s ( h t t v ：w w w b i o l s s u s x a c u k h o m e n e i l c r i c k m o r e b t ) 1 2 苏云金芽胞杆菌晶体毒蛋白的结构、功能及作用机理 目前研究最多的是c 匆1 的晶体蛋白，它们由1 1 0 0 1 2 0 0 个氨基酸组成，分子 量为1 3 0 - 1 4 0 k d a 。c r y l 晶体蛋白的c 端具有高度的保守性，同源性大于9 0 ；n 3 端差异较大，同源性只有4 0 9 0 。这两部分具有明显不同的结构和功能，前者 为亲水部分，为b 折叠结构，主要用于维持伴胞晶体的形成；后者主要是疏水性部 分，由5 个保守的区段组成，形成m 螺旋结构，是晶体蛋白维持毒力和作用专一性 所必需的功能区域。 利用煳，射晶体图谱的方法已经确定了c r y l a a 、c y t 2 a 、c r y 3 a 三种基因所编 码的毒蛋白多肽的三维结构( 图3 ) 。c r y l a a 、c r y 3 a 基因编码的毒蛋白由3 个结构 域( d o m a i n ) 组成，而c y t 2 a 编码的毒蛋白只有一个结构域( d o m a i n ) ，含两+ 9 1 - 缘的螺旋和甜螺旋包裹着的内层一个b 折叠。这三种多肽结构非常相似( f l o r e s 甜 a l ，1 9 9 7 ) 。c r y l a a 、q y 3 a 毒蛋白的d o m a i ni 位于活性c r y 蛋白的n 端，含7 个 反向平行的a 螺旋。它的长的疏水和亲水脂螺旋可能参与昆虫中肠上皮溶细胞孔洞的 形成。d o m a i n l i 含有3 个反向平行的仔折叠，排列成所谓的p 棱柱折叠( e s m d ae t a l ， 1 9 9 4 ) ，形成一种典型的“g r e e kk e y ”结构。通过定点诱变与片段互换研究表明， d o m a i ni i 可能参与起始与受体结合( j n r a t - f u e n t e so ta l ，2 0 0 1 ) 。d o m a i ni r 含2 个反向平行的p ，折叠，形成一种紧裹在一起的“p 三明治”结构，将g 末端包裹在 里面。这种“b 三明治”结构可以维持毒蛋白分子三维结构的完整性。许多研究也表 明，6 “三明治”结构能够参与受体结合( b u r t o n 日ta l ，1 9 9 9 ) ，并且具有膜穿透 和形成离子通道功能。 图3 ：c f y i a a 、c r y 3 a 、q r t 2 a 的三维结构图 f i g 3t h et h r e e d i m e n s i o n a ls t r u g t n r c so fc r y i a a , c r y 3 a , c y t 2 a p r o t e i n s 伴胞晶体是在苏云金芽胞杆菌形成芽胞的同时产生的，当敏感的鳞翅目昆虫摄 取芽孢后，伴胞晶体伴随着进入昆虫的中肠，原毒素经过昆虫中肠蛋白酶的溶解和 激活作用，释放出具有杀虫活性的多肽。c r y l a 类原毒素在昆虫中肠首先被酶解为 4 6 5 k d a 的毒素，然后进一步酶解为5 5 k d a 6 5 k d a 的毒素核心。具有杀虫活性的多 肽作用于中肠上皮细胞，引起该细胞膨胀和裂解，最终导致昆虫肠道麻痹、穿孔， 昆虫停止进食直到死亡。 研究表明，晶体蛋白与昆虫中肠细胞上的受体的亲和性决定苏云金芽孢杆菌的 杀虫特异性，即活性毒蛋白与中肠上皮细胞膜( 刷状缘膜囊泡b r u s h b o r d e rm e m b r a n e v e s i c l e s ，b b m v ) 具有高度特异性结合( w o l f e r s b e r g e re ta l ，1 9 8 7 ) 。活性多肽具 有与受体结合和形成离子通道两种功能。它与中肠的b b m v 中的受体结合分为两 步：第一步是可逆结合，第二步是不可逆结合，不可逆结合使毒蛋白与受体紧密结 合并进入上皮膜。一种毒素在同一种昆虫中可以有不止一个结合住点，而不同的毒 素也可以结合共同的结合位点。