（农药学专业论文）瑞香狼毒对菜粉蝶的生物杀虫活性及其作用机制初步研究.pdf

瑞香狼毒对菜粉蝶的生物杀虫活性 及其作用机制初步研究 农药学专业 研究生：张可君指导教师：侯太平 丫7 7 5 7 2 8 本文基于实验室前期进行的2 5 种有毒植物对菜青虫杀虫活性筛选研究，以 瑞香狼毒提取物系统研究了对菜粉蝶及其幼虫的生物杀虫活性，并对其作用机 制进行初步研究。以瑞香狼毒乙醇提取物、瑞香狼毒正己烷萃取物和瑞香狼毒 素为样品研究了瑞香狼毒对菜青虫的杀虫活性与拒食活性，以瑞香狼毒素来研 究触杀及胃毒活性，并仔细观察、详细记录了菜青虫的发病症状及死亡现象； 研究了瑞香狼毒正已烷萃取物对菜青虫生长发育影响、对菜粉蝶的生殖影响、 产卵忌避作用及对卵孵化的影响；研究了瑞香狼毒正己烷萃取物、瑞香狼毒素 对菜青虫体内乙酰胆碱酯酶活性的影响，以瑞香狼毒素来研究对羧酸酯酶活性 的影响。试验结果表明：3 种不同提取方法制备的瑞香狼毒，均显示了对菜青虫 较好的杀虫活性及良好的拒食活性，且在活性强弱上均可表达为瑞香狼毒素 瑞 香狼毒正己烷萃取物 瑞香狼毒乙醇提取物：瑞香狼毒素对菜青虫具有较好的触 杀括性及一定的胃毒活性，且触杀活性好于冒毒活性，同时，瑞香狼毒素对菜 青虫具有很好的选择性拒食活性及非选择性拒食活性，非选择性拒食活性要好 于选择性拒食活性；通过对菜青虫发病症状的观察，初步推测瑞香狼毒对菜青 虫的作用靶点为昆虫神经系统；瑞香狼毒对菜青虫的生长发育有较大影响，抑 制幼虫发育，并使由其发育成的蛹及羽化出的成虫畸形；瑞香狼毒对菜粉蝶生 殖抑制效果差、对卵孵化的抑制作用小( 即杀卵力不强) 、对莱粉蝶产卵有一定 的忌避作用：瑞香狼毒素对菜青虫体内乙酰胆碱酯酶具有较好的抑制作用，对 羧酸酯酶有定抑制效果。总之，综合上述生物杀虫活性试验及其观察与乙酰 胆碱酯酶活性试验的结果，推测昆虫神经系统是瑞香狼毒的杀虫作用靶标。 关键词：瑞香狼毒；菜青虫；杀虫活性；作用机制 t h eb i o a c t i v i t yo ft h ee x t r a c tf r o mt h er o o to f s t e l l e r ac h a m a e j a s m el a g a i n s tp i e r i sr a p a el a n dt h ep r e l i m i n a r ys t u d i e so nt h em e c h a n i s m m a j o r ：p e s t i c i d e g r a d u a t e ：z h a n gk e - j u n i n s t r u c t o r ：h o ut a i - p i n g t h eb i o a c t i v i t ya n dt h em e c h a n i s mo ft h et h r e ee x t r a c t sf r o mt h er o o to fs t e l l e r a c h a m a e j a s m ea g a i n s tt h ep i e r i sr a p a ew e r et e s t e db a s e do nt h es t u d i e so nt h e2 5 k i n d so fp o i s o n o u sp l a n ts p e c i e sa g a i n s tt h el a r v a eo fp i e r i sr a p a e t h r e ee x t r a c t s w e r et h ee t h a n o le x t r a c t ( s c e e ) f r o mt h er o o to fs t e l l e r ac h a m a e j a s m e ，t h en h e x a n e e x t r a c t ( s c n e ) f r o ms c e e ，t h ec h r o m a t o g r a p h i ce x t r a c t ( s c c e ) f r o ms c n e t h r e e e x t r a c t sw e r ea l lt e s t e df o rt h et o x i c i t ya n dt h ea n t i f e e d a n ta c t i v i t y t h ec o n t a c t t o x i c i t ya n ds t o m a c ht o