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浙江工业大学硕士学位论文摘要 牛血清蛋白分子生物整体柱的制备及当归提取液的分离分析 摘要 整体柱是近年发展起来的一种新型色谱柱，与传统的填充柱相比， 它具有渗透性好、制备简单，能实现快速、高选择性分离等优点。本 论文采用甲基丙烯酸缩水甘油酯( g l y c i d y lm e t h a c r y l a t e ，g m a ) 为单体， 乙二醇二甲基丙烯酸酯( e t h y l e n ed i m e t h a c r y l a t e ，e d m a ) 为交联剂，偶 氮二异丁腈( a z o b i s i s o b u t y r o n i t r i l e ，a i b n ) 为引发剂，以正丙醇、1 , 4 一丁 二醇和水的混合物为致孔剂，将这些混合物在液相色谱空管柱中通过 热引发“原位”( i n - s i t u ) 聚合来制备整体柱基质。然后将牛血清蛋白 ( b o v i n es e r u ma l b u m i n ，b s a ) 固载到基质上，得到牛血清蛋白分子生物 整体柱，用该整体柱对当归的提取液进行了分离分析。 本论文通过对总单体( g m a 和e d m a ) 和总致孔剂比例及总致孔 剂中各成分比例的调节，优化了制备整体柱基质的条件，获得较为理 想的配比：3 0 总单体( g m a 7 5 ，e d m a 2 5 ) ，7 0 致孔剂( 正 丙醇7 5 、1 ，4 - 丁二醇1 5 、水1 0 ) ，总单体中加入1m g m l 的a i b n 。 在此基础上，比较了不含间隔臂键合蛋白、含己二胺间隔臂键合蛋白 以及吸附蛋白三种固载蛋白的方法，最终选择吸附法固载蛋白。 用上述条件制得的牛血清蛋白分子生物整体柱，考察了h p l c 条 件( 流动相中甲醇含量、流速、缓冲溶液浓度、p h 值、柱温等) 对当 浙江工业大学硕士学位论文 摘要 归在该整体柱上保留的影响，证明牛血清蛋白分子生物整体柱对当归 提取液的分离是符合亲和色谱机理的。在此基础上，选择了合适的梯 度洗脱条件，以牛血清蛋白分子生物整体柱对当归提取液进行分离， 得到两个组分。通过r p h p l c ( o d s 柱) 及g c m s 对此两组分的进一 步分析，确证了第一、第二组分中分别有一种和四种物质是当归中的 成分。 关键词：整体柱，分子生物色谱，当归，分离分析 i i 浙江工业大学硕士学位论文 a b s l r a c t p r e p a r a t l 0 no fm o l e c u l a r b i o c h r o m a t o g ra p h y t hb s a m o n o l i t m cc o l i 江na n di t sa p p l i c a t i o nt 0 s e p a r a t i o no f4 g e l 比“e x t r a c t l 0 n a b s t r a c t m o n o l i t h i cc o l u m n ，an e wt y p eo fc o l u m n ，h a sa t t r a c t e dm o r ea n d m o r ea t t e n t i o ni nr e c e n ty e a r s t h e r ea r em a n ya d v a n t a g e so v e rt r a d i t i o n a l p a c k e dc o l u m n s ，s u c ha se a s yp r e p a r a t i o n ，e x c e l l e n tp e r m e a b i l i t y ，a n d a b i l i t yi nf a s ta n dh i g h = s e l e c t i v i t ys e p a r a t i o n i nt h i ss t u d y ，as e r i e so fm o n o l i t h i cc o l u m n sf o rh i 曲一p e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h yw e r ep r e p a r e db y i n - s i t u c o p o l y m e r i z a t i o no f g l y c i d y lm e t h a c r y l a t e ( g m a ) a n de t h y l e n ed i m e t h a c r y l a t e ( e d m a ) i nt h e p r e s e n c eo fap o r o g e ns 0 1 v e n tc o n t a i n i n g1 - p r o p a n o l ，1 , 4 一b u t a n d i o la n d w a t e r t h e nb o v i n es e r u ma l b u m ( b s a ) w a si m m o b i