（内科学专业论文）胰岛素抵抗大鼠肝脏组织perk和ρperk的表达及意义.pdf

目录 一、摘要 嬲嬲必 中文论著摘要1 英文论著摘要6 二、英文缩略语1 1 三、论文 前言1 2日u 舌l z 实验材料与方法1 4 实验结果00 1 1 5 讨论1 8 结论1 9 本研究创新性的自我评价2 0 参考文献2 1 四、附录 综述0 000 2 3 在学期间科研成绩3 3 致谢! 3 4 个人简介3 5 中文论著摘要 胰岛素抵抗大鼬干月彪目织p e i 和p - p e r k 的表达及意义 刖置 糖尿病( d m ) 是严重危害人类健康的常见病，目前全世界有1 亿7 千万d m 患者， 预计在未来2 5 年内d m 患者将达到3 亿6 千万。临床上d m 主要分为1 型糖尿 病( t 1 d m ) 和2 型糖尿病( t 2 d m ) ，而t 2 d m 占d m 的9 0 0 o - - 9 5 。t 2 d m 是以骨骼 肌、肝脏及脂肪等胰岛素靶组织胰岛素抵抗为主要特征。t 2 d m 的发病机制目前 尚不完全清楚，近年研究发现，内质网应激( e n d o p l a s m i cr e t i c u l u ms t r e s s ，e r s t r e s s ) 在肥胖所致胰岛素抵抗中占重要地位，与靶组织胰岛素抵抗和胰岛b 细胞功能障 碍密切相关；因此e r 应激在肥胖导致的胰岛素抵抗中的作用已成为当前糖尿病 研究的热点领域。 内质网( e n d o p l a s m i cr e t i c u l u m ，e r ) 是细胞内重要的细胞器，是调节蛋白 质合成及合成后折叠及聚集的场所，是调节细胞的应激反应及细胞钙水平的场所， 也是胆固醇和类固醇及许多脂质合成的场所。在缺氧、氧化应激、异常糖基化反 应以及钙离子稳态失衡等各种因素作用下，新生肽链的修饰折叠与组装受到干扰， 将引起未折叠蛋白在e r 中堆积，使细胞产生内质网应激( e r s ) ，并激活未折叠蛋 白反应( u p r ) 信号转导通路，导致细胞自身通过改变其转录和翻译过程，减少蛋白 的合成，降低进入内质网的蛋白量，同时上调内质网中分子伴侣和折叠蛋白的表 达，增强内质网的蛋白折叠功能。细胞还可以通过上调内质网蛋白降解途径的相 关基因表达，加速未折叠蛋白的降解过程，以提高细胞在有害因素下的生存能力。 e r s 是在应激条件下，为维持细胞内环境稳定，保持细胞生存，细胞启动的自我 保护反应机制。 研究发现，经过1 6 周高脂饮食的小鼠和正常饮食小鼠相比，脂肪组织中e l l s 的标志，如p r e k 磷酸化和c j u n 氨基末端激酶( c j u nn t e r m i n a lk i n a s e ，j n k ) 活性 均明显增加，o b o b d , 鼠和野生型小鼠相比，脂肪组织中磷酸化的p e r k 和i r e 1 a 明显增高，并且j n k 活性和x b p 1 的剪接也明显增加，这些均提示肥胖可以导致脂 肪细胞e r s 。但肥胖的脂肪组织中发生e r s 的原因目前仍不清楚。但有以下几种假 说：在营养过剩的情况下，内质网中蛋白质合成明显增加，诱发u p r ；过剩 的营养物质可以作为诱导e r s 的信号，在肥胖状态下，血浆游离脂肪酸( f f a ) 水平 明显升高，研究发现，在肝细胞和胰岛b 细胞中，f f a 可以诱导u p r ，但是在脂肪 细胞中，f f a 对内质网功能的影响目前还不清楚，在3 t 3 l 1 脂肪细胞中，f f a 可 以激活, i n k ，导致i r 。而u p r 同样可以激活j n k ，所以f f a 可能和e r s 存在联系； 肥胖时发生e r s 的一个原因是葡萄糖缺乏状态，这在许多细胞，包括脂肪细胞中 都被认为是e r s 的诱因。在肥胖的脂肪细胞中，因为细胞内i r ，胰岛素信号通路受 到抑制，糖份摄取减少，细胞在葡萄糖缺乏或不稳定的情况下，容易发生应激。 h o s o g a i 等。发现，肥胖小鼠的脂肪组织和野生型小鼠相比，会出现明显的低氧征 象，在培养的脂肪细胞中，低氧会诱导u p r ，表现为b i p 等表达增加，e l f 2 a 磷酸 化和x b p 1 剪接增加。以上多种因素共同作用，相互调节，导致肥胖的脂肪细胞 发生e r s 。 为了应对和适应e r s 细胞需要一条由e r 至i j 核内的信号转导途径来提高e r 蛋 白折叠能力，这条途径就是非折叠蛋白反应( u p r ) 。u p r 主要包括3 条信号通路。 分别由3 种类型的e r 驻留蛋白起始：l 型e r 转膜蛋白激酶( t y p e 1 e rt r a n s m e m b r a n e p r o t e i nk i l l a s ei r e l ) 、双链r n a 依赖的蛋白激酶样e r 激酶( p k rl i k e e rk i n a s e p e r k ) 和活化转录因6 ( a c t i v a t i n gt r a n s c r i p t i o nf a c t o r6a t f 6 ) 。另外。近来报道也从 不同的细胞中分离得到了其他类型的信号感受器和通路。u p r 不仅增加了e r 膜的 数量还增加了与蛋白折叠相关的分子伴侣和蛋白修饰酶的数量。同时还通过阻止 蛋白翻译减少了去往e r 的蛋白量。最后未折叠多肽返回胞质并通过蛋白酶体依 赖的途径降解这个过程称为e r 相关降解( e r a s s o c i a t e dd e g r a d a t i o ne r a d ) 。但 是，如果最终e r 的正常功能没有恢复例如长时间剧烈的u p r 可能导致细胞走向 凋亡。因此，一旦没有正确折叠而失去功能的蛋白出现在细胞表面这个细胞就 可能很快被组织清除 近年来的研究发现，e r s 与胰岛b 细胞的生存、凋亡及糖尿病的发生密切相关， 而对糖尿病过高e r s 状态进行适当干预，则可能成为糖尿病治疗的新手段。