x i c i t yo fs c c ea g a i n s tt h el a r v a ew e t et e s t e d s c n ew a s t e s t e df o r t h ei n f l u e n c eo fg r o w t ha n dd e v e l o p m e n to ft h e1 a r v a e ，t h ee f f e c to f f e c u n d i t y , t h eo v i p o s i t i o nd e t e r r e n ta c t i v i t ya n do v i c i d a la c t i v i t yo ft h ea d u l t s t h e i n h i b i t o r ya c t i v i t yo fa c e t y l c h o l i n e s t e r a s ea c t i v i t ya n dc a r b o x y l e s t e r a s ea c t i v i t yo f s c n ea n ds c c ew e r et e s t e d t h r o u g ho b s e r v i n gt h a tt h ep o i s o n i n gs y m p t o m ，t h e d e a dl a r v a e se x t e r n a lm o r p h o g e n e s i s ，w es t u d i e do rt h em e c h a n i s mo ft h et o x i c i t y t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee x t r a c t sf r o mt h es t e u e r ac h a m a e j a s m eh a d s i g n i f i c a n tg o o dt o x i c i t ya n ds t r o n g e ra n t i f e e d a n ta c t i v i t y , a n dt h eo r d i n a ls c a l eo ft h e t o x i c i t ya n dt h ea n t i f e e d a n ta c t i v i t yo f t h ee x t r a c t sb o t hw e r es c c e s c n e s c e e , a n dt h en o - c h o i c ea n t i f e e d i n gw a sb e t t e rt h a nt h ec h o i c ea n t i f e e d i n go ft h e e x p e r i m e n t a t i o no fa n t i f e e d a n ta c t i v i t yt r e a t e dw i t hs c c e a n dt h er e s u l t so ft h e e x p e r i m e n t a t i o no ft h ea d i o no ft h et o x i c i t yt r e a t e dw i t hs c c es h o w e dw e l lc o n t a c t t o x i c i t ya n ds o m es t o m a c ht o x i c i t y t h r o u g ht h eo b s e r v a t i o no ft h ep o i s o n i n g s y m p t o m ，w ep r e l i m i n a r i l yc o n j e c t u r e dt h ei n s e c t sn e r v o u ss y s t e ma so n eo ft h e e x t r a c t s t a r g e t s t h ee x p e r i m e n t a t i o no nt h eg r o w t ha n dd e v e l o p m e n ts h o w e dt h a t t h es c n eh a ds i g n i f i c a n tg o o di n h i b i t o r ye f f e c t s ，w i t ht h em o s tm a l f o r m a t i o no ft h e p r e p u p a ，t h ep u p a ea n dt h em a t u r e t h e r ew e r el i t t l ei n h i b i t o r ) , e f f e c t so ff e c u n d i t y s o m et h eo v i p o s i t i o nd e t e r r e n ta c t i v i t ya n dal i t t l eo v i c i d a la c t i v i t y a n dt h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h ee x t r a c t sh a db e t t e ri n h i b i t o r ya c t i v i t yo fa c e t y l c h o l i n e s t e r a s ea n d s o m eg o o di n h i b i t o r ya c t i v i t yo fc a r b o x y l e s t e r a s e i naw o r d ，t h et a r g e to ft h ee x t r a c t f r o mt h er o o to fs t e l l e r ac h a m a e j a s m ea g a i n s tt h el a r v a eo fp i e r i sr a p a ew a st h e i n s e c t sn c l w o u ss y s t e mb a s e do nr e s u l t so ft h es t u d i e so nt h eb i o a c t i v i t y , o b s e r v a t i o n o ft h ep o i s o n i n gs y m p t o ma n dt h em e c h a n i s mm e n t i o n e da b o v e k e yw o r d s ：s t e l l e r ac h a m a e j a s m e ，p i e r i sr a p a e ，t o x i c i t y , m e c h a n i s m 四川大学硕b 论文 前言 菜粉蝶p i e r s r a p a e l 的幼虫俗名菜青虫，属鳞翅目粉蝶科，是危害我国 蔬菜生长的最重要的全国性分布的害虫之一，每年发生1 0 代左右，尤偏嗜十字 花科蔬菜，如甘蓝、苤蓝、花椰菜、白菜、萝h 等，而这正是我国消费量最大 的蔬菜种类。菜青虫危害形成的创口成为软腐病发病的主要诱因，大规模发生 时，能将整株叶片吃光只余叶脉，给蔬菜种植业造成了巨大的经济损失，目前 尚无有效的生物农药对菜青虫进行防治。 瑞香狼毒s t e l l e r ac h a m a e j a s m el ，俗称断肠草、馒头花等，隶属于瑞香科 ( t h y m e l a e a c e a e ) ，狼毒属。瑞香科植物在世界上约有5 0 属5 0 0 余种，主要分布 于热带和温带地区，尤以非洲最多，我国有9 属9 0 余种植物，它们主要分布于 长江以南各地【1 】。狼毒属有6 种，分布于亚洲温带地区，在我国1 种1 2 】。瑞香狼 毒生长于海拔2 3 0 0 4 2 0 0 m ，年平均温度0 * c 左右的干燥向阳山坡，以及高山、 亚高山草地。它广泛分布于西北、西南、东北、华北各省，以及台湾省等地， 主要分布于青海省的天然草地，四川省的甘孜州、阿坝州天然草场以及凉山州 的西北部【3 ，4 i 。瑞香科植物大多数具一定毒性，对皮肤和粘膜刺激强烈。明朝李 时珍的本草纲目中记载“狼毒根有大毒，可杀飞鸟走兽”。瑞香狼毒全革有 毒，但以根的毒性最大1 5 。牛羊易发生误食中毒，马和其它家畜很少发生中毒， 牛羊误食中毒后，能引起呕吐、腹痛、腹泻、四肢无力、卧地不起、全身痉挛、 头向后弯、心悸亢进、粪便带血，严重时虚脱或惊厥死亡，母畜接触后可导致 流产，人接触时，可引起过敏性皮炎，根粉、花粉对人眼、鼻、喉有较强烈而 持久的辛辣性刺激【2 1 。瑞香狼毒与牧草争水、争肥、争空间，严重影晌草场利 用及牧草的品质与繁衍，引起草原退化，实为我国天然草场一大祸害【6 】。 