l i z e do nt h eo b t a i n e d m o n o l i t h i cm a t r i xt ob et h e s t a t i o n a r y p h a s e o fm o l e c u l a r b i o c h r o m a t o g r a p h y f i n a l l y t h i sm o n o l i t h i cc o l u m nw a s a p p l i e d i n a n a l y z i n g t h em e t h a n o le x t r a c t i o no ft r a d i t i o n a lc h i n e s e m e d i c i n e ， a n g e l i c as i n e n s i s 汜l i v jd i e l s t h er a t i oo fp o r o g e ns o l v e n tt ot o t a lm o n o m e ri nt h ep o l y m e r i z a t i o n m i x t u r ea n dt h ec o m p o s i t i o no f p o r o g e ns o l v e n t ( 1 一p r o p a n o l ，1 , 4 一b u t a n d i o l i i i 浙江工业大学硕士学位论文 a b s t r a c t a n g e l i c as i n e n s i s ( q l i v ) d i e l s t h er a t i oo fp o r o g e ns o l v e n tt ot o t a lm o n o m e ri nt h ep o l y m e r i z a t i o n m i x t u r ea n dt h ec o m p o s i t i o no f p o r o g e ns o l v e n t ( 1 - p r o p a n o l ，1 , 4 - b u t a n d i o l a n dw a t e r ) w e r ei n v e s t i g a t e d f u r t h e r m o r e ，t h em e t h o d so fi m m o b i l i z i n g b s aw e r ec o m p a r e d ，s u c ha se i t h e rb o n d i n gw i t has p a c e ra r l no rn o t ，a n d a b s o r b i n g f i n a l l y i tw a sc o n f i r m e dt h a tt h eo p t i m a lc o n d i t i o nw a s3 0 t o t a lm o n o m e r ( g m a7 5 ，e d m a2 5 ) a n d7 0 p o r o g e ns o l v e n t ( 7 5 1 - p r o p a n o l ，15 1 , 4 一b u t a n d i o la n d10 w a t e r ) ，w i t h1m g m li n i t i a t o r i nt h et o t a lm o n o m e ra n di m m o b i l i z i n gb s ab ya b s o r p t i o n t h ei n f l u e n c i n gf a c t o r s ，s u c ha sc o n c e n t r a t i o na n dp hv a l u e so ft h e b u f f e r s ，c o n t e n t so fm e t h a n o li nt h em o b i l ep h a s e ，t e m p e r a t u r eo ft h e c o l u m n ，a n df l o wr a t e ，w e r ed e t a i l e di n v e s t i g a t e d i tw a sd e m o n s t r a t e dt h a t t h em e c h a n i s mo fb s am o n o l i t h i cc o l u m n 、a c c o r d sw i t ht h et h e o r yo f a f f i n i 够c h r o m a t o g r a p h y ( a c ) i ns e p a r a t i o no f a n g e l i c a t w oc o m p o n e n t si n a n g e l i c as e p a r a t e db yt h e b s am o n o l i t h i c c o l u m nw e r ef u r t h e ra n a l y z e db yr p - h p l c ( o d sc o l u m n ) a n dg c m s c o m p a r e dw i t hr e f e r e n c eo na n g e l i c as e p a r a t i o n ，i tw a sp r o v e dt h a tt h e f i r s ta n dt h es e c o n dc o m p o n e n tc o n t a i n ss e v e r a ls u b s t a n c e so f a n g e l i c a k e yw o r d s ：m o n o l i t h i cc o l u m n ，m o l e c u l a rb i o c h r o m a t o g r a p h y ， a n g e l i c as i n e n s i s ( q l i v ) d i e l s ，s e p a r a t i o na n da n a l y s i s i v 浙江工业大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工 作所取得的研究成果。除文中已经加以标注引用的内容外，本论文不包含其他个 人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得浙江工业大学或其它教育 机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。 作者签名 日期：羼j 勇e 1 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权浙江工业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 作者签名： 导师签名： 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密z ( 请在以上相应方框内打“4 ”) 癣磋 l 孽旦氏 7 ，、 日期：稚j 1 日 日期删佴n 日 辫篷工鼗大学磺士学靛论文 第一章文熬综述 1 1 亲和色谱 第一牵文献综述 自扶o h s o n 等【在1 9 7 9 年教表了第一篇健用离效亲和色谱( 舔g 薄p e r f o r m a t i o n a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y ，h p a c ) 分离a d h 、l d h 豹圆- ) - 酶粒入斑清鑫蛋翻豹谂 文后，h p a c 受到了入靛熬广泛关注。 亲和色谱法f 2 朝( a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y ，a c ) 是基于样品与怒体间的特异搜 棚互馋用耐实现分离豹一署中色谱方法，它依据蛋自质等生物大分子能够通过范德 华力、疏水力、空间和静电相甄作用与配体特异、可逆地结合在起的特性，从 复杂的生物样品中分离得到所需的目标产物。 亲和色谱是基于生物大分子与配体之间的生物学特异性而不是物理化学憔 质，具有特异性强、选择性好、纯化倍数高等优点，非常适合于从复杂体系中分 离提纯某种组分。另外由于样晶中必有待分离组分与配体之间存在稻簋作用，戮 戴分离与富集可一步完成，特鞠适会痕羹缰分的分离分析。僵亲帮色谱法龟存裰 些缺点，翔：柱予专一性强，只熊震予一晕串或一类耱蔟豹分离，藏本较藤，蠢 葬孛易产生不可遂蹶黪，分离的动力学过稷幔j 桂予寿余较短，对铡各技本鬃求嶷 等。 1 ，1 1 亲和配体 巍予亲和分离是基于组分与固定化聪体阗的特异性相互作用，因此配体的选 撵和莰确使用极兔重要。在亲葶丑色谱中，对酝体最基本的要求是性能好、稳定和 价廉。配体的选择应遵循以下原则：首先，配体能够与日标分予发生特异性的可 逆相互作用：其次，配体必须能被固载到基质上，且圈载化不会影响配体与目标 分子之间的相虱作用。亲和配体又w 分为通用型和特异型配体。 第1 页 浙江工业大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 1 1 1 通用型配体 在亲和色谱发展的初始阶段，通用型配体如活性染料、外源凝集素等使用较 多，这类配体又被称为基团特异性配体，它们对某一类含有特定基团的物质都具 有识别作用，其靶标主要不是对着分离物的构型或序列，而是对着分子上的官能 团。 在亲和色谱的各种配体中，染料配体占很大比重。染料配体取材广泛，结合 容量大、稳定性和通用性好、易再生、价廉，已广泛应用于纯化脱氢酶、激酶、 氧化酶、蛋白酶、核酸酶、连接酶和许多血液蛋白剧引。这类亲和配体的不足是： 对目标蛋白质的选择性不如生物特异性配体；纺织染料多为化学合成物，几乎每 一步反应都有许多副产物；染料和基质的连接过程研究得并不充分，所有商品化 的纺织染料配体都存在不同程度的流失，从而降低了亲和容量和使用寿命。 外源凝集素类配体是具有多种特性的糖蛋白，几乎全部来源于植物。其中应 用最广泛的是伴刀豆球蛋白( c o n c a n o v a l i na ，简称c o na ) ，它对q d 一葡萄糖、 值一d 一甘露糖具有高度特异性。