c d i 和c r y 3 a 类毒素直接结合在敏感昆虫中肠柱 状细胞顶端的微绒毛上，c r y 3 a a 和c y t 3 a a 在蚊子体内的结合位点定位在中场后半 段的某些特定区域。当毒蛋白与受体发生不可逆结合，毒蛋白快速插入细胞质膜， 形成孔或灶，破坏钾、钠离子通道，使钾的运输和a t p 合成中断，细胞膜传递受到 干扰，并引起膜的去极性化i 钾的运输和a t p 合成被中断，离子平衡和矿浓度梯 度遭到破坏，导致细胞渗透裂解，中肠崩溃，最终导致昆虫死亡。 1 3 苏云金芽胞杆菌的抗性对策研究 自从1 9 3 8 年法国生产出第一个b t 商品制剂s p o r e i n e ，成功应用于地中海粉螟 的防治以来，b t 杀虫剂被广泛的推广和应用。但是在长期的使用过程中发现，b t 杀虫剂存在着以下缺点：杀虫谱较窄，毒力残效期短，靶标害虫容易产生抗性。对 于b t 杀虫剂存在的这些缺陷，国内外进行了广泛的研究。 1 3 1 抗性管理研究 由于不同的i c p s 在中肠中有不同的结合位点，它们之问又具有很好的协同作 用，因此将不同的i c p s 混合使用或轮换使用，既能增强毒性，又扩大了杀虫谱， 还有利于延缓靶标害虫的抗性产生。由于b t 的杀虫速度较慢，利用b t 与其它生物 或化学农药对害虫的不同的作用机制，将r 与其它农药混合使用，增强了防治效 果，降低了化学农药的使用量，也减缓了昆虫对b t 和其它农药的抗性的产生( 金 建猛等，2 0 0 6 ) 。 5 1 3 2 转基因植物和工程菌的构建 基于b t 毒蛋白的安全性，高效性以及良好的生态效应，将m 基因转入植物和 其他有益微生物，构建高效的抗虫植物和杀虫工程菌成为目前的研究热点。 将b t 毒蛋白基因转入植物促生微生物中，构建的转基因工程菌对植物既有促 生作用，又延长了b t 毒蛋白的持效性，扩大了杀虫谱。国际作物遗传所的研究人 员将b t 杀虫基因借助苏云金杆菌i - i d 7 3 的d 内毒素基因的嵌合质粒p c g 6 1 0 整合 到一种革兰氏阳性细菌的染色体上，构建的工程菌被证实对环境的安全性( t u r n e r p f a j ，1 9 9 1 ) 。刘云霞等人将b t 1 内毒素基因转入巨大芽胞杆菌，构建出的工程菌 具有较强的杀虫活性，并且杀虫晶体蛋白的表达可以不通过芽胞的萌发。o b u k o w i c z 利用转座子t n 5 将毒蛋白基因整合到荧光假单胞菌( p s e u d o m o n a s 砌鲫b 虻臼坫) 的染色体上，表达出了毒蛋白。中国农业科学院植保所构建的杀虫遗传工程荧光假 单胞菌i p p 2 0 2 不但具有杀虫活性，还具有防治作物黄萎病和枯萎病的功能。 1 9 8 1 年，s c h n e p f 等人首次成功地克隆了第一个编码b t 杀虫晶体蛋白基因， 揭开了利用基因工程培育抗虫植物的序幕。1 9 8 7 年，v a e c k 等人将c r y l a b 基因和 n p ti i 基因进行融合，得到的转基因烟草( n i c o t i a n at a b a c u m ) ，并检测到了微弱 的抗虫性。早期的转基因植物所使用的b t 基因未经过任何改造，因此在植物中表 达量相当低。1 9 9 0 年p e r l a k 等将改造的b t 毒蛋白基因导入植株，获得的转基因植 株中晶体蛋白表达量提高了5 0 - - 一1 0 0 倍，抗虫能力达7 0 以上( p e r l a ke t a l ，1 9 9 0 ： d o m e sa ta l ，1 9 9 6 ) 。我国的转基因植物育种是在2 0 世纪8 0 年代后期，在“8 6 3 ” 高技术计划资助下开始的。科技部、财政部于1 9 9 9 年联合启动了“国家转基因植 物研究与产业化专项”更促进了我国转基因植物研究和产业化的飞速发展。1 9 9 1 年， 田颖川等人将b h d 一1 的s 一内毒素借助t i 质粒导入烟草、甘蓝中获得转化植株，抗 烟草夜蛾能力达到4 0 5 0 。