我国3 0 年来的科研工作，研究出瑞香科植物中的主要化学成分有香豆素、 黄酮、二萜原酸酯和木脂类化合物等类型1 1 ”。瑞香狼毒的根含甾醇、氨基酸、 三萜类、蒽甙及有毒的高分子有机酸【“。另外，还发现其含有4 种香豆素，如 虎耳革素( p i m p i n e l l i n ) 、异虎耳革素( i s o p i m p i n e | l i n ) 、异佛手柑内酯( i s o b e r g a p t e n ) 、 牛防风素( s p h a n d i n ) ；3 种木酯体；多种二氢双黄酮1 9 - u l 等。近年来，又从该植 四川大学硕士论丈 物中分得伞形花内酯( u r nb e l l i f e r o n e ) 、d a p h n o r i t i n 以及锌、铜、砷、铝、福、汞、 钦、钒、镍等多种微量元素| 1 ”j 。 因而瑞香狼毒是一种需要防除的草地有毒植物，但同时研究发现瑞香狼毒 又含有高活性杀虫物质，可将其开发成为植物源农药【1 5 郴】。在本室前期工作中， 发现瑞香狼毒含有杀灭菜青虫的活性成分1 2 0 1 ，并从中分离出了高杀虫活性成分 瑞香狼毒素。 本研究以防治我国农业重要蔬菜害虫菜青虫为目的，较为系统的研究 了瑞香狼毒对菜青虫的杀虫活性、杀虫作用方式、拒食活性、对菜青虫的生长 发育影响、对菜粉蝶产卵的影响、对莱粉蝶产卵的忌避作用、对卵的孵化的影 响，并结合长期试验中对菜青虫经瑞香狼毒处理后发病症状的观察，将菜青虫 的发病症状进行归纳，并通过发病症状推测了瑞香狼毒在菜青虫体内的作用靶 标，继而对菜青虫体内的乙酰胆碱酯酶和羧酸酯酶活性的影响进行了研究，为 防治莱青虫研制新型农药提供理论依据，促进了高效植物杀虫剂的开发研制。 删川大学碗：1 7 论文 第一部分：瑞香狼毒对菜粉蝶幼虫杀虫活性的初步研究 摘要 采用浸叶法和注射法研究瑞香狼毒的3 种提取物，既瑞香狼毒乙醇提取物、 瑞香狼毒正己烷萃取物及瑞香狼毒素对菜粉蝶的幼虫( 菜青虫) 的杀虫活性。 在采用浸叶法研究瑞香狼毒杀虫活性的试验中，7 2 h ，瑞香狼毒乙醇提取物的 l c 5 0 为3 4 6 x 1 0 3m g l 1 、瑞香狼毒正己烷萃取物的l c s o 为1 1 7 1 0 3m g l 1 、瑞 香狼毒素的l c s o 为6 6 0 x 1 0 2m g l 1 ：在采用注射法进行瑞香狼毒对菜青虫杀虫 活性的试验中，7 2 h ，瑞香狼毒乙醇提取物的l d 5 0 为2 8 埘g ，头、瑞香狼毒正己 烷萃取物的l d s o 为2 5 耻g 头、瑞香狼毒素的l d s o 为o 8 即g ，头。这两种试验方 法的结果均表明，瑞香狼毒素对菜青虫的杀虫活性要高于瑞香狼毒乙醇提取物 及其正己烷萃取物，杀虫活性关系可表示为瑞香狼毒素 瑞香狼毒正己烷萃取物 瑞香狼毒乙醇提取物。 关键词：瑞香狼毒菜青虫杀虫活性浸叶法注射法 四川人学硕士论空 1 1 材料与方法 1 1 1 材料 1 1 1 1 供试药品 瑞香狼毒，采自四川阿坝州若尔盖草原，洗净晒干，粉碎为绒毛状干粉 无水乙醇；正己烷；二甲基亚砜；乳油6 2 0 2 ，金陵石化总厂生产。 1 1 1 2 供试昆虫 菜粉蝶( p i e r i sr a p a el ) 的幼虫( 菜青虫) ，试验前饥饿4 6 h ，来源为未 喷洒农药的甘蓝蘖田。 图1 1 菜粉蝶幼虫( 菜青虫) 图1 2 小菜蛾幼虫( 两头尖) 应注意在4 月及8 、9 月份田间采集时，将菜粉蝶的幼虫( 图1 1 ) 与小菜 蛾的幼虫( 图1 2 ) 进行区分。菜青虫头部及胴部背面青绿色，密布黑色瘤状小 突起，并生细毛，胴部腹面淡绿色而带白色，背中线黄色。每腹节各有4 5 条 横纹线，各气门线以上密生无色细毛。各体节在气门线上有两个黄色斑点，其 一为环状围绕着气门，气门淡褐色，围气门片黑褐色；小菜蛾老熟幼虫身体两 端尖细，里纺锤状，体节明显，臀足向后伸，因此又名两头尖。 采集幼龄幼虫皆停留在寄主叶背面剥食为害，虫龄增长后爬到叶片表面蚕 食叶肉组织，无钻心为害的习性，幼虫的活动受气温影响很大，盛夏多在叶背 取食，清晨、夜间、秋凉后多在叶面，根据以上菜青虫的形态特征及生活习性 在f f i 间察看，以便于田间采集。 四川大学硕士论文 1 1 ，2 实验方法 1 1 2 1 试验药品的提取方法 称取2 0 0 9 瑞香狼毒根千粉，用2 5 0 0 r a l 无水乙醇浸泡，室温冷浸2 4 h ，再 置于4 5 水浴浸提1 2 1 1 后过滤。减压旋转蒸发浓缩得乙醇提取物；用正己烷萃 取乙醇提取物，得到狼毒乙醇冷浸提取液的正己烷萃取物( 简称萃取物) ