（动物营养与饲料科学专业论文）小麦蛋白alcalase水解物中免疫活性肽的研究.pdf

摘要 免疫活性肽能够增强机体免疫力，刺激机体淋巴细胞增殖，增强巨噬细胞吞噬 功能，提高机体抵御外界病原体感染的能力，降低机体发病率，抗肿瘤等重要的生 理活性，是一种重要的生物活性肽。课题选用a 1 c a l a s e 对小麦蛋白进行酶解，经测 定其具有刺激淋巴细胞增殖的免疫活性，经过进一步分离纯化得到最高活性的组 分。论文主要研究结论如下： 目前已报道的1 4 0 余种免疫活性肽其相对分子质量都较小，通常在肽链中含有 碱性氨基酸或在末端具有疏水性氨基酸。实验选用a l c a l e 水解小麦蛋白，研究 a j c a l a s e 水解小麦蛋白生产小麦肽的工艺条件，通过单因素和正交试验确定最佳条 件为：酶用量1 3 1 0 3 u 幢样品，p h 值9 5 ，温度6 0 ，底物浓度4 ，反应时间 1 0 0 m i n ；此时水解度为1 8 6 3 。测定水解物中小麦肽的相对分子质量大约分布在 1 4 7 d p l 5 4 8 d a 之间，其中相对分子质量小于6 0 0 d a 的占5 6 1 2 ，相对分子质量小 于2 0 0 0 d a 的占7 4 1 8 。 采用d a 2 0 1 c 大孔吸附树脂对小麦蛋白水解物进行脱盐处理，脱盐条件为 50 i 】珞h l 的小麦蛋白水解物以05 b v m 的流速上样、以1 b v ，1 1 的流速用去离子水洗 涤、1 b v m 的流速用7 5 乙醇解析，d a 2 0 1 一c 大孔吸附树脂对小麦蛋白水解物的脱 盐率为9 1 2 6 。通过体外淋巴细胞增殖法( m t t 法) 测得脱盐后的混合物对小鼠 脾淋巴细胞增殖具有一定的免疫刺激作用，当添加量为1 5 0 ug 和2 0 0 g 时差异 显著( p 0 0 5 ) 。 根据免疫活性肽通常含有碱性氨基酸这一性质，首先采用7 3 2 阳离子交换树脂 依据电荷对小麦蛋白a l c a l a s e 水解物进行分离，小鼠体外脾淋巴细胞增殖试验结果 显示在p h 8 和p 1 1 1 0 洗脱下来的组分b 和c 具有较高的免疫活性，s e p h a d e xg 1 5 对组分b 和c 进一步分离，c 3 与对照组相比脾淋巴细胞增殖最显著，半制备 r p h p l c 分离组分c 3 得到十二个组分，其中c 3 一l l 活性最高。液质联用分析c 3 一l l 得到两个单一组分，预测主要组分的相对分子质量6 1 72 ，氨基酸结构为 l 醅c y s p r o - v 砒研， 另一组分相对分子质量3 9 3 2 ，氨基酸结构为t y r - l e u _ v a i 。 关键词：小麦蛋白a j c a l a s e 酶解免疫活性肽m t t 法脱盐分离纯化 江南太学硕士学位论立 、b s t r a c t i f n m u n o p e p t i d e sa r cv e r yi m p o n a l l ta n dh a v em a n yi m u n em n c t i o n ss u c h a s s t i m u i a t el y m p h o c ”ep r 0 i i f c r a l i v e ，e n h a n c e 血ep h a g o c ”i ca c t i v i t yo fm a c r o p h a g e s ， k e e po 唱a n i s m 仔o mi n f e c t i o no f p a 【h o g e n y ，r e d u c et l t ci n c i d e n c eo f d i s e a s e ，明t i t u m o u a t l ds oo n 1 1 1p r e s e n ts t u d y t h ei r 啪u n o s t 面u l a t i n ga c t i v i t yh y d r 0 1 y s a t e sw e 代g o tf r o m t h ew h e a tp r o t e i nh y d r o i y z e db ya 1 c a l a s e b yas e d e so fs 印a r a t i n gw a y 御op e p t i d e s w e r ed r a 、v nf 如mt h eh y d r o l y s a t e s 1 1 h ef 0 1 i o w