1 9 9 2 年，郭三堆等在国内首先人工合成了全长1 8 2 4 b p 的c r y l a b 和c r y l a c 融合的g f mc r y l a 基因，拥有了自己的知识产权。丁群星等人 用子房注射法将经修饰后的c r y l a c 基因导入玉米，抗玉米螟的能力达8 6 6 6 。王 国英等( 1 9 9 5 年) 利用基因枪轰击玉米胚愈伤性组织和幼胚、张宏等用超声波处理玉 米愈伤组织、用玻璃微针注射授粉后的玉米子房等方法均己经成功获得了转化b t 基因的玉米植株。1 9 9 8 年倪万潮等人工全序列合成了b t 杀虫蛋白基因，并用花粉 管介导法导入棉花，获得高抗棉铃虫的转b t 抗虫棉花。崔金杰和夏敬源、张永军 6 等还研究了转b t 基因棉对棉铃虫抗性的时空动态，总结了转b t 基因棉的生长、发 育、抗虫的持续性等规律。到目前为止，已成功将b t 毒蛋白基因转入番茄、小麦、 水稻、花生、烟草、胡桃、杨树等植物。转b t 基因的玉米、棉花、马铃薯已商品 化并在多个国家获得批准。 1 3 3 融合基因的构建 利用b t 基因与其它基因的融合，可以增强b t 毒素的毒力，扩大杀虫谱，减缓 害虫抗性的产生。b t 融合基因的构建主要有两类，一类是b t 基因之间的基因融合， 另一类是与其它具有杀虫功能的基因融合。h o n e e 等人在1 9 9 0 年用分别属于c r y l a b 和c r y l c 的两个基因b t v i 和b t l i 构建了一个融合基因。1 9 9 4 年b o s c h 等人将c r y l c 与c r y l e 基因进行融合，表达出与c r y l c 蛋白有不同受体的毒蛋白。利用这种融合 蛋白代替c r y l c 毒蛋白就能克服害虫对c r y l c 毒蛋白的抗性。b t 基因与其它杀虫 基因的融合中以与豇豆胰蛋白酶抑制剂基因研究得最为广泛，目前已将c r y l a 基因 与修饰过的c p t i 基因融合并转入中棉1 9 号、3 5 7 1 、5 4 1 、石运3 2 1 中，获得了双 价转基因抗虫棉株系( 郭三堆等，1 9 9 9 ) 。b t 基因与g n a 、蜘蛛杀虫肽、蓖麻毒素 基因等的融合也获得了广泛的研究。 通过定点突变也是增强b t 毒蛋白毒力、扩大杀虫谱的有效手段。在对d o m a i n i 的突变研究中，通过对d o m a i ni 的r 2 0 4 进行突变，c r y 4 b 杀蚊活性提高了3 倍 ( l o a m b e n te ta l ，1 9 9 2 ) 。在对d o m a i ni i 的突变研究中，将c r y 3 a 的l o o p 3 突变 成a a a a a a ，对黄粉( t e n e b r i om o l i t o r ) 的杀虫活性提高了2 4 倍( w u 等，1 9 9 6 年) 。 在对d o m a i ni i i 的突变研究中，m a a g d 等人将c r y l b a 基因的d o m a i ni h 序列采用 c r y l c a 基因的d o m a i nh i 序列进行置换突变，对烟草天蛾( m s e x t a ) 的毒力增加 了2 2 倍。 2 巴斯德毕赤酵母( p i c h i ap a s t o r i s ) 表达系统简介 自从1 9 8 7 年c r e g g 等首次利用巴斯德毕赤酵母作为宿主表达外源蛋白已有2 0 年。作为一种新型的高效表达系统，毕赤酵母越来越受到人们的重视。 7 2 1 巴斯德毕赤酵母( p i c h i ap a s t o r i s ) 表达系统的优点 作为一类能以甲醇为唯一碳源和能源来源的酵母菌，和其它真核、原核表达系 统相比，具有许多优点： 外源蛋白表达量高。具有强有力的乙醇氧化酶基因( a o x l ) 启动子，可严格 调控外源蛋白的表达。甲醇代谢所需的醇氧化酶被分选到过氧化物酶体 ( p e r o x i s o m e ) 中，形成区域化，当以甲醇作为唯一碳源时，过氧化物酶体几乎占 到整个细胞体积的8 0 ，a o x 增至细胞总蛋白的3 5 - 4 0 。