（农药学专业论文）毒死蜱在水中的光解和微生物降解研究.pdf

捅姜 本文以高压汞灯、紫外灯、太阳光为光源研究了毒死蜱在水溶液中的直接光 化学降解；并在高压汞灯下研究了p h 值、过氧化氢对其光解的影响，初步提出 了毒死蜱光解的可能产物和路径。同时，研究了d 3 ，d 1 两种降解菌对毒死蜱的 降解动力学，以及d 3 菌对不同浓度毒死蜱的降解作用和不同浓度的d 3 菌对毒死 蜱的降解作用。主要研究结果如下： 1 毒死蜱水溶液在高压汞灯、紫外灯、太阳光照射下的光解半衰期分别为 5 3 3 2 m i n ，4 3 1 4 3 m i n 。1 4 0 7 7 m i n 。 2 高压汞灯光照下，随着p h 值的提高，毒死蜱的光解速率逐渐加快，其半 衰期分别为5 7 4 6 m i n ，5 3 7 9m i n ，4 7 2 8m i n ，4 1 1 6m i n 。p h ：9 时的光解速 率常数是p i t - 4 时的1 3 9 倍。 3 在5 1 5 m o l l 的范围内，随着过氧化氢浓度的增加，毒死蜱的光解速 率不断地增大。但是，当添加浓度达到2 5 r e t o o l l 后，毒死蜱的光解速率反而降 低了，半衰期为3 4 1 6m i n ，反而大于添加浓度为1 5m m o l l 时的3 1 7 2m i n 。 4 h p t l c 扫描结果显示，毒死蜱在水中的光解产物有3 种。g c m s 的分 析结果只发现了一个产物峰。初步推断了毒死蜱可能的光解路线：毒死蜱的p - s 键氧化为p = o 键，形成产物a 0 ，o 一二乙基一0 一( 3 ，5 ，6 三氯一2 毗啶基) 磷酸 酯，产物a 脱去3 个氯原子，形成产物b 0 ，0 一二乙基一o 一( 2 一吡啶基) 磷酸酯。 而产物t c p 可能是毒死蜱的水解产物，也可能是产物a 的水解产物。 5 在毒死蜱的添加浓度为2 0 m g l ，菌悬母液的浓度均为c f u = 1 2 x1 0 ”个 m l 的条件下，d 1 、d 3 菌株对毒死蜱的生物降解半衰期分别为5 0 0 6 h 、1 0 4 5 h 。 6 当d 3 菌悬液的浓度为c f u = 1 2 1 0 ”个m l ，毒死蜱的浓度分别为1 0 m g l ， 2 0 m g l ，3 0 m g l 时，d 3 菌对其的降解速率常数分别为0 0 8 5 9 ，0 0 6 4 8 ，0 0 5 3 2 ， 其半衰期逐渐增大，分别为8 0 7 h ， 1 0 6 9 h ，1 3 0 3 h 。 7 当d 3 菌悬液的浓度分别为c f u = 0 2 4 1 0 ”个皿l ，c f u = l 。2 1 0 ”个m l ， o f u ：2 4 x1 0 ”个m 1 ，毒死蜱的浓度为2 0 m g l 时，其对毒死蜱的微生物降解速 率常数逐渐变大，半衰期分别为1 2 。1 7 h ，1 0 5 8 h ，9 8 6 h ，逐渐变小。 关键词：毒死蜱，水溶液，光解，光解产物，光解路径，微生物降解 a b s t r a c t t h ed i r e c tp h o t o l y s i so fc h l o r p y r i l o si na q u e o u ss o l u t i o ni r r a d i a t e db yh i 曲 p r e s s u r em e r c u f yl a m p ( h p m l ) ，u l t r a v i o l e tl i g h t ( u v ) a n ds u n l i g h tw e r ei n v e s t i g a t e d e f f e c t so f p h a n dh 2 0 2o np h o t o d e g r a d a t i o no fc h l o r p y r i l o sw e r es t u d i e d u n d e rh p m l n ep o s s i b l ep h o t o p r o d u c t sa n dp a t h w a yw e r ef o u n do u t a l s o t h e b i o d e g r a d a t i o no fc h l o r p y r i f o sb ym i c r o b ed 3a n dd 1w e r es t u d i e d 皿e b i o d e g r a d a t i o no fc h l o r p y r i f o sb ym i c r o b ed 3i nd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n sa n dt h e b i o d e g r a d a t i o no fc h l o r p y r i l o si nd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n sb ym i c r o b ed 3w e r e s t u d i e dt o o 1 t h ep h o