另外是小麦胚芽凝集素，它对p - n 一乙酰胞壁酸和a - n 一 乙酰神经氨酸具有高度特异性。 蛋白a 是从金黄色葡萄球菌的细胞壁中提取的一种蛋白，它对多种免疫球蛋 白及其亚类有较高的结合能力【9 1 。由于蛋白a 与免疫球蛋白的亚类的作用强弱各 不相同，因此如果条件选择适当，蛋白a 可选择性地与i g g 的不同亚类分别结合， 并通过适当的方法将这些亚类逐个洗脱下来。 蛋白g 是从链球菌中提取的表面蛋白，它也能与i g g 的f c 区结合。与蛋白a 相比，它能与更多种类单克隆抗体和多克隆抗体结合，而且结合更牢卧1 0 】。但由 于蛋白g 对i g g 有较大的亲和作用，离解蛋白g i g g 复合物的条件较为剧烈。常 常导致生物活性的损失。由于蛋白a 和蛋白g 与免疫球蛋白分子的f c 区有特异 性相互作用，因此它们还可以被用于抗体的定向固载。抗体的定向固载是指通过 抗体分子的f c 区与载体连接，而使它的两个抗原结合区暴露在外，从而最大限度 地提高抗体对抗原的结合效率1 甜。 金属离子的螯合物配体，已广泛应用于基因重组技术产生的含有色氨酸和组 氨酸残基的蛋白质及多肽的分离纯化。常用的金属离子属于元素周期表中的第一 过渡态，例如c u 2 + ，z n 2 + ，c 0 2 + 等，蛋白质主要通过其氨基酸残基的咪唑基、巯基 第2 页 浙我正业大学硕士学位论文第一章文献综述 和畸l 睬基与盒属离子作用而被吸附。p o r a t h 等【1 3 】用被亚氦麓二乙酸固定鹃金属离 子泉分离血清蛋自联，这鼹首次在色谱分离中利用金属离子同蛋白质表面特定氨 基酸间的相互作用。l i e s i e n 等【1 4 】经研究发现，将c u 2 + 螯合物配体接在纤维索基质 上，能一步褥到毫缝度的人生长激索。p o r a t h 将这耪亲积分离称作麟载化金属亲和 色谱( i m m o b i l i z e dm e t a la f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y ，i m a c ) ，同其它亲和分离相比， 金麓离子螯合耪配体稳定、蛋自矮受蕊大、洗疆条势漫秘、造狳爨、溷牧凳全h 舅， 这种亲和色谱存在的最大问题是配体在洗脱过程中的流失会污染产物。 1 1 1 2 特异型配体 在亲和分离中，原则上特异性相互作用越强，非特异性吸附就越小，所获得 兹瓣标产魏靛缝度裁越裹，毽l 迦选矮特冥凝嚣蒋戆获褥最佳兹分薅效果。随嚣发 展出许多特异性更强的配体如酶或底物、单克隆抗体或抗原、细胞给予体或受体 等，这类鬣体被穆之为生物特异径配俸。 特异型配体的突出优点在于它的高选择性，它能从几十亿个不同形状、大小、 性质的分予中识别出对其裔特异性相互作用的分予，这种禽度专一性的亲和作用 是其它介质所无法比拟的。但生物特异性黼体制铸十分困难，专性强，价格昂 贵，且易变性失活，它们的应用受到限制。常用的特异性配体包括酶及菇底物或 攘羲秀裁，抗缀或撬俸，a v i d i n 和b i o t i n ，核棼酸和援酸，受体，维锻会殴及激素等。 每种酶都有其特定的底物或抑制剂，它们总是相辅相成，不可分离。因此如 栗要纯纯酶，就苟馥选蔫箕李牵铡裁成底豹作为亲葶瑟浆体。反之若黉纯纯l 臻键裁， 则可以选择其相应的酶作为配体。 随着妻奠物工稔、基因治疗和免疫技术的发展，单壳酶抗体和多克隆抗体都憨 来越广泛地被用馋亲和色谱豹特异性配体。它的特点是特异性相姐作用强，不受 周围其它物质的干扰。 一些爨隽兔痰疾痣惠者瑟产嶷豹藐钵越簸用予分离纯亿囊抗原。反j 建来这类 纯化的自抗原又能进一步在改性状态下产生抗体，它们对自抗原具有良好的反应 靛，这在凝学主露常毒震。叁蔽钵是在动檀甥髂浚天然孬在鼹撬体，当蠢疾瘸发 生时，它们会发生变化，因此可把它们作为临床疾病发生的指示。有时窀们也被 用于研究相应抗舔的结构和功能。 第3 荑 浙江工业大学硕士学位论文第一章文献综述 a v i d l n 对b i o t i n 具有天然的亲和性，它有四个子单元，每个子单元都能分别 与b i o t i n 结合。在理想状态下a v i d i n 与b i o t i n 的结合力超过1 0 小m o 儿【1 6 1 。如此 高强度的结合意味着这种复合物能经受住h p a c 的强烈冲洗条件而不发生解离。 这使得a v i d i n 成为高效免疫亲和色谱的一种理想涂渍物。此外，链霉菌抗生素蛋 ( s t r e p t a v i d i n ) 也已在免疫亲和色谱中得到应用，它是从细菌链霉菌素蛋白中产生 的一种纯的抗生素蛋白，能表现出所有抗生素蛋白的性质，而且它对组织抽提液 的非特异性相互作用很小，是一种很好的特异性配体。 随着研究的深入，对于核酸、基因、寡核苷酸和聚核苷酸及其相关的特异性 蛋白分离纯化的要求越来越高，亲和色谱正在这方面发挥着越来越大的作用。当 将有确定序列的寡核苷酸键合到载体上后，就可以实现其互补寡核苷酸的分离， 这种亲和分离往往需要采用温度梯度洗脱技术加以实现。 由于受体与相应的酶、蛋白质或底物之间存在着非常高的特异性相互作用， 而且这种相互作用是可逆的，因此受体也可被用作特异性的亲和配体。 动物体内存在的痕量维他命、激素等物质具有特异性传递功能，它们与相应 蛋白质的结合会对这些物质的吸附、传递、转换等过程起重要的作用【l ”。