因此，在a o x 基因 前利用同源重组方式插入外源蛋白基因时可以获得大量表达。目前常用的表达系统 一般表达水平在毫克级，其表达量比其他系统高1 0 倍甚至1 0 0 倍( 华慧等，2 0 0 3 ) ， 有些外源蛋白的表达量甚至可达到克每升以上水平，如破伤风毒素c 片段的蛋白表 达量可达1 2 9 i n ，明胶的表达量可达1 4 8 9 l ，h e v a b r a s i l i e n s i s 羟请睛裂合酶的表达 水平可达2 2 9 i n 。 稳定性高。由于毕赤酵母无内源型载体，一般外源目的基因通过携带它的外源 型载体经同源重组整合到宿主染色体上，随染色体复制而复制，实现对目的蛋白的 表达，这种整合型表达比内源性质粒表达稳定性高，有文献报道重组表达系统连续 培养5 0 代，甚至1 0 0 代( c l a r ee ta l ，1 9 9 1 ) 外源基因也不易丢失。 分泌性能。毕赤酵母表达产物有胞内表达和胞外分泌型表达两种方式。胞内表 达型较胞外分泌表达型表达产物水平高，但产物纯化较为复杂。对于胞外分泌表达 型，由于毕赤酵母自身分泌的蛋白非常少，因此非常有利于目的蛋白的纯化。如表 达的重组水蛭素( h i r ) ，仅经过两步层析纯化，纯度就高达9 7 以上。 蛋白质的翻译后修饰。外源蛋白在分泌过程中，进行糖基化、磷酸化、信号序 列加工、二硫键的形成以及正确的折叠等翻译后加工，使分泌蛋白更接近于天然蛋 白构象和活性。 高密度发酵培养。毕赤酵母在甲醇诱导下能进行大体积高密度发酵培养。已有 利用比毕赤酵母大规模工业化高密度生产的发酵工艺，细胞干重可达1 0 0 9 l 以上。 利用毕赤酵母进行工业发酵，培养基不含蛋白，较廉价。且细胞生长速度快， 便于工业化生产。 糖基化程度低。毕赤酵母加到翻译蛋白上的糖链长度平均每条侧链为8 1 4 个 甘露糖残基，较之酿酒酵母每条侧链平均5 0 1 5 0 甘露糖残基短得多。此外，酿酒酵 8 母核心多糖末端存在c x - 1 ，3 糖苷键，而毕赤酵母没有。一般认为酿酒酵母中糖蛋白 的c t - 1 ，3 糖苷键使得这些蛋白具有高度的抗原性，因而毕赤酵母更适合治疗用途。 2 2 影响毕赤酵母( p i c h i ap a s t o r i s ) 中外源蛋白表达的因素及优化策略 毕赤酵母对于不同的外源蛋白，表达量不同。虽然有许多蛋白可高效表达，甚 至达到每升克以上水平，但仍有一些蛋白表达量相对较低。如b - e r y p t o g e i n 的表达 量约为1 5 m g l ，而a f i 在摇瓶中表达时最高水平也不超过5 m e , l 。一方面，外源 基因序列本身的内在特性影响蛋白的表达；另一方面，表达条件对表达量高低的影 响也极其显著。如何尽可能提高表达水平、降低成本，在工业化生产上至关重要。 2 2 1 外源基因序列的内在特性 2 2 1 1m 麟7 端非翻译区( 5 - u t r ) 5 - u t r 的核苷酸序列和长度影响外源基因的表达。适当长度的5 非翻译区可 极大地促进了m r n a 有效地翻译。u t r 太长或太短都会造成核糖体4 0s 亚单位识 别的障碍。通过维持外源基因m r n a 5 - l y r r 尽可能和a o x l m r n a 5 - u t r 相似， 并且最好是保持两者一致，可以获得最佳蛋白表达量。y a m a d am 等通过使人血清 白蛋白( h s a ) 和a o x im r n a 5 - u t r 一致，使l i s a 的表达量提高了约5 0 倍。另外 5 - u t r 中应避免a u g 序列以确保m r n a 从实际翻译起始位点开始翻译。 2 2 1 2a + t 组成 a 仃含量高的基因在毕赤酵母中表达时有时会造成转录提前终止。共有序列 蛆1 = f 叮兀觚aaa 就是一个转录提前终止信号。如在表达人免疫缺损病毒( h r v 3 包膜 糖蛋白g p l 2 0 时。这个信号造成了g p l 2 0 的转录提前终止。