t o l y s i sh a l fl i f eo fc h l o r p y r i f o si na q u e o u ss o l u t i o nu n d e rh p m l u v a n ds u n l i g h tw a s5 3 3 2 m i n ，4 3 1 4 3 m i n ，1 4 0 7 7 m i nr e s p e c t i v e l y 2 u n d e rt h ei r r a d i a t i o no fh p m l ，t h ep h o t o l y s i sr a t ec o n s t a n to fc h l o r p y r i f o s r e m a i n e dc o n s i s t e n tf r o ma c i dc o n d i t i o n st on e t r u a lc o n d i t i o na n di n c l - e a s e di n a l k a l i n ec o n d i t i o n s 3 w i t h i n5 15 r e t o o l l , w i t ht h ei n c r e a s i n gc o n c e n t r a t i o no fh 2 0 2 ，t h es p e e do f p h o t o d e g r a d a t i o no fc h l o r p y r i f o sw e r ei n c r e a s i n g w h e nt h ec o n c e n t r a t i o nw a s 2 5 m m o l l ，t h es p e e do fp h o t o d e g r a d a t i o nd r o p p e di n s t e a d t h e h a l fl i f eo f c h l o r p y r i l o sw a s3 4 1 6 r a i n 4 t h e r ew e r e3k i n d so fp h o t o p r o d u c t sd e t e c t e db yi - i p t l c o n eo ft h em i g h t p a t h w a yo f p h o t o d e g r a d a t i o nw a s 蛙一x 瓦鬯一q 七 t c p a b 5 t h eh a l fl i f eo fb i o d e g r a d a t i o no fc h l o r p y r i f o so f2 0 m g lb ym i c r o b ed 1 a n dd 3w a s5 0 0 6 h 、1 0 4 5 h r e s p e c t i v e l y 6 t h eh a l fl i f eo fb i o d e g r a d a t i o no fc h l o r p y r i f o so f1 0 ，2 0 ，3 0 m e 皿b y m i c r o b ed 3w a s8 0 7 h ，1 0 6 9 h ，1 3 0 3 hr e s p e c t i v e l y 7 t h eh a l fl i f eo fb i o d e g r a d a t i o no fc h l o r p y r i f o so f2 0 m g lb ym i c r o b ed 3 o fo f u = 0 2 4 1 0 ”，c f u = 1 2 1 0 ”，e f u = 2 4 1 0 ”w a s1 2 1 7 h ，1 0 5 8 h ，9 8 6 h n r e s p e c t i v e l y k e yw o r d s ：c h l o r p y r i f o s ，a q u e o u ss o l u t i o n ，p h o t o d e g r a d a t i o n ，p h o t o - p r o d u c t ， t h ep a t h w a yo f p h o t o d e g r a d a t i o n ，b i o d e g r a d a t i o n 1 1 1 英文缩略语 h p m l g k g n a g 腭 n g l m l u l g - i l m g - i 一1 n n l n m 1 1 1 1 1 1 h h p l c g c m s h f n c d t i 2 v t i c 1 0 缩语与略语表 英文全称 h i g hp r e s s u r em e r c u r yl a m p g r a m k i l o g r a m m i l l i g r a m m i c r o g r a m n a n o g r a m l i i r e m i l l i l i t r e ( s ) m i c r o l i t r e g r a m l i t r e m i u i g r a m l i t r e n a n o m e t e l m i l l i m e t e r m i n u t e h o u r h i g h 弦- r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y g a sc h r o m a t o g r a p h y - m a s ss p e c t l l l n l h i 曲p e r f o r m a n c e t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y d a y s t i m ef o r5 0 l o s s ；h a l f t i m e v o l u m e t o t a li o nc u r r e n tc h r o m a t o g r a m d e t e r m i n a t i o nc o e 伍c i e n t 中文 高雎汞灯 克 千克 毫克 微克 纳克 升 毫升 微升 克每升 毫克每升 纳米 毫米 分 小时 高效液相色谱 气谱与质谱联用 高效薄层析色谱 天 半衰期 体积 总离子流图 决定系数 独创性声明 本人声明所呈的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得安徽农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：丕逝 签字吼1 年6 月哆日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文 的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 文件，允许论文被查阅和借阅。本人授权安徽农业大学可以将学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存、汇编学位论文( 保密的学位论文在解密后适 用本授权书) 。 学位论文作者签名：玄虹 签字醐：1 铴月哆日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通信地址： 指导教师签名：缝 签字日期：c 7 年6 月够日 电话： 邮编： 刖旨 当今世界面临四大难题：人口问题，粮食问题，能源问题和环境问题。农药 的生产和使用对于解决全世界的粮食问题起到了重要的积极作用，在农业的稳定 生产和增产中也占据着不容忽视的地位。但是，若是不能科学合理的使用农药， 也会造成许多不良后果。农药污染已是我国影响范围最大的一种有机污染，不 仅污染土壤环境和农作物，还污染到地面水体，地下水以及海洋环境，直接威胁 着人类的生存环境和身体健康。其中，环境污染和农药残留已经日益引起人们的 关注和研究。 化学农药由于在防治农作物病虫草鼠害上，具有见效快、效率高、实施方便、 可大规模使用、且成本低、投入产出比高等特点，当有害生物爆发成灾之际，化 学防治几乎是唯一可以采取的措施，所以农药的应用在不断扩大。随着全球人口 的不断增长，同时由于工业的发展占地和地理环境受人为破坏等原因，致使耕地 面积的日益减小，为了满足人们不断提高的对农产品数量的需求，除调整农产品 结构、培育优良品种，改善种植技术外，农药的作用将日益显得更为突出。然而 对环境而言，农药毕竟是一种外源化学物质，在它为人类的生产作出重大贡献的 同时，它在环境介质中的残留和代谢也构成了对生态系统平衡的严重威胁，进而 会通过食物链和生物累积影响人类自身的健康。据王毓秀等的研究，已知的7 0 种可能干扰内分泌的化学物质中，农药就有4 0 余种，如甲草胺、对硫磷、六六 六等，并已研究得出不少化学农药中含有干扰人体和动物体内分泌的化学物质 2 口 农药使用后，一部分农药直接或间接残存于农作物、土壤、水体以及环境的 其他物体中，形成农药残留现象。农药残留是导致农药对环境污染和对生物危害 的根源，农药在环境中的残留量既与农药的品种使用量有关，也取决于农药在环 境中的消解规律。因此，研究农药在环境中的残留动态、降解转化和归宿，以便 更好地、更安全有效地利用农药则具有重要的现实意义。 农药在环境中的降解包括生物降解和非生物降解。生物降解就是通过生物的 作用将大分子有机物分解成小分子化合物的过程，它包括植物、动物和微生物的 活动和代谢的影响。非生物降解包括有机物受到光、热、水、环境中的化学物质 等的影响而产生的降解n ，。 1 农药光化学降解概述 农药光化学降解是农药在光的作用下发生的降解过程，该过程是农药使用 后在环境中主要降解途径之一，有关农药的光化学行为已越来越受到人们的重 视，农药光化学降解性质也已成为评价农药生态环境安全性的重要指标之一。 人们对农药光解的研究开始对集中在对光解产物的定性及毒性鉴定上，从2 0 世纪7 0 年代开始了对光解速率的研究和预测。z e p p w 3 和h e n d r y 。1 首先对农药 在液相和气相中的光解速率进行了深入研究，提出了农药直接光解和间接光解 速率的数学模型。 农药施用以后，无论是残留于植物表面还是进入土壤、水体或大气，均受到 太阳辐射而发生光化学降解，其实质是化合物接受光辐射能量后，光能转化到化 合物分子键上，使农药中的c - c 、c - h 、c - o 、c n 等键断裂而产生内部反应的过 程铲7 1 。农药在环境中的光解涉及农药使用的稳定性和残效，涉及其在环境中的 残留、转归和安全性评价。农药光解根据其分子吸收光能的方式不同分为直接光 解和间接光解两种类型。 1 1 直接光解 直接光解是指农药分子直接吸收光辐射能造成自身的裂解的方式“1 ： a 十h v 一斛一产物 农药或其它物质吸收适当波长的光能呈激发态分子，吸收光子的能量正好在 分子中一些键的离解能范围内，而导致键的断裂发生降解。直接光解是农药在纯 水或饱和烃中唯一的光化学转化机制哼1 。自从1 9 4 5 年g u n t h e r 首次提出杀虫 剂p ，p - d d t 在使用后易受自然光辐射而很快失去活性后“，农药的直接光解作 用受到普遍重视并相继在各类农药中展开，且在原来基础上通过对光强、介质等 一些因子的改变来研究些农药光解的规律，推断其光解动力学方程_ 1 “。如 陈锡岭等通过对叶青双溶液和晶体在不同光源下光解研究，得出液态叶青双更易 光解，且在日照下的降解速率大于紫外灯下的速率，而晶体则正好相反，根据紫 外扫描，推断是因为晶体和液体的吸收波长不同“。近年来，许多研究者又借 助一些n m r 、i r 、u v 、g c m s 、h p l c m s 等先进仪器设备，进行了光解产物的分 析鉴定，对光解途径和机理的探讨起到了重要的推动作用。”。 1 2 间接光解 有机化合物的分子结构不同，其离解能也有较大的差异，对离解能较高的分 子键，其离解时需要有较高的短波长光辐射旺2 1 。有机物分子吸收辐射光能后被 激发。其激发过程所传递的能量和光波长有关，即e = h v = h c ，波长越短， 能量越高，越有利于造成有机物分子光解与结构转化眨扪。由于到达地表的太阳 光波长 2 9 0 n m ，一些农药分子不能吸收2 9 0 n m 以上波长的光能发生降解，它们 主要是通过环境中广泛存在光能载体吸收光能、再通过载体能量的转移，造成农 药分子变成激发态而发生间接光解。间接光解包括光敏化和光猝灭2 种形式。 光敏化反应表达式为： 2 s + h v s 堆 s $ + p s + p 拳 p 宰一产物，p - 一农药，s - 咣敏剂 这种可以吸收光能又可以再释放能量的载体被称为光敏剂，是不能直接吸收 太阳光的化学物质唯一的光化学转化形式出1 。通常人们在研究光敏化反应时认 为，敏化通过光敏剂激发三重态进行，具体可分为2 种不同的过程。一种是光 敏化剂辐照后生成自由基、纯态氧等中间体，使农药分子与中间体反应：另一种 是光敏化剂激发三重态能量转移，使反应物分子发生反应眨卯。 与光敏剂作用相反的物质称为光猝灭剂，它是种可以加速电予激发态衰变 到基态或低激发态的物质，其作用过程为嘶1 ： p $ + q 一( p q ) 乖一p + q 宰 p 农药分子q _ 嘴灭剂 光敏剂和光猝灭剂都是光能的载体或受体，可改变农药的光稳定性，加速或 延缓农药的光解，对农药的环境安全性评价和污染治理有重要作用。 由于绝大部分农药分子本身的最大吸收光谱区为2 0 0 3 0 0 n t o 之间，其对自 然光能的吸收能力极弱或不能直接吸收，所以自然环境中农药的直接光解效应是 微弱的。而自然界中广泛存在的光敏剂和猝灭剂物质能促进或抑制农药的光解， 使农药的间接光解研究备受重视，尤其是农田水体的物质由于光照易产生h 2 0 2 、 过氧化物、自由基，都将不同程度地影响农药光解速度。p h s c h m i t t 等在探讨 腐殖质光解时得出h 。0 2 促进了腐殖质的光解旺”。 不同农药之间的相互作用在农药光解过程中也有体现。花日茂【2 8 】等以太阳 光、氤灯、高压汞灯为光源，研究了哒嗪硫磷、多菌灵、克百威、丁草胺4 种 农药对氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯3 种拟菊酯杀虫剂的光解速度及光解效 应的影响，结果表明：哒嗪硫磷、多菌灵对氯氰菊酯等3 种拟菊酯杀虫剂在3 种不同光源的光照处理下均表现出光敏降解效应：在太阳光及高压汞灯光源的光 照处理下。克百威和丁草胺对3 种拟菊酯杀虫剂具有光猝灭降解作用，太阳光 照射下3 种拟菊酯杀虫剂的光解率与其单位面积上的药剂剂量成反比：而哒嗪 硫磷等4 种农药对3 种拟菊酯杀虫剂的光敏或光猝灭效率与4 种农药的剂量成 正相关。花日茂等田】研究了9 种农药对丁草胺在水溶液中光猝灭降解作用，实 验发现苄嘧黄隆、乙草胺、氟乐灵、二甲四氯、草甘膦、甲磺隆、灭多威、甲基 对硫磷、多菌灵等9 种常用农药使除草剂丁草胺在水中的光解速度减缓，表现 出光猝灭降解效应，其中草甘膦、甲基对硫磷及乙草胺光猝灭效率较高，其光猝 灭作用强度与剂量成正相关。 2 农药的微生物降解概述 在生态系统中，微生物对农药的分解起着重要作用。农药微生物降解的研究 始于4 0 年代，在农药降解菌的富集分离，农药微生物降解的途径，农药降解酶 以及农药微生物降解的基因操作等方面取得了重要进展。