与它们 特异性结合的蛋白浓度都很低，然而它们对互补的维他命或激素却有很高的亲和 力。对于激素的分离可采用与其相应的抗体、传递蛋白、外源凝集素等作为亲和 配体。 1 1 2 配体的固载 亲和介质的活化或化学改性是配体固载的第一步，也是最关键的步。活化 后的活性官能团越多，接上的亲和配体就越多，分离效果就越好。因此选用合适 的活化方法非常重要【1 8 】。活化的方法主要有以下六种。 1 1 2 1 溴化氰法 溴化氰法是制备亲和介质最早使用的方法。该法简单、方便、有效，因此直 到现在仍在广泛使用。国外大部分商品化的予激活填料都是采用这种方法制备的。 它是利用载体上的邻位羟基与溴化氰在碱性条件下反应生成高活性的氰酸酯，然 后再与蛋白的氨基在温和的条件下反应，即可将蛋白固载在载体上。但溴化氰是 第4 页 浙江工业大学硕士学位论文 第一章文献综述 极强的致癌性剧毒物质，操作时要格外小心。 1 1 2 2 环氧法 环氧法毒性小，试剂易于获得，反应速度快，活化效率高，因此也是制备亲 和介质的一种常用方法。这种方法一般利用含双环氧的化合物或环氧溴丙烷、环 氧氯丙烷作为活化试剂与配体上的氨基或疏基偶联，即可制得相应的亲和介质。 1 1 2 3 碳二亚胺法 碳二亚胺法是利用配体的羧基进行反应，因此反应可在弱酸条件下进行，这 对于固载在碱性条件下易变性的蛋白特别有利。 1 1 2 4 羰基二咪唑法 含吡咯、咪唑环的n 酰基( r c o ) 衍生物可与配体的羟基、氨基及羧基反应， 由于该反应迅速、安全、高效，且不会产生其它副反应，因此正逐渐受到人们的 关注。 1 1 2 5 高碘酸盐氧化法 该法操作简单。氧化过程所用的n a l 0 4 的浓度一般为o 0 1 0 5m o l l ，反应通 常在弱碱( p h8 0 8 5 ) 条件下进行。还原反应一般采用新鲜配制的1 的硼氢化 钠溶液。这种方法的缺点在于反应中的不溶性盐和其它物质会堵塞介质中的一部 分孔，从而使空隙率降低。由于抗体分子的f c 区有多糖残基，用n a l 0 4 氧化抗体 分子的糖基化区，然后与经过活化的载体反应，也同样可以实现抗体分子的定向 固载】。 1 1 2 6 三嗪活化法 三嗪活化法是一种较新的方法，一般使用均三氯三嗪或二氯三嗪为活化试剂。 它既能与含羟基也能与含氨基的介质反应。该方法键合量高、操作简单。 第5 页 浙江工业大学硕士学位论文第一章文献综述 1 1 3 间隔臂 在分离生物大分子时，若将亲和配体直接键合到载体上，欲分离的生物大分 子的立体构型使它很难接近配体，这就是色谱分离中的“空间位阻”效应【9 1 。这种 情况在配体是小分子时表现得尤为明显。为了克服这种几何位阻障碍，往往需要 在基质和配体间插入具有一定长度的间隔臂。理想的间隔臂不仅要有一定的长度， 而且要求自身不带电荷，疏水性也不能太强，不带任何附加的活性中心，以避免 产生非特异性相互作用。另外，由于间隔臂既要与基质相连又要与配体相连，因 此它必须有双官能团。表1 一l 中列出了一些常用的间隔臂【6 】。其中最常用的是二胺 类化合物，因为它具有良好的反应性能，价格也比较便宜。间隔臂的长度一般在 8 5 0n l t l 为宜。若选用太长的间隔臂，它在一定条件下会发生返折，使其有效长度 降低，反而不利于亲和相互作用。 表1 - 1 常用的间隔臂 名称 结构 a l k y l a m i n e d i a m i n e p o l y p e p t i d e s p o l y a m i n e p o l y e t h e l a m i n oa c i d n h | |h o c n r n h 2 h 2 n r - n h 2 n hror l ihi ih o c n c c n c c o o h hh n h i ihh - - 0 。c n - - ( c h 2 ) 2 。n - - ( c h 2 ) 2 。n h 2 0 ( c h 2 h o ( c h 2 h o ( c h 2 ) 2 0 h n h 2 r c o o h 1 1 4 基质 利用配体分离生物分子时，常常须要将配体固定在载体或支撑体上。经常使 用的载体有聚糖、多孔玻璃、聚丙烯酰胺、聚羟甲基丙烯酰胺等亲水性聚合物1 9 1 。 载体使用前，必须先活化，以便解决下列3 个问题：( 1 ) 给它提供稳定的结合基团 第6 页 浙江工业大学硕士学位论文第一章文献综述 ( a n e h o r g r o u p ) ；( 2 ) 提供适当长短的间隔臂( s p a c e ra r m ) ，减少生物分子与配体 反应时的空间阻力；( 3 ) 引入能与配体反应的活性末端基团。根据配体和载体物理 化学性质不同，采用不同的活化方法【l 。 亲和色谱对基质的要求是【2 16 】：( 1 ) 表面积大；( 2 ) 基质颗粒为均匀的球形，有 一定的机械硬度，能承受一定的压力：( 3 ) 有良好的化学稳定性，不随流动相盐浓 度、p h 值及有机溶剂的改变而收缩或溶胀，以保证一定的使用寿命，降低成本： ( 4 ) 非特异性吸附弱：( 5 ) 基质表面应有尽可能多的活性官能团，以利于化学改性， 并可直接或通过间隔臂与配体连接；( 6 ) 抗生物降解，生物兼容性好，在与生物大 分子的接触中才能减少不必要的活性损失。