另外在衄丰富区还可能 存在一些没有确定的转录提前终止信号。因此对a t 含量丰富的基因，最好是重新设 计序列，使其a + t 含量控制在一个理想的范围内。生产破伤风毒素c 片段时用这种 方法就能得到高效表达( c l a r ep fa l ，1 9 9 9 ) 。 2 2 1 3 密码子的使用频率 在酵母中表达量较高的基因往往采用的是酵母所偏爱的密码子。研究表明，在所 有的6 1 个密码子中有2 5 个是酵母所偏爱的( h o e k e m ae ta l ，1 9 8 7 ) 。高效表达的 基因几乎毫无例外地使用这2 5 个偏好密码子。在用毕赤酵母表达植酸酶时，把在酵 9 母中使用频率为零的精氨酸密码子( c g g ，c g a ) 突变为使用频率较高的密码子 ( a g a ) ，表达水平提高了3 7 倍( 姚斌等，1 9 9 8 ) 。 2 2 2 表达条件 2 2 2 1 载体的选择 在用毕赤酵母表达异源蛋白时，既可选择胞内表达型载体，又可选择分泌表达 型载体。一般优先考虑分泌型载体，因为这样有利于分泌蛋白的分离纯化。对于非 分泌蛋白，使它们分泌是困难的，甚至是不可能的。同样地，对于那些正常分泌蛋白，几 乎不可能以可溶的形式在胞内表达。如h i v g p l 2 0 本为分泌形式的糖蛋白，在胞内表 达时几乎完全不溶。毕赤酵母分泌型表达载体上存在信号肽，可引导外源蛋白的分 泌。最常用的信号肽为n 因子信号肷和酸性磷酸酶信号肽。一般说来，a 因子信号肽 较之酸性磷酸酶信号肽有更多成功的报道，l a r o c h e 证明采用含k e x 2 酶切割位点 的融合酸性磷酸酶信号肽，可导致t a p 高水平的分泌。另一方面，在表达7 a n a g a l 时，使用这两种信号肽在表达水平、分泌效率和酶活性方面并无不同。 2 0 2 2 菌株的表型 外源基因转化毕赤酵母后，能够整合到染色体上。两种整合方式会导致转化子的 两种表型。插入整合型即整合后a o x l 基因是完整的，没有被破坏掉。这样转化子 代谢甲醇的能力正常，能在甲醇培养基上正常生长，这种表型称为m u t + ；替换整合型 即整合后外源基因取代了受体菌染色体上的a o x i 基因，造成a o x l 基因的丢失。 这样转化子代谢甲醇能力很弱，在甲醇培养基上生长很慢，这种表型称为m u 忸。对于 胞内表达蛋白，优先考虑用m u t s 表型。因为它们有一个低水平的乙醇氧化酶蛋白， 表达的蛋白更容易纯化；对于分泌表达，则m u t + 和m u t s 都可使用。在分泌h s a 时， 二者并无明显差别。但在高生物量的发酵中，m u t + 生长更快，较之m u t s 对于提高外 源蛋白的产率更有效。 2 2 2 3 基因拷贝数 一般情况下，毕赤酵母中外源基因整合的拷贝数愈高，则蛋白表达量愈大。如在 表达明胶、破伤风肠毒素c 片段，鼠麦皮生长因子( m e g f ) 等时，多拷贝产生非常 高的表达量。然而在有些情况下，单一的拷贝数已足够达到最佳的表达量，有意增加 拷贝数对产量并没有什么效果。在极少数情况下，拷贝数的增加反而会导致蛋白产 量的下降。 1 0 2 2 2 a 培养条件 在进行毕赤酵母诱导培养时，外源基因的表达受到培养基、温度、p h 值、通 气量、甲醇添加速率、诱导前细胞浓度等多方面因素影响。 多种培养基，如b m g y b m m y ，b m g b m m ，m g y m m 等都可用来诱导外源 蛋白的表达。b m g y b m m y , b m g b m m 培养基成分中含有缓冲液，常用来表达分泌 蛋白，可在一个广泛范围内获得最佳的蛋白产量。在表达m e g f 时最终的表达量强 烈地依赖于培养基的组成：在含酵母膏和蛋白胨的培养基中单拷贝转化子表达量为 o 。0 2 9 9 m g ，但在不含酵母膏和蛋白胨的基本培养基中表达量低至 o o m m g m g 。在 进行诱导培养时，培养温度最好不要超过3 0 。充足的通气量对于诱导阶段外源蛋 白的表达是极其重要的。实验中采取多种措施来增加通气量：如培养基体积不超过 摇瓶体积1 0 一3 0 ，把摇瓶斜置于摇床上，提高摇床转速，不用棉塞而只用几层 纱布等等。