了解生态系中降解农药 的微生物的分布状况，掌握农药微生物降解的规律，探明微生物的农药降解酶及 其遗传特征，有利于预测和控制生态系统中农药的污染动态。 目前，对于微生物降解农药的研究主要集中于细菌上，因此，对于细菌代谢 农药的机理研究得比较清楚。细菌降解农药的本质是酶促反应，即化合物通过一 定的方式进入细菌体内，然后在各种酶的作用下，经过一系列的生理生化反应， 最终将农药完全降解或分解成分子量较小的无毒或毒性较小的化合物的过程【3 0 - 3 1 1 。由于降解酶往往比产生该类酶的微生物菌体更能忍受异常环境条件，酶的降 解效率远高于微生物本身，特别是对低浓度的农药，所以，人们想利用降解酶作 为净化农药污染的有效手段。但是，降解酶在环境中容易受非生物变性，土壤吸 附等作用而失活【3 2 】，难以长时间保持降解活性，这限制了降解酶在实际中的应 用。 2 1 微生物在农药转化中的作用 一是矿化作用：有许多化学农药是天然化合物的类似物，某些微生物具有降 解它们的酶系。它们可以作为微生物的营养源而被微生物分解利用，生成无机物， 二氧化碳和水。矿化作用是最理想的降解方式，因为农药被完全降解成无毒的无 机物。二是共代谢作用：有些合成的化合物不能被微生物降解，但若有另一种可 供碳源和能源的辅助基质存在时，它们则可被部分降解，这个作用称为共代谢作 用类型 3 ”。共代谢作用在农药的微生物降解过程中发挥着主要的作用。 2 2 影响微生物降解农药的因素 2 2 1 微生物自身的影响 微生物的种类、代谢活性、适应性等都直接影响到对农药的降解与转化。很 多试验都已经证明，不同的微生物种类或同一种类的不同菌株对同一有机底物或 有毒金属反应不同【3 4 】。另外，微生物具有较强的适应和被驯化的能力，通过适 应过程，新的化合物能诱导微生物产生相应的酶系来降解它，或通过基因突变等 建立新的酶系来降解它。微生物降解本身的功能特性和变化是最重要的因素。 4 2 2 2 农药结构的影响 农药化合物的分子量、空间结构、取代基的种类及数量等都影响到微生物对 其降解的难易程度。一般地，高分子化合物比分子量小的化合物难降解，聚合 物、复合物更能抗生物降解，空间结构简单的比结构复杂的容易降解。现在的 环境污染物大多是人工合成的，自然界中本身不存在的生物异源有机物质，往往 对微生物的降解表现出很强的抗性，其原因可能是这些化合物进入自然界的时 间比较短，单一的微生物还未进化出降解此类化合物的代谢机制。微生物通过改 变自身的信息获得降解某一化合物的能力的过程是缓慢的，依靠微生物的自然进 化过程显然不能满足要求。因此，研究一些可以使微生物群体在较短的时间内获 得最大降解该类型异生物质能力的方法非常重要和迫切。 2 2 3 环境因素的影响 环境因素包括温度、酸碱度、营养、氧、底物浓度、表面活性剂等。微生物 或其产生的酶系都有一个适宜的降解农药的温度、p h 及底物浓度。k a s t n e r 【3 5 】 等认为营养对于以共代谢作用降解农药的微生物更加重要，因为微生物在以共代 谢的方式降解农药时，并不产生能量，需要其它的碳源和能源物质。通常情况下， 受农药污染的环境不能进行集中统一处理，农药污染环境化合物组成也很不稳 定，经常波动，这对于农药降解菌的生长非常不利，温度、p h 及湿度的波动也 很大，这都有可能会影响降解菌的生长【3 ”。 3 农药的降解机制研究现状 3 1 农药的光解作用机制研究现状 光猝灭和光敏化作用是农药光化学研究中具有重大应用价值的领域。从本质 上看，光猝灭和光敏化往往是一个能量传递过程的两个方面，即防+ a d + a 宰 类型的能量转移单线态之间、三线态之间的能量转移均可敏化a 成激发态舾， 同对猝灭d 宰。对于那些系阔窜跃效率低的化合物，三线态之间的能量转移更具 意义，光敏剂的作用机制主要是自由基和单线态氧理论【3 7 】。 在光降解的过程中，彻底使农药完全有效地矿化是不可能的，不可避免会 产生一系列的中间产物，有时这些中间产物比母体更有毒、更稳定，当光解实验 在很低浓度进行时，光解产物很难检测，因此，农药光解产物的预富集是必要的。 如液液分配( l l e ) 被用来萃取2 ，4 一滴等农药【3 8 】，固相萃取( s p e ) 被用来提取均三 氮苯类除草剂【3 9 1 、及异丙隆、敌草隆、杀螟硫磷、甲氧隆等农药4 0 1 。当然有一 些农药不需要预富集，可以直接进样分析。此时，样品需要过滤或净化以除去一 5 些残留的杂质。如光解实验中，五氯酚可以直接进样分析 4 t l 。 光解产物的分离与鉴定在农药光解中起着很重要的作用。不同农药光解产 物有不同的分离条件和鉴定方法，同一种农药的光解产物也可有不同的分离条 件，这种分离条件和提纯鉴定方法的选择除了参考该农药的分离方法外，还可参 考它的残留分析方法，重要的是依靠该农药的结构特征、分子极性、官能团等估 计被光解的部位，然后确定方法。 3 2 有机磷农药的微生物降解机制研究现状 有机磷农药是目前使用量最大的农药之一，有一定的残留期，易被微生物体 内的有机磷水解酶水鳃，因而可用微生物法进行去毒。