在实际应用时，还应考虑基质的孔率 和基质骨架对配体微环境的影响。 1 1 4 1 软凝胶基质 软凝胶基质是生物大分子分离纯化中应用最早也是最为广泛的一类基质包括 纤维素、琼脂糖和交联葡聚糖等。 纤维素包括天然和人工合成两种。天然纤维素主要指棉布、滤纸等天然制品， 人工合成的纤维素是由b l ，4 连接的d 一葡萄糖苷组成的线性聚合物。纤维素具有 良好的机械和热稳定性，能与大多数有机溶剂兼容，是理想的亲和基质。但它在 碱性溶液中会溶解，且其分子上可利用的活性反应基团( 羟基) 的数量和比例少， 在纤维素上固载配体的密度只有琼脂糖的数百分之一。此外，由于其结构中存在 结晶区和非结晶区，使得其表面化学改性相对较难。 葡聚糖是一种带枝链的多糖类物质，它由q 1 ，6 葡萄糖链连接起来，并在1 , 2 一、 l ，3 和1 , 4 一葡萄糖键上连接枝链。将葡聚糖用环氧氯丙烷交联会形成三维网状结构。 交联葡聚糖亲水性极强，热稳定性好，在溶液中会溶胀，在0 0 2m o l l 的盐酸及 大多数碱介质中稳定，但在强酸或氧化剂存在条件下不稳定。多糖的结构疏松，分 子排阻极限可达4 0m u ，不易吸附敏感生物大分子也不使其变性，且p h 适用范围 比较广，亲和容量高，价格比较便宜。这类基质不足之处是质软、不耐压，在较 低的p h 范围内易降解。 琼脂糖是由d 一半乳糖残基和3 , 6 脱水l 半乳糖单元交替组成的一种线性多 糖，9 0 以上的亲和分离都用它来完成。琼脂糖可用2 ，3 一二溴丙醇进行交联以增强 第7 页 浙江工业大学硕士学位论文 第一章文献综述 其机械强度，改善反应性能。琼脂糖凝胶在p h4 - 9 的范围内稳定，化学稳定性好。 交联后的琼脂糖化学稳定性更好，能经受如乙醇、四氢呋喃、丙酮、氯仿等有机 溶剂，但它不耐高温。 1 1 4 2 无机物基质 无机物基质包括多孔玻璃、硅胶和氧化铝等啊。 控制孔径的玻璃是生物色谱中一类独特的基质。它不溶解，几乎不受洗脱液、 压力、流速、p h 和离子强度变化的影响；但非特异性吸附较强。有报道将葡聚糖 涂布于玻璃珠上，消除了非特异性吸附作用2 1 。 硅胶填料【2 0 ，2 1 彩】机械强度理想、柱效高、孔径和形状容易控制，是目前应用 最为广泛的一类无机填料。目前用于分离纯化生物大分子的硅胶大部分是孔径为 3 0n m 的大孑l 硅胶。2 0 世纪8 0 年代中期出现的无孔硅胶填料【2 6 30 1 ，粒径一般在1 3 肛m ，这种基质的最大优点在于以对流传质代替了孔内扩散传质，从而大大提高了 分析速度和柱效。但硅胶基质存在一个较大弱点，就是它的p h 应用范围是2 0 8 0 ，碱性过大时，即使表面覆盖一层疏水聚合物，仍被腐蚀。另外，较强的非特 异性吸附3 1 】也限制了硅胶的应用。 1 1 4 3 灌流色谱基质 a f e y a n 等【32 j 合成的灌流色谱基质较为理想。该基质上有两种孑l 结构：一种是 贯穿孔，指孔径在6 0 0 8 0 0n l n 范围内的特大孔；另一种是扩散孔，是指孔径在 8 0 - 1 5 0m t l 范围内的连接这些特大孔的较小的孔，这种孔孔径一般不超过lp m 。灌+ 流色谱的传质过程主要是贯穿孔的对流传质，溶质能随流动相迅速到达孔内表面。 虽然在贯穿孔之间还存在扩散孔，不能形成对流传质，但这种孔的深度小，扩散 程短，不会造成明显的传质阻力，而且扩散孔的存在可以提供大的表面积和柱容 量，缩短分离时间，同时提高生物大分子的质量回收率和活性回收率。但灌流色 谱基质价格昂贵，一根2 0 0 2n l r ni d 的分析柱的价格也在1 0 0 0 美元以上，因 而限制了其应用旧3 3 j 。 第8 页 浙江工业大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 1 4 4 膜基质 亲和膜分离技术是一项新兴的技术，兼有膜分离和亲和色谱的优点，可以有 效地进行生物产品的分离和纯化【3 4 1 。膜色谱的基质材料一般包括：纤维素膜、有 机改性的纤维素膜和有机聚合物膜。膜色谱的优点在于：( 1 ) 生物大分子在膜介质 中以对流传质为主，分离速度快，特别适用于生物大分子的快速分离分析：( 2 ) 柱 压低；( 3 ) 易于放大，尤其是径向膜色谱柱，只要简单地增加柱长就可以达到目标； ( 4 ) 可直接处理复杂的生物样品，几乎不需要预处理；( 5 ) 膜基质生物兼容性好。 但同时膜色谱也有以下两个缺点：( 1 ) 柱效低：( 2 ) 耐压性差。 1 1 4 5 整体材料基质 1 9 6 7 年k u b i n 掣3 5 1 以高度溶胀的聚甲基羟乙基丙烯酸酯凝胶整体柱，以低压 柱色谱的方式分离了蛋白质。2 0 世纪8 0 年代末，i - i j e r t e n 及其同纠3 6 ，3 7 1 通过在空 管柱中加入单体、引发剂及致孔剂的混合溶液“原位”( i n - s i t u ) 聚合后制得聚丙 烯酰胺凝胶，再将其高压压入一空色谱柱制得软基质“连续床”色谱柱，成功地 用于蛋白质及多肽的分离。f r 6 c h e t 等【3 8 】随后进一步发展了这项技术，在空管柱中 “原位”聚合制得刚性聚合物“连续棒”，用于反相色谱分离蛋白质获得了与 h j e r t e n 的“连续床”相同的效果。