i n g sw e r et h er e s u l t s ： t b e r ew e r em o r ct h a l l1 4 0i m m u n o p e p l i d e sc o i j e c t e dni o o bl i k e _ 【h a tl h em o i e c u l a r w c i g h to f t h e s ei m m u n o p e p 廿d e sw e r ev e r ys m a 王i ，a i 】di ta l s os h o w e dt h a tt h eh y d m p h o b e a m i r i oa c j do nt h eb o 牡o ma 1 1 da i k a l l n ea m i n oa c i dw e r ei m d o r t a n ts t n l c t u r a l so ft 】1 e i m m u n 0 1 ) e p t i d e st h e nt h ep r e p a r a t i o nt e c r “q u e so f w h e a tp e p t i d e st 1 1 r o u g hh y d r o i y z i n g u ，b e a ti s o l a t e dp m t e m sb ya i c a l a s ew e r cs t u d i e d t h eo p t i m 啪h y d m i y s i sc o n d i t i o n s w e 诧d e t e r 商n e d ： d o s a g e so f z y m e1 3 1 0 。u 塘，p h 9 5 ， 6 0 ， s u b s t m t u m c o n c e n 订a t i o n4 ，h y d r o l y s i st i m el o o m i na 1 1 dt h eh y d r o l y z i n gd e 乒眙186 3 m o l e c u l a rw e i 吐to f 吐l eh v d r 0 1 v d a t e sw e r ed i s 仕i b u t e db e t w e e n1 4 7 d a 1 5 4 8 d a ，血 w h i c ht 1 1 em o i e c u l a r 、v e i g h tl e s st h a i l6 0 0 d aw e r e5 61 2 i 叩d2 0 0 0 d aw e r e7 4 1 8 s m a l lp e p t i d c sw e r e 廿1 em a m c o m p o n c n t ， b e f o r em ei m m u n o s t i m u l a t i n ga c 廿v i t yo ft h eh y d 0 l y s a t e sw a sa s s a y e d ，s a l tw a s r e m o v e db vd a 2 0 1 cm a c r o p o r o u sa d s o r d l i o nr e s m s t h er e s u l cs h o w e dt 1 1 a t5 0 m g ，m l w h e a t p r o t e i nh y d m l y s a t e sw a sc a i e do u tt or e m o v es a l tu s i n gad a 2 0 1 - cc o l u m ni n 05 b v mn o wr a t e ，t 1 1 e n 【h ec o l u u 1w a sw a s h e du s i n gw a t e ra n dw h e 耻p m t e l n h v d r 0 1 v s a t e sd e s o r b e db v7 5 e 也a n o li ni b v ，hn o wr a t e d e s a l tr a t i o w a sr e a c h e d 9 1 2 6 i nv i t r os t u d yo fm t tc o 】o 曲1 c 时，r e s i l 】t ss h o w e dt h a t w h e a tp r o t e i n h y d m l y s a t e sc a ne n i | 锄c el y m p h o c ”cp r o l i f h a t i v er e s p 0 玎s e se s p e c i a l l yw n h1 5 0 p ga n d 2 0 0 p g ( p a c ，其中辩添热量餐然 怒最主要的影响因素，随着加酶量的增加水解度的增强趋势减缓，假是其趋势减缓 让n骋赔盯伯蚯狂 一$一罨趟磐* 越南大学磁士学链论文 并不十分明显，所以为了能得到较商的水解度本实验选取d 3 为加酶量这因素韵 妤承乎。