国内的学者们对于有机磷 农药的污染研究起步较早，近年来由于环境污染问题的逐步升级，农药的污染特 别是有机磷污染得到了社会的广泛关注，陆续有新的有机磷降解方面的研究成果 问世，新的降解菌包括地衣芽胞杆菌( b a c i l l l u s l i c h e n i f o r m i s ) 4 2 1 、华丽曲 霉( a s p e r g i l l y u so r n a t u s ) 【4 3 】、甲基营养菌( a e r o m o n a ss p ) 4 4 1 等。王永杰 【4 2 】等利用原生质体融合的方法构建了广谱有机磷降解菌，可以同时降解甲胺磷、 对硫磷、敌敌畏、乐果；刘玉焕等从华丽曲霉中成功地提取和纯化了有机磷水解 酶，成为首例来源于真菌的磷酸三酯酶【4 3 j 。 微生物降解有机磷农药具有巨大的潜力并取得了很大的成功，但仍然存在很 多急待解决的问题：直接从环境中筛选获得农药降解菌速度较慢；菌株经常发生 变异导致降解能力丧失；投放到环境中的降解菌受到其它微生物种群的影响而导 致降解能力下降甚至死亡。所以，今后的微生物降解有机磷农药更应该朝着以下 研究方向进行：高效农药降解菌的开发，混合菌的培养，降解菌的固定化，农药 生物降解的模型定量化研究，如何使实验室条件下微生物降解与实际应用效果接 近，如何克服影响微生物降解效果的各项限制因子。 4 毒死蜱的理化性质及应用 自2 0 世纪9 0 年代中期，一些高毒类农药相继被禁用或限制使用，取而代之 以毒性较低的品种，毒死蜱即是取代品种之一【4 5 1 。 毒死蜱，英文通用名称c h l o r p y r i f o s ，化学名称0 ，0 - - - - 2 5 基一o _ ( 3 ，5 ，6 一 三氯一2 一吡啶基) 硫逐磷酸酯，商品名称乐斯本( 1 0 r s b a n ) 。化学结构式： 6 眩h 5 0 c 2 h 5 0 l 8 1 9 6 6 年由美国陶氏化学公司( d o wc h e m i c a lc o ) 首先开发。毒死蜱纯品 为白色晶体，具有轻微的硫醇味，熔点4 2 5 4 3 c 。在中性及酸性介质中较稳定， 在碱性介质或无机盐含量高的水溶液中会分解。在通常贮存条件下稳定。对铜和 黄铜有腐蚀性。不溶于水，2 5 c 时溶解度为2 m g l ，易溶于大多数有机溶剂。对 高等动物急性口服毒性中等，经皮毒性较低。大白鼠急性e l 服l d 5 0 1 3 5 m g k g ( 雌) ，1 6 3m g k g ( 雄) ；兔经皮l d s 0 2 0 0 0 m g k g 。对人体皮肤有明显的刺激作 用，对眼睛有轻微的刺激作用。在高等动物体内能很快降解为无毒物质。对鱼类 及水生动物毒性较高，虹鳟鱼l c s 0 1 5 m g l ( 9 6 h ，7 2 c ) ，对蜜蜂有毒。对害虫、 害螨具有触杀胃毒和熏蒸作用。在叶面上持效期较短，在土壤中持效期较长达 2 4 个月，药效不受土壤温度及施肥的影响。 毒死蜱主要制剂为4 0 7 乐斯本乳油、1 4 杀死虫蓝珠颗粒剂。可用颗粒剂 或采用毒土法防治蝼蛄、蛴螬、地老虎、蔬菜根蛆、甘蔗龟甲等土壤害虫。喷雾， 可防治粮食作物、大豆、花生j 棉花、果树、蔬菜、茶树、甘蔗、花卉等作物的 鳞翅目、鞘翅目、同翅目、半翅目害虫及螨类、蓟马等；还可以防治蚊、蝇、跳 蚤、蜚蠊等卫生害虫。涂抹施药用于家畜、家禽，防治微小牛蜱、跳蚤等体外寄 生虫。对一般作物安全，但烟草较敏感。 5 毒死蜱在水中的降解转化 通过各种施药方式暴露于环境中的农药，有1 0 2 0 附着在植物体，8 0 9 0 散落在土壤和水里以及飘浮在大气中【4 6 1 。而残留在土壤和水体中的农药又会通 过渗透作用进入地下水，造成水体污染，不仅对水生生物和水生态系统产生严重 影响，还会严重影响人类健康。因此，农药在水体中的降解行为是人们的重点研 究内容之一。b r o w e r ，g rf 4 7 l 于1 9 6 7 年报道了用臭氧降解水体中的污染物艾氏 剂( a l d r i n ) ，此后人们开展了大量有关农药在水体中降解途径及影响因素的研 究。农药在水体中主要通过3 种方式降解：微生物降解、化学降解和光化学降解 【删。 自然界水体中，毒死蜱的微生物降解很缓慢；水解速率随温度每升高1 0 而增加2 5 3 倍；水解速率随着水体p h 值的增加而加快。冬天或水体深处的毒 死蜱受到太阳光解的影响不大，水体表面的毒死蜱的减少主要是由于光解和挥 发。开放水体中，毒死蜱的浓度和保持性主要依靠剂型 4 9 - 5 3 1 。除此之外，毒死蜱 7 在自然水体中的降解和转归还受到很多其它因素的影响，要具体情况具体分析。 6 毒死蜱的主要降解产物 据文献报道毒死蜱的降解产物，m e i k l e 【5 4 】等检测到了沪乙基一o - ( 3 ，5 ，6 一三 氯一2 一毗啶基) 硫逐磷酸酯和3 ，5 ，6 一三氯一2 一毗啶酚( t c p ) 两种产物。c u s t a v o s 5 】 等检测到了0 ，0 一二乙基一o 一( 3 ，5 ，6 一三氯一2 一吡啶基) 磷酸酯，0 一乙基一0 一 ( 3 ，5 。6 一三氯一2 一吡啶基) 硫逐助磷酸酯，和t c p 三种产物。w a l i a 【划等检测到了 0 ，o 一二乙基一o 一( 3 ，5 ，6 一三氯一2 一吡啶基) 磷酸酯一种产物。申丽等【57 】检测到了 o ，o 一二乙基一0 一( 3 ，5 ，6 一三氯一2 一吡啶基) 磷酸酯，o ，o 一二乙基一o 一( 5 ，6 一二氯 一z 一吡啶基) 硫代磷酸酯，o ，o 一二乙基一o 一( 5 一氯一2 一吡啶基) 硫代磷酸酯，0 ，0 一二乙基一旷2 一吡啶基磷酸酯，和t c p 五种产物。j a l a l s s l 检测到了- - 7 , 基磷酸 酯，三乙基磷酸酯，0 ，o ，o - 三乙基硫代磷酸酯，0 ，o - z 乙基一o - 甲基一硫代磷酸 酯，二乙基一( 3 ，5 ，6 一三氯一2 一毗啶基) 硫逐磷酸酯，2 ，3 ，5 一三氯一6 一o 一乙基 吡啶，2 ，3 ，5 一三氯吡啶，和t c p 七种产物。也有研刭5 9 】只检测到了t c p 一种产 物。 7 研究的目的和意义 农药是水体中重要的污染物之一，研究水体中农药降解行为是预防和降低 农药对水体污染的主要环节。毒死蜱是一种国内普遍使用的杀虫剂，研究其在水 体中的光解和微生物降解动态及转归对于毒死蜱的实际应用有着重要的指导意 义。 本实验的研究目标就是找出毒死蜱在水中进行光解作用和微生物降解作用 时的产物，以及产物随着降解时间的变化而发生的质与量的变化，以便能够找出 降解路径，从而对降解机理能够有一个科学的解释。 材料与方法7 1 供试药品与试剂 农药：毒死蜱( c h l o r i p y r i f o s ) ( 纯度9 5 ，农药部农药检定所提供) ； 溶剂：乙腈( 高效液相色谱专用试剂，山东禹城化工厂) ；丙酮( a r 、上海建 信化工有限公司试剂厂) ；石油醚( 上海试一化学试剂有限公司) ；二氯甲 烷( a r 山东禹城化工厂) ，正己烷( 北京化学试剂公司) 培养基：牛肉青( 北京联利生物试剂厂) 、蛋白胨( a r 、天津市大茂化学试剂 厂) 、氯化钠( a r 、徐州试剂总厂) ；琼脂( 石狮市石狮有限公司) ； 磷酸氢二钾( a r 、上海化学试剂公司) 、磷酸二氢钾( a r 、宿州化 学试剂厂) 、硫酸铵( a r 、介山化工厂) 、硫酸钙( a r 、北京化学试 剂公司) 、硫酸亚铁( a r 、上海第二钢铁厂) 缓冲液：磷酸二氢钠( a r 、广东金砂化工厂) 、磷酸氢二钠( a r 、华东师范 大学化工厂) ，醋酸钠( a r ，、合肥工业大学试剂厂) 、醋酸( a r 、华 东师范大学化工厂) ，硼砂( a r 、上海建信有限公司试剂厂) 高效薄层板：1 0 l o a m ，6 f 2 5 4 ，中国青岛海洋化工集团 其它：无水硫酸钠为分析纯 2 主要仪器设备 高效液相色谱：a g i l e n t l l 0 0 型，配可变波长紫外检测器和h p 化学工作站。 高效薄层半自动点样器：c a m a g 公司 高效薄层扫描仪：t l cs c a n n e r 3 ，c a m a g 公司 气一质联用仪：日本岛津g c m sq p 2 0 1 0 无菌操作台：s w g - z f ，苏净集团苏州空气技术有限公司 恒温振荡摇床：伽z 一9 8 a ，太仓市华美生化仪器厂 电热恒温干燥箱：d h g - 9 0 5 3 a ，扬州三发电子有限公司 氮吹仪：n e c a p t m l1 2 ，o g a n o m a t i o n a s s o c i a t e s ，j n c 恒温培养箱：d h p - 9 0 8 2 ，上海一恒科技有限公司 电子天平：f a l l 0 4 型，上海天平仪器厂 磁力搅拌器：j d 一3 型，江苏姜堰市仪器厂 超声波清洗机：s b 3 2 0 0 型，上海b r a n s o n 公司 旋转式石英水冷光解仪：安徽农业大学环境光化学实验室自制。 9 3 实验光源 高压汞灯：1 5 0 w 管型高压汞灯( 上海电光器件厂) ，光照时石英管反应液距光源 1 5 c m 。 紫外灯：6 0 w ，安徽农业大学自制。 太阳光：合肥地区( n 3 1 8 。) 2 0 0 6 年5 “6 月之间的8 ：0 0 “1 7 ：0 0 的太阳光、 晴朗天气。 4 毒死蜱的分析条件 4 1h p l c 分析条件： a g i l e n t l l 0 0 一h p l ch y p e r s i lo d s 柱( 4 6 x 2 5 0 n m ，5 um ) ；可变波长紫外 检测器，检测波长2 3 0 n m ；流动相：乙腈水= 9 5 5 ；流速：1 o m l m i n ；柱温： 室温；手动进样，进样量2 0 i ll 。 4 2h p t l c 分析条件： t l cs c a n n e r 3 ，c a b l a g 公司。a p p l i c a t i o np o s i t i o n ：l o m m ，s o l v e n tf r o n t p o s i t i o n ：7 0 m m ，扫描波长：2 3 0 h m 。 5 紫外一可见吸收光谱的测定 紫外一可见吸收光谱测定用双束紫外一可见分光光度计，测定毒死蜱的吸收 光谱、反应体系的吸收光谱。 6 毒死蜱的光化学降解机理研究 6 1 毒死蜱标准母液的配置 用万分之一电子天平精密称取0 0 7 9g 的毒死蜱( 9 5 ) ，用乙腈溶解并定 容至2 5 ml ，得到3 0 0 0 m g l 的标准母液。