毕赤酵母在p h 3 0 7 0 的条件下都能生长，但对于对蛋白酶敏感的外源 蛋白，可通过调节培养基的p h 值来抑制蛋白酶的活性，使外源蛋白获得一个较理 想的表达量。如在表达rh i r 时，p h 值降至3 ，可抑制蛋白酶作用。此外在培养基中 添加1 酪氨酸蛋白水解物也可减弱蛋白降解作用。在表达ra m y 2 时，由于培养 基中添加了此种物质而极大地降低了蛋白的降解，提高了产量。诱导期间培养基中每 天应补加甲醇，一般每天添加到培养基中的甲醇含量为培养基体积的o 5 1 。但 在表达g a 时，甲醇含量为0 7 5 时，表达量最高。由于m u t + 代谢甲醇能力强，比m u t s 更能耐受甲醇的毒害，有些研究者对于m u t + 每天添加甲醇到3 ，对于m u t s 每天加到 1 而没有什么不良影响。毕赤酵母外源蛋白的表达分为两个阶段。首先是在含甘油 的培养基中生长茵体，达到一定的o d 值后将菌体转移至以甲醇为碳源的培养基中 进行外源蛋白的诱导表达。通常甘油培养基中菌体的o d 值达到2 6 时转入甲醇 培养基开始诱导。并非所有外源蛋白的表达都遵循这一原则，如表达g a 时诱导前 o d 值为2 5 ，表达h i l 1 7 时诱导前o d 值为1 5 ，表达c t s e 时诱导前o d 值为1 5 2 0 ，表达t r i g l y c e r i d el i p a s e 时诱导前o d 值为6 1 0 。理论上来说，o d 值越高，生 物量越大，则总的表达量也越大。但高的o d 值使氧气和营养供给受到限制。较 之摇瓶发酵，发酵罐发酵在培养条件上更容易得到优化，因此发酵罐发酵能获得更 高的外源蛋白的表达。 1 1 1 实验材料 1 1 菌株与质粒 第二部分实验部分 大肠杆菌( e c o l i ) d i - 1 5 c x 、巴斯德毕赤酵母( p i c h i a p a s t o r s ) g s l l 5 ( h i s ，m a t 3 和p p i c 9 k 质粒由赵述淼博士、胡南博士( 同名) 提供，p u c l 8 - c r y l a b a c 质粒由作物 遗传改良国家重点实验室提供，p m d - 1 8 t 载体购于t a k a r a 公司。 1 2 供试昆虫 1 龄甜菜夜蛾幼虫( 跏d 如啪fe x i g u e ) 由农药室提供 2 龄二化螟幼虫( c h i l os u p p r e s s a l i s ) 由本实验室饲养 1 3 酶与试剂 n o t l , e c o r i , d r ai 、t 4 d n a l i g 鹞e 购于t a k a r a 公司，i p t g 、x - g a l 购于p r o m e g a 公司 1 4 培养基及储备液 1 a 1 培养基 l b 培养基 胰蛋白胨 酵母提取物 n a c l p h 7 0 s o b 培养基 1 0 0 5 1 o 胰蛋白胨2 0 酵母提取物0 5 n a c l 0 0 5 0 2 5 m o l i 翮 1 使用前加入2 m o l l m g c l 2 。0 5 ，p h 自然 s o c 培养基 s o b ：暗养基+ l m o l l 葡萄糖2 o ，p h 自然 y p d 培养基 胰蛋白胨 酵母提取物 葡萄糖 p r i 自然 m d 培养基 y l q b 葡萄糖。 生物素 琼脂粉 p u 自然 b m g y 培养基 胰蛋白胨 酵母提取物 磷酸缓冲液( p h 6 0 ) y n b 生物素 甘油 p h 自然 2 0 1 o 2 0 1 3 4 2 0 0 o o 0 0 4 1 5 1 o 0 5 1 0 0m m o l l 1 3 4 o 0 0 0 0 4 1 0 b m m y 培养基 将b m g y 培养基中1 0 甘油换成0 5 甲醇+ ，p h 6 6 1 4 2 储备液 1 0 x y n b ：称取1 3 4 9 y n b ，溶于8 0 m l