瀑度、p 联取赡物浓囊三个爨素懿姆承平分别为a 2 、溉移c 2 ，褥嫩好熬水 平缀合必a 2 8 2 c 2 妫。由予正交实验的9 个实验中不包括诧袋链缀台，衙以通过露 次实验，在反应温度6 0 、p h 9 5 、底物浓度4 、加酶量1 3 1 0 3 “g 样热条件下 邀行酶解，得囊静承解痿为1 8 6 3 。 2 ，毒3 承瓣麓豹羲葵黢分耩 表2 4 水解物的氨纂龋组成 r a b l o2 - 4c o n t e n to fa m i n oa c i d si nh y d r o l y s 8 t e s a l e 8 l a s e 拳解小麦援篷衣瑟物鹃氯基酸缓袋爨紊2 0 。葵中氨鏊酸鼹穗酸东毪较 大虢l e u 、n e 、p 酶、p 、觏亵a i 8 几种氨基酸酮含量势2 8 2 。碱洼氨罄酸h s 、 a 曜和d s 的含量为7 5 5 。 2 。毒莲求瓣秘懿禚瓣分子袋量势蠢 在水熊最佳条件下卵酶瘸量1 3 1 0 3 u 穗祥黼，p h 值9 5 ，温度6 0 ，底物浓 凄4 ，发应时阕l o g m i n ，a l a c 越矗s e 永鳞小麦黉巍酶求麓度舞1 8 ，6 3 ，嗣备所褥 求解物的棚对分子戚蕊分布测定终暴如图2 8 及袭2 5 ： 燮2 堪枣麦分离爨囊隶簿蘩懿籀黠努子鬟爨分帮凝 f 碴2 - 8m o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o no fp r o t e i ni s o l a t e sh y d r o l y d a t e s 第二章a l 谢a s c 东解，j 、麦蛋白籁鲁小麦歉 表2 5 小麦分离蛋白水解物相对分予质量分布 恸l e2 - 5 l e c u 王嚣w e i 砖t 击s 醢b 驻畦o no f 谢l e a 童p e 泌i s o 呈a t e 曲y 幽静l y 如l e 小分子活性肽对代谢和免疫性能方面的调控作用是很重要的，并飘目前研究所 褥潮豹免疫活夔黢豹程霹分予矮量篷都在这今范围之蠹弘l 。 小麦蛋白烈c a l a s e 水解物中肽的相对分子质量分布见图2 8 ，从图中可以看到水 解物中的小麦肽由不同相对分子质量的组分组成，小麦肽的相对分予质量大约分布 在1 4 7 d a 1 5 4 8 d a 之闻，不潮鞠对分子质爨的小麦肽在水解物中所占的跪例歹4 于表 2 ，5 中。歇表中掰以看出，j 、麦分离蛋鑫a l c a l a s e 东解物中占主要部分懿小麦获其穰 对分子质量小于6 0 0 d a ，占5 6 1 2 。相对分子质量小于2 0 0 0 d a 的肽的含量为 7 4 1 8 ，大于2 0 0 0 d a 的肽的含量仅为o 1 5 。此外，程小麦肽的混食物中还存在 小鼍：l e a 戆豹霞，占2 5 。6 7 。分辑这黧秘蔟霹襞是撂菇中含畜戆少量在紫终下 有吸收的小分予物质。 小肽是水懈物中的主要成分，实验中优化的水解条件达到了获得小分子肽段的 爨的。 2 5 本章小缩 根据在免疫活性肽肽链中通常含有碱性氨基酸或在末端具有疏水性氨基酸的特 惠，本章采怒a l c a l a s e 对小麦豢自遴厅酶然测备活性黢。援提免疫溪链默默毯较缎 的特点，研究a l c a l a s e 水解小麦蛋白生产滔性肽的工艺鬻件，同时对制备所得承解 物的相对分子髓量分布进行测定，小结如下： 1 、烈a c a l a s e 水瓣小麦蛋白的水释最佳条传为：酶用量1 3 1 0 3 “g 样黯，p h 值9 5 ， 滠菠6 0 ，底魏浓度4 ，爱废对闻1 0 0 赫鞋；东解寝为1 8 。密。 2 、小麦蛋白烈c a l a s e 水解物中小麦肽的相对分子质量大约分布在1 4 7 d 扣1 5 4 8 d a 之间，其中相对分子质量小于6 0 0 d a 的占5 6 1 2 。相对分子质量小于2 0 0 0 d a 的占 了4 1 8 。困戴，奎默是农鼹糍中兹主要成分。 江南大学硕士学