目前， 虽然e r s 参与糖尿病的研究己渐成热点，但有关e r s 介导胰岛b 细胞功能受损及胰 2 岛素抵抗的确切机制，e r s 在不同类型糖尿病起病以及糖尿病并发症中所扮演的 角色，内质网分子伴侣在糖尿病治疗中的应用，e r s 与糖尿病并发症共同通路氧 化应激间的关系等，还需进一步阐明。 材料与方法 s p f 级4 周龄雄性w i s t a r 大鼠3 0 只，体质量8 0 1 2 0 9 ，购自中国医科大学实验 动物中心。大鼠适应性喂养1 周后，随机分为正常饮食组( n c 组，z = 1 5 ) 和高脂 饮食组( h f 组，n = 1 5 ) 。n c 组给予基础饲料喂养，作为对照组。h f 组给予高脂饲 料喂养，建立胰岛素抵抗大鼠模型。1 0 周后，每组随机抽取5 只行高血浆胰岛素 正常血糖钳夹以评估胰岛素抵抗大鼠模型建立。 左颈总动脉接肝素生理盐水注射器，右股静脉接三通管后分别接装有 4 0 m u m l 的人胰岛素注射液( 丹麦诺和诺德公司产品) 和1 0 葡萄糖注射液的 5 0m l 注射器，再接微量输液泵。静置3 0m i n 后，颈总动脉取血lm l 测基础血 糖和基础胰岛素。首先输注胰岛素，输注率1 6 7m u k g 一m i n 。) ，每5 m i n 颈动脉 取血1 滴测血糖，当血糖 ( 基础值士0 5 ) m m o l l 时开始输注葡萄糖，输注率从4 6m g k g m i n 。开始。每5 m i n 测血糖一次，调整葡萄糖输注率，使血糖保持在( 基 础值士o 5 ) m m o l l ，连续3 次血糖都在上述范围内，钳夹形成。实验共计约2h ， 计算6 0 1 2 0m i n 的平均g i r ，评价胰岛素的敏感性。颈动脉血样4 c ，3 0 0 0 g ， 离心1 5m i n ，分离血清置一8 0 冰箱冻存。 n c 组和h f 组未做钳夹的2 0 只大鼠禁食1 6h ，经1 0 水合氯醛( 0 3 m g k g ) 腹腔内麻醉后，腹主动脉穿刺取血约4m l ，4 c ，3 0 0 0 x g ，离心1 5m i n 后，分离血 清置8 0 。c 冰箱冻存。肝脏组织剪成约1 0 0m g 大小的组织块，剔除血管和其他结 缔组织，清洗后蘸干，放入1 5m le p 管中于8 0 冰箱中冻存。 取肝脏组织1 0 0m g ，加入1m l 蛋白裂解液，超声匀浆静置3 0m i n 后，4 c ， 1 2 0 0 0 x g ，离心3 0r a i n ，取上清，b c a 法蛋白定量。取含总蛋白3 0 嵋的样品进行 s d s p a g e 电泳，湿转法将蛋白条带转移到p v d f 膜上，用含5 脱脂奶粉的t b s t 封闭1h 后依次加入一抗( 兔抗大鼠p e r k 单克隆抗体，1 ：5 0 0 稀释) 、二抗( 辣 根过氧化酶标记的山羊抗兔单克隆抗体，1 ：50 0 0 稀释) ，洗膜后用增强化学发光 法显像，用凝胶图像分析系统分析结果。检测p p e r k 蛋白水平时一抗为兔抗大 3 鼠p - p e r k 单克隆抗体( 1 ：10 0 0 稀释) ，二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 多克隆抗体( 1 ：50 0 0 稀释) 。 取1 0 0g l 冻存的血清，应用大鼠胰岛素e l i s a 试剂盒( r & d 公司) ，依据说 明书进行操作，检测基础状态下的血清胰岛素水平。 结果 与n c 组相比，h f 组6 0 1 2 0m i n 的平均葡萄糖输注率( g i r 6 0 1 2 0 ) 明显低于n c 组( 0 9 0 - j ：0 1 5 m g k 分1 m i n v s4 9 7 + 0 6 8m g k g m i n 1 ，p 0 0 1 ) 。与n c 组相比， h f 组大鼠肝脏p p e r k 表达明显升高( 1 9 2 8 9 + 2 5 1 6v s6 3 0 4 + 1 5 6 1 ，p o 0 5 ) ， p - p e r k p e r k 也明显升高( o 9 9 + 0 1 2 v so 3 3 + 0 0 8 ，p 0 0 5 ) 讨论 本研究结果显示h f 组大鼠基础胰岛素水平高于n c 组( 尸 o 0 5 ) 并且h f 组大鼠g i 心o _ 1 2 0 显著低于n c 组( p 0 0 5 ) ，而p - p e r k 表达显著升高( p o 0 5 ) 。并且 h f 组大鼠肝脏组织p - p e r k p e r k 的比值也显著升高( 尸 o 0 5 ) ，而血清t g 水平显著升高( p 0 0 1 ) ，h f 组大鼠肝脏组织p - p e r k 蛋白的表达水平也明显升高妒 o 0 5 ) ，并且基础胰岛素水平也显著升高俨 0 0 5 ) 。这些结果表明高脂喂养可能通过脂毒性造成肝脏组织e r s ，从而引起r 。 营养信号和e r s 可以激活p e r k ，活化的p e r k 通过激活重要的炎症激酶c j u n 氨基端激酶( 心k ) 而调节胰岛素的活性。p e r k 也可以直接作用于胰岛素受体底 物( i r s ) 而改变胰岛素的活性。 结论 胰岛素抵抗大鼠肝脏组织中p - p e r k 蛋白及p - p e r k p e r k 升高，提示内质网 4 应激( e s r ) 可能参与胰岛素抵抗的发生。 