f i e l d s 等采用相同的方法成功地制备出了硅 胶整体柱，使这项技术得到更全面的发展。 整体材料基质是一种新型高效液相色谱填料，既有无孔填料和膜的快速分离 能力及h p l c 多孔填料的高容量的优点，又没有增加柱阻力。目前整体材料已被 广泛地用于液相色谱和毛细管电色谱柱的制备，是种正在发展的很有前景的色 谱填料合成技术。 1 2 中药的生物色谱分析 1 2 1 概述 分子生物色谱是亲和色谱的扩展，但它侧重于研究生物分子间相互作用【4 0 】 第9 页 浙江工业大学硕士学位论文 第一章文献综述 是指以生物大分子为固定相基础的h p l c 技术，溶质在该固定相上的保留行为及 立体选择性能够反映生物大分子非固定时与溶质相互作用的特性。分子生物色谱 把生物体内的活性物质如酶、受体、传输蛋白等固定于色谱填料中，利用中药中 活性成分与它们的相互作用，将色谱分离与分子生物医学二者的新成果紧密结合 起来，发现新的生理活性物质。采用柱切换，如与h p l c 、h p c e 联用等，实现分 子生物色谱中活性馏分的二级分离，以提高分子生物色谱的分离功能和获得的中 药有效化学成分的信息量 4 q 。 药物作为一类重要的生物活性物质与血浆蛋白( 如白蛋白、伍l 一酸性糖蛋白) 存在可逆的结合平衡。血液中只有游离药物可透过血管达到活性位点，产生药效 和引发副作用。因而药物分子在人体血液中与血浆蛋白的相互作用直接影响药物 的分布、排泄、代谢、活性和毒副作用。从分子水平上深入理解这类生物活性分 子间的相互作用具有极其重要的理论和实践意义。分子生物色谱是基于生物活性 分子相互作用原理的测试方法和医疗手段1 4 2 】。 我国中草药复方经过千余年i 临床验证，有深厚的中医学理论作指导，是祖国 的瑰宝。随着近代科学的发展，在单味中草药的化学分离、质量控制、真伪鉴别、 个别化学成分定性定量分析等方面的研究已有一定基础。但常规的中药色谱分离 分析的模式，如气相、液相色谱等都是基于中药成分物理化学水平上分子作用力 的差别，只是作为分离的工具，不可避免地存在以下缺陷：( 1 ) 液相色谱进行中药 指纹分析耗时过长，一般需要2h 以上；( 2 ) 指纹谱中仍有可能有许多没有获得有 效分离的中药组分；( 3 ) 被分离的化学成分无法给出药理功能的基本信息：( 4 ) 一 些在药理上无功能的成分有可能严重地干扰有效成分的分离分析。若将色谱分离 与生物医学二者的新成果紧密结合起来，发展新方法、新技术，会极大地推动我 国中药研究的发展【2 。 1 2 ，2 生物色谱分析的进展 p i d g e o n 等【4 3 】以脂质体为固定相配基，能够模拟生物膜的脂质双层结构，可以 研究药物透过生物膜的过程，预测药物的活性参数。1 9 9 5 年，b e i g i 等水j 将固定化 脂质体液相色谱用于模拟小肠上皮细胞对药物的吸收过程。 除脂质体外，人们还研究了强亲脂性药物的人红细胞膜为配基的色谱行为， 第1 0 页 浙江工业大学硕士学位论文 第一章文献综述 发现药物与膜脂质双层的相互作用可以进行量化表征，表明生物膜球形凝胶微粒 色谱柱适用于强脂性药物的快速筛选【4 5 ，4 6 1 。 毛希琴等 2 l j 采用涂敷卵磷脂的硅胶作为仿生物膜色谱固定相，通过固定相和 流动相的改变可以很方便地模拟人体的生理环境，用于研究药物在体内的吸收和 分布状况以及药物的初步筛选。另外，涂敷凝脂的硅胶作为仿生物膜色谱固定相， 与传统的凝胶载体相比，固定相的机械强度及凝脂固载能力均有较大提高，且稳 定性较好【2 ”。 贺浪冲等口3 1 考察了6 种钙拮抗剂与硅胶载体兔红细胞、心肌细胞膜的特异性 相互作用，结果表明生物膜色谱法可直接用于研究药物与膜受体的特异性、立体 选择性相互作用，并正在应用该法筛选当归中对主动脉血管有舒张作用的有效成 分【2 4 1 ，此法可不经提取分离步骤，直接确定中药中的某种活性成分。 孔亮等1 2 0 ，2 5 , 4 7 。5 1 1 以人血清白蛋白和l 一酸性糖蛋白这两种载体蛋白为固定 相，对常用中药当归、川芎、茵陈、黄芪、赤芍、银杏叶、丹参等进行了分析， 得到了这些中药的分子生物色谱指纹图谱。利用这些图谱，可以鉴别中药材的种 类、产地和真伪，而且它能给出这些中药中血浆结合率高的主要成分的色谱峰， 这些色谱峰所代表的成分应该具有药效学和药动学方面的意义。 生物色谱中常用的基质是以琼脂糖为代表的多糖类软凝胶【4 6 j ，但其质软、不 耐压，在较低的p h 范围内易降解【5 ”。为了克服这些缺点，人们通过多糖交联方法 获得了半刚性凝胶一交联琼脂糖。控制孔径的多孔玻璃和硅胶都因为其较强的非 特异性吸附【2 ，3 ”，未获得广泛应用。a f e y a n 等3 2 1 发展的灌流色谱基质是一种较为 理想的生物色谱填料，但价格昂贵。8 0 年代末出现的刚性有机聚合物整体色谱填 料1 5 2 - s 6 1 合成过程简单、柱压低、传质速度快，并有良好的化学稳定性，p h 适用范 围广，有良好的生物兼容性，是一种理想的生物色谱基质。 