根据需要，稀释成实验所需的溶液。 6 2 毒死蜱在不同光源下的光化学降解 6 2 1 光解反应液的配制 移取一定量的毒死蜱标准母液，加入到一定量的双重蒸馏水中，经磁力搅拌 器搅拌，混合平衡3 0 m i n ，得到l o m g l 的毒死蜱反应液。光解时移取l o m l 的 毒死蜱反应液于石英试管中，分别在不同光源下照光，并于不同时间点取样，然 后进行h p l c 分析检测。 1 0 6 2 2 高压汞灯下毒死蜱的光解 移取装有l o m ll o m g l 的毒死蜱反应液的石英管置于石英水冷光解仪中， 石英管距光源1 5 咖，光强9 0 0 0 l x ，照光体系通过电子继电器将反应体系的温 度控制在2 5 士i ；以铝箔包裹的为黑暗对照，同时置于光解仪内。每处理3 次重复。 6 2 3 紫外灯下毒死蜱的光解 移取装有l o m ll o m g l 毒死蜱反应液的石英管置于紫外灯下照光，石英管 距光源2 0 c m ，石英管与平面夹角为1 5 。，光强2 0 0 l x ，以铝箔包裹为黑暗对照， 同时置于紫外灯下光照，每处理3 次重复。 6 2 4 太阳光下毒死蜱的光解 移取装有l o m l1 0 m g l 毒死蜱反应液的石英管置于距地面1 5 米的平台上， 石英管于水平面的夹角约1 5 。，光强为3 5 0 0 0 4 6 0 0 0 l x ，黑暗对照以铝箔包裹放 在同一条件下光照，每处理3 次重复。 6 3 毒死蜱在不同p h 值溶液中的光化学降解 6 3 1 缓冲液的配制删： p h = 4 ，1 8 m l o 2 m o l l 醋酸钠+ 8 2 m l o 2 m o l l 醋酸： p h = 7 ，6 2 3 m l o 1 1 l l ( h 2 p 0 4 + 3 7 7 m l o 0 5 m o l l 硼砂溶液 p h = 9 ，1 7 5 m l o 1 m 0 1 几k h 2 p 0 4 + 8 2 5 m l o o s m o l l 硼砂溶液 6 3 2 光解液的配制 移取一定量的毒死蜱标准母液，分别加入到一定量的上述不同p h 值的缓冲 液中，经磁力搅拌器搅拌混匀，得到l o m g l 的毒死蜱反应液。光解时移取l o m l 的毒死蜱反应液于石英试管中，在高压汞灯下照光，每处理3 次重复，照光处 理同6 2 2 ，并设置双重蒸馏水对照。 6 4 过氧化氢对毒死蜱的光催化降解 移取一定量的毒死蜱标准母液，分别加入到一定量的5 m m o l l 、1 5 r m o l l 、 2 5 m m o l l 的h 。0 。溶液中，得到l o m g l 的毒死蜱反应液。混合平衡后，光解时 移取l o m l 的毒死蜱反应液于石英试管中，在高压汞灯下照光，过程同6 2 2 ， 并设置不添加h 2 0 。的对照。 6 5 毒死蜱在高压汞灯下光解的产物研究 6 5 1 高压汞灯下毒死蜱的光解 移取装有l o m l1 0 0m g l 毒死蜱反应液的石英管置于石英水冷光解仪中， 石英管距光源1 5 锄，光强9 0 0 0 l x ，照光体系通过电子继电器将反应体系的温 度控制在2 5 1 ；以铝箔包裹的为黑暗对照，同时置于光解仪内。每处理3 次重复。不同时间点取样，稀释后h p l c 分析。 6 5 2h p t l c 分析 6 5 2 1 反应液的提取 将毒死蜱光解后的反应液分别用5 m l ，3 m l ，2 m l 石油醚提取3 次，加入少量 无水硫酸钠，每次充分振荡5 m i n ，合并提取液并定容至l o m l ，h p t l c 分析。该 方法的添加回收率( 每处理重复3 次) 符合试验要求。 表1 石油醚提取毒死蜱光解液的添加网收 t a b l e1 r e c o v e r yo fc h l o r p 州f o s 添加浓度( r a g l )回收率( )变异系数( ) f o r t i f i e dc o n c e n t r a t i o n r e c o v e r y x sc v 2 09 5 2 7 1 4 81 5 l 4 09 7 1 4 1 0 32 0 7 6 09 9 3 8 0 9 71 1 2 6 5 2 2 高效薄层板的活化 用甲醇在展缸内润洗薄层板，全部湿润后，通风橱内晾干，然后放入烘箱， l1 0 。c ，3 0 m i n 。 6 5 2 3 点样 用丙酮配制l o o m g l 的毒死蜱标准溶液。用微量注射器吸取标样和6 5 2 1 中用石油醚提取后的反应液，点样量为4 0 0 0 n g ，带状点样，起始位置为l o m m ， 带宽为5 咖，间距为5 m 。 6 5 2 4 展剂的优化： 展剂中比例较大的称为底剂，极性相对较小，起到溶解物质和基本分离作用。 展剂中比例较小的极性相对较大，起到改变比移值的作用 6 1 】。先固定展剂中的 一种组分，然后按溶剂极性大小顺序和洗脱顺序依次摸索展剂中的另一组分，并 适当的改变体积比，以期得到最理想的展开剂体系。 a 乙酸乙酯：甲苯b 正丁醇：甲苯c 二氯甲烷：甲苯d 二氯甲烷：石油醚 1 2 6 5 2