关键词 胰岛素抵抗；内质网应激；大鼠；肝脏组织；磷酸化p k r 样内质网调节激酶 5 英文论著摘要 t h e e x p r e s s i o na n ds i g n i f i c a n c eo f p e r ka n d p - p e r k i nt h el i v e r so fi n s u l i n r e s i s t a n c er a t s p r e f a c e d i a b e t e si sas e r i o u sp u b l i ch e a l t hp r o b l e mo fc o m m o nd i s e a s e s ，t h ec u r r e n t7 m i l l i o nw o r l d w i d e ，10 0m i l l i o nd mp a t i e n t s ，d mi nt h en e x t2 5y e a r sw i l lr e a c h3 0 0 m i l l i o np a t i e n t sw i t h6m i l l i o n d mc o n s i s t so fc l i n i c a lt y p e 1d i a b e t e sa n dt y p e2 d i a b e t e s ，a n dt 2 d ma c c o u n t e df o rd m 9 0 t o9 5 t 2 d mi sas k e l e t a lm u s c l e ，l i v e r a n df a ti n s u l i nt a r g e tt i s s u e ss u c ha s t h em a i nf e a t u r e so fi n s u l i nr e s i s t a n c e t h e p a t h o g e n e s i so ft 2 d mi s n o te n t i r e l yc l e a r ，r e c e n tr e s e a r c hf o u n dt h a te n d o p l a s m i c r e t i c u l u ms t r e s si n d u c e di n s u l i nr e s i s t a n c ei no b e s i t yo c c u p ya ni m p o r t a n tp o s i t i o n ，a n d t h et a r g e tt i s s u ei n s u l i nr e s i s t a n c ea n dp a n c r e a t i cbc e l ld y s f u n c t i o ni sc l o s e l yr e l a t e d ； s oe rs t r e s si no b e s i t yl e dt ot h er o l eo fi n s u l i nr e s i s t a n c ei nd i a b e t e sh a sb e c o m eah o t r e s e a r c hf i e l d e n d o p l a s m i cr e t i c u l u mi si m p o r t a n to r g a n e l l e sw i t h i nc e l l s ，t or e g u l a t e p r o t e i ns y n t h e s i sa n d f o l d e da f t e rs y n t h e s i sa n dg a t h e r ，i st or e g u l a t ec e l ls t r e s s r e s p o n s ea n dc e l lc a l c i u ml e v e lp l a c e s ，b u ta l s oc h o l e s t e r o la n dl i p i ds y n t h e s i s o f s t e r o i d sa n dm a n yp l a c e s i nh y p o x i a , o x i d a t i v es t r e s s ，a b n o r m a lg l y c o s y l a t i o n r e a c t i o n sa n dt h ei m b a l a n c eo fc a l c i u mh o m e o s t a s i ss u c ha st h er o l eo fv a r i o u sf a c t o r s ， t h en a s c e n tp o l y p e p t i d ec h a i nf o l d i n ga n da s s e m b l ym o d i f i c a t i o ni n t e r f e r e n c e ，w i l ll e a d t ou n f o l d e dp r o t e i ni nt h ee ri nt h ea c c u m u l a t i o nc a u s e sc e i l st op r o d u c ee n d o p l a s m i c r e t i c u l u ms t r e s s ，a n da c t i v a t e st h eu n f o l d e dp r o t e i nr e s p o n s es i g n a l i n gp a t h w a y ，l e a d i n g t oc e l li t s e l fb yc h a n g i n gi t st r a n s c r i p t i o na n dt r a n s l a t i o np r o c e s s ，t or e d u c ep r o t e i n s y n t h e s i s ，d e c r e a s e dp r o t e i ni n t ot h ee n d o p l a s m i cr e t i c u l u mc o n t e n t ，w h i l ei n c r e a s e si n t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u mm o l e c u l a rc h a p e r o n ea n df o l d e dp r o t e i n ，i n c r e a s e d e n d o p l a s m i cr e t i c u l u mp r o t e i nf o l d i n gf u n c t i o n s c e l l sa l s oc a nb eb yu p 。