1 3 整体柱的制备及应用 1 3 1 概述 整体柱( m o n o l i t h i cc o l u m n ) ，又称棒柱( r o d ) 、连续床层( c o n t i n u o u s b e d ) 、 第1 1 页 浙江工业大学硕士学位论文 第一章文献综述 无塞柱( f r i t l e s sc o l u m n ) 【5 5 】，它是应复杂样品体系( 如：生物样品、环境样品等) 的快速、高效、高通量分析需要而发展起来的一种新型色谱柱【5 ”。整体柱是一种 用有机或无机聚合方法在色谱柱内进行原位聚合的连续床固定相，与传统的填充 柱相比，整体柱具有以下优点【5 8 】：( 1 ) 整个床层高度均匀，分辨率高：( 2 ) 可在高 流速下操作：( 3 ) 制备成本低，使用寿命长，稳定性好；( 4 ) 简化了介质的衍生； ( 5 ) 分辨率、吸附容量、流速( 给定压力下的运行时间) 都可通过改变制备过程中 单体、致孔剂等反应物的配比组成来调节。 整体柱制备简单、重现性好、多孔性优越、能实现快速、高效分离等优点f 5 9 ，6 0 ， 使得它已在反相色谱 6 1 - 7 0 】、离子交换色谱 7 1 - 7 7 】、疏水作用色谱【7 l 7 8 1 、亲和色谱【7 9 1 、 体积排阻色谱t 6 t , 6 9 1 e p 获得了应用，并成功分离了肽m7 9 8 ”、蛋白剧7 1 ，7 2 ，7 4 7 8 - 删、 类固醇【6 2 ) 、芳烃【6 4 击6 ，82 1 、聚合物【6 9 ，8 3 , 84 1 、低聚核昔酸【7 6 ，7 7 1 、氨基酸【7 9 】等物质，在 生物大分子的快速分离分析中发挥着重要的作用。 1 3 2 整体柱的制备和应用 目前，整体柱制备技术已日趋成熟，其有机和无机聚合制备方法都得到很大 发展。以硅胶为基质的无机整体柱，具有理想的机械强度，比表面积大，适合分 离小分子混合物【8 5 l ，在孔结构控制方面表现出明显优势，同时具有大孔和中孔结 构，孔隙率 8 0 【8 “，其缺点是抗溶剂性能差，适用的p h 范围较小。相对于硅 胶整体柱，有机聚合物整体柱的制备更为简单、直接，并可通过对其进行化学改 性以满足各种色谱模式的要求。 1 3 2 1 以填充柱为基础的整体柱 以填充柱为基础的整体柱主要应用于毛细管电色谱，其制备方法是通过各种 方法将传统的球型填充材料原位固定在毛细管中以形成整体结构。按照制备方法 的不同可将其分成三类：( 1 ) 颗粒烧结整体柱【8 7 】，将普通的硅胶柱进行热处理，使 硅胶粒子表面熔融，各个粒子相互联结，进而形成连续的整体柱；( 2 ) 颗粒包埋整 体柱【8 8 】，先将填料填充到毛细管中，然后再引入包埋溶液，使其形成整体柱；( 3 ) 颗 粒包覆整体柱【8 9 】，实际上可归属于颗粒包埋整体柱的一种类型，但它是一步完成 颗粒填料的填充与颗粒的包埋。 第1 2 页 浙江工业大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 3 2 2 硅胶整体柱 溶胶一凝胶整体柱是以烷氧基硅烷为主要原料，在催化剂、致孔剂存在下， 通过水解、缩聚反应实现溶胶凝胶化而形成的无机整体柱【“，9 0 _ 9 3 】，这种整体柱应 用范围广，可直接作为固定相或再进行衍生，适用于酸性、碱性、中性以及容易 和金属螯合的化合物的分离，已成功地分离了芳烃、中性有机化合物、碱性化合 物、茶、植物色素、聚合物、多肽、药物、毒品等物质。另外，由于硅胶整体柱 机械强度高，稳定性好，保证了这种整体柱的重现性、可靠性和使用寿命。尽管 硅胶整体柱具有许多优异特性，并且在制备过程中通过改变反应物配比，可独立 地控制大孔和中孔孔径，但仍然存在一定的缺限，如其连续床层在干燥和老化过 程中易开裂，严重影响柱效，且制备过程较为复杂。同时，硅胶基质对极性，特 别是碱性溶质具有强非特异性吸附作用，易导致生物大分子变性、失活、化学稳 定性相对较差等。这些问题的主要原因来源于硅胶中所含的杂质金属离子，以及 在化学修饰或键合时因位阻等原因而导致的在硅胶表面上残存的、或新生的硅羟 基。另外，硅胶整体柱需经包覆后才能使用，这无疑增加了制备工作的复杂性： 其次硅胶整体柱的制备和化学修饰不能同时进行，需分步完成。 目前硅胶整体柱已由德国的m e r c k 公司实现了商品化，商品化的硅胶整体柱 主要有s i l i c ar o d 9 2 9 4 1 乘1c h r o m o l i t h t 9 5 1 。m e r c k 公司的产品还有适用于分析多肽及 蛋白消化物的硅胶整体毛细管柱c h r o m o l i t ht m 、c a pr o dt m ，柱管为熔融的石英 毛细管，装有套管及标准的lp 1 6 的p e e k 接头，可直接与质谱联用。 早在1 9 9 1 年，n a k a n i s h i 等报道了多孔硅胶整体材料的制备技术，在水溶性有 机聚合物苯乙烯磺酸钠存在的条件下，四甲氧基硅烷在硝酸的催化作用下形成拥 有不同形态结构的硅胶，其中包括具有微米级通孔的整体硅胶材料，并考察了不 同条件对硅胶结构的影响。后来，他们又利用烷氧基硅烷在有机聚合物聚丙烯酸 或聚环氧乙烷存在下，以硝酸为催化剂，采用溶胶一凝胶技术制备硅胶整体材料， 并对其制备机理、制备条件做了深入的探讨。这些研究工作为硅胶整体材料应甩 于h p l c 奠定了基础【9 3 】。 1 9 9 6 年m i n a k u c h i 掣删首先制备了连续的硅