r e g u l a t i n g e n d o p l a s m i cr e t i c u l u mp r o t e i nd e g r a d a t i o np a t h w a yr e l a t e dg e n e sb i a o d a , j i as u u n f o l d e dp r o t e i nd e g r a d a t i o np r o c e s s ，i no r d e rt oi n c r e a s e c e l lz a i y o uh a if a c t o r so f s u r v i v a l e r si su n d e rs t r e s s t om a i n t a i nc e l lh o m e o s t a s i s ，t om a i n t a i nc e l ls u r v i v a l ， c e l la c t i v a t e dr e s p o n s em e c h a n i s m st op r o t e c tt h e m s e l v e s 6 s t u d yf o u n d t h a ta f t e r16w e e k so fh i g hf a td i e tc o m p a r e dt om i c ea n dm i c ew i t h n o r m a ld i e t ，f a t t yt i s s u ei nt h ee r so ft h es i g n s ，s u c ha sp r e kp h o s p h o r y l a t i o na n d j n ka c t i v i t yi n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y ，o b | o bm i c ea n dw i l d t y p em i c ec o m p a r e d ， a d i p o s et i s s u eo fp h o s p h o r y l a t e dp e r k a n di r e - l aw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e r ，a n dj n k a c t i v i t ya n dt h es p l i c i n go fx b p - 1a l s oi n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y ，t h e s ea r et i p so b e s i t y c a nl e a dt of a tc e l l se r s b u tt h eo c c u r r e n c eo fo b e s i t yi nt h ef a t t yt i s s u eo ft h er e a s o n e r sa r es t i l lu n c l e a r h o w e v e r ，t h ef o l l o w i n gh y p o t h e s i s ：i nt h ec a s eo fn u t r i t i o na n d e n d o p l a s m i cr e t i c u l u mi np r o t e i ns y n t h e s i s i n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yi n d u c e du p r ； e x c e s so fn u t r i e n t sc a nb eas i g n a lf o ri n d u c t i o no fe r si no b e s es t a t eu n d e r , f f al e v e l s w e r es i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d s t u d yf o u n dt h a ti nl i v e rc e l l sa n dp a n c r e a t i ci s l e tbc e l l s ， f f ac a ni n d u c eu p b u ti nt h ef a tc e l l s ，f f ai n t e r n a le rf u n c t i o nr e m a i n su n c l e a r ，i n 3 t 3 - l 1a d i p o c y t e s ，f f ac a na c t i v a t ej n k ，l e a d i n gt oi r t h eu p rc a na l s oa c t i v a t e j n k s of f aa n de r sm a yb eal i n k ；o b e s i t yo c c u r sw h e ne l l s o n er e a s o ni st h e l a c ko fg l u c o s es t a t u s ，w h i c hi nm a n yc e l l s ，i n c l u d i n gf a tc e l l sa r ec o n s i d e r e dt ob et h e i n c e n t i v ef o re r s f a tc e l l si no b e s i t y ，b e c a u s ec e l l si r , i n s u l i ns i g n a l i n gp a t h w a yi s i n h i b i t e d ，r e d u c i n gs u g a ri n t a k e ，c e l l si nt h ea b s e n c eo fg l u c o s eo ru n s t a b l es i t u a t i o n ， p r o n et os t r e s s h o s o g a is of o u n d t h a to b e s ea d i p o s et i s s u ei nm i c ea n dw i l dt y p em i c e ， h y p o x i aa p p e a r so b v i o u ss i g n so ff a tc e l l si nc u l t u r e ，h y p o x i ai n d u c e du p r s h o w e d i n c r e a s e de x p r e s s i o no fb i p ，e t c ，e l f 2 ap h o s p h o r y l a t i o na n di n c r e a s ei nx b p - 1 s p l i c i n g t h er o l eo ft h e s ev a r i o u sf a c t o r s ，m u t u a la d j u s t m e n t ，l e a d i n gt oo b e s i t yf a t c e l l se r s i no r d e rt oc o p ew i t ha n da d a p tt oe r s c e l l sn e e dan u c l e u sf r o mt h ee rt ot h e s i g n a lt r a n s d u c t i o np a t h w a yt oi n c r e a s et h ee rp r o t e i nf o l d i n gc a p a c i t y ，t h i sa p p r o a c h i st h eu p r u p ri n c l u d e st h r e es i g n a l i n gp a t h w a y s b y3t y p e so fe rr e s i d e n tp r o t e i n s s t a r t ：t y p e 一1e rt r a n s m e m b r a n ep r o t e i nk i l l a s ei r e l ，p k rl i k ee rk i n a s ep e r k ) a n d a c t i v a t i n gt r a n s c r i p t i o nf a c t o r6a t f 6 a n o t h e r r e c e n tr e p o r t s 舶md i f f e r e n tc e l l s w e r ei s o l a t e df r o mo t h e rt y p e so fs i g n a lr e c e p t o r sa n dp a t h w a y s u p rn o to n l y i n c r e a s e dt h en u m b e ro fe rm e m b r a n e sa l s oi n c r e a s e dw i t l lp r o t e i nf o l d i n ga n dp r o t e i n c h a p e r o n er e l a t e dt ot h en u m b e ro fm o d i f y i n ge n z y m e s a l s or e d u c e db yb l o c k i n g p r o t e i nt r a n s l a t i o nq u w a n ge r sp r o t e i n f i n a l l y u n f o l d e dp e p t i d e sa n dr e t u r nt ot h e c y t o p l a s mb ym e a n so ft h ep r o t e a s o m ed e p e n d e n td e g r a d a t i o n t h i sp r o c e s si sc a l l e d e r a s s o c i a t e dd e g r a d a t i o ne r a d h o w e v e r ，i ft h ef i n a ld o e sn o tr e s t o r et h en o r m a l 7 f u n c t i o no fe r f o re x a m p l e ，t h eu p rm a yl e a dt op r o l o n g e ds e v e r ea p o p t o s i s t h e r e f o r e ，o n c et h el o s sf u n c t i o ni sn o tc o r r e c t l yf o l d e dp r o t e i n si nt h ec e l ls u r f a c e t h e c e l l sm a yb eo r g a n i z e dv e r yq u i c k l yr e m o v e d i nr e c e n ty e a r s ，t h es t u d yf o u n d ，e r s a n di s l e tbc e l ls u r v i v a l ，a p o p t o s i sa n dr e l a t e dt ot h ei n c i d e n c eo fd i a b e t e s ，w h i l e d i a b e t e s ，h i g he r sa p p r o p r i a t es t a t ei n t e r v e n t i o nm a yb e c o m ean e w m e a n so f t r e a t i n g d i a b e t e s a tp r e s e n t ，a l t h o u g ht h ee r sh a sg r a d u a l l yb e c o m ei n v o l v e di nd i a b e t e s r e s e a r c hf o c u s ，b u tt h ee r s m e d i a t e di s l e tbc e l ld y s f u n c t i o na n di n s u l i nr e s i s t a n c ei n t h ee x a c tm e c h a n i s m ，e r so n s e ti nt h ed i f f e r e n tt y p e so fd i a b e t e sa n dd i a b e t i c c o m p l i c a t i o n si nt h er o l eo ft h ee n d o p l a s m i cr e t i c u l u mc h a p e r o n e s ，d i a b e t e st h e r a p y ， e r sa n dt h ec o m m o np a t h w a yo fd i a b e t i cc o m p l i c a t i o n s ，t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e n o x i d a t i v es t r e s s ，n e e dt ob ef u r t h e rc l a r i f i e d m a t e r i a l sa n dm e t h o d s g r a d e4w e e k - o l dm a l es p fw i s t a r3 0r a t sw e i g h i n g8 0 12 0 9 ，w e r ep u r c h a s e d f r o me x p e r i m e n t a la n i m a lc e n t e ro fc h i n am e d i c a lu n i v e r s i t y a d a p t i v ef e e d i n gr a t s a f t e r1w e e k ，w e r er a n d o m l yd i v i d e di n t on o r m a ld i e tg r o u p ( n cg r o u p ，n215 ) a n d h i 曲- f a td i e tg r o u p ( h fg r o u p ，n 215 ) n cg r o u pr e c e i v e db a s i cd i e t ，a sa c o n t r o lg r o u p h fg r o u pr e c e i v e dh i g hf a td i e t ，t h ee s t a b l i s h m e n to fi n s u l i nr e s i s t a n c ei nr a t s a f t e r10 w e e k s ，e a c hg r o u pr a n d o m l ys e l e c t e df i v er o w sh i g hp l a s m ai n s u l i n n o r m a lg l u c o s e c l a m p t oa s s e s si n s u l i nr e s i s t a n c ei nr a tm o d e l l e f tc o m m o nc a r o t i da r t e r ya c c e s sh e p a r i ns a l i n es y r i n g e ，t h er i g h tf e m o r a lv e i n a c c e s sa f t e rt e ew h ow e r ec o n n e c t e d 、析t l l4 0 m u m li n s u l i ni n j e c t i o n ( d a nm a i n u o n o r d i s k p r o d u c t s ) a n d 10 g l u c o s e i n j e c t i o n o f5 0m ls y r i n g e ，a f t e r w a r d s m i c r o i n f u s i o np u m p s t a n df o r3 0m i n , c o m m o nc a r o t i da r t e r yb l o o dt e s tb a s e do n b l o o dg l u c o s ea n dlm lo fb a s a li n s u l i n f i r s t ，i n s u l i ni n f u s i o n ，i n f u s i o nr a t e1 6 7m u k g 一1 m i n 1 ) ，e v e r y5 m i nld r o po fc a r o t i db l o o dg l u c o s et e s t ，w h e nb l o o ds u g a r ”( b a s e do nt h ev a l u eo f + 0 5 ) m m o l lg l u c o s ei n f u s i o nb e g i n s ，l o s en o t er a t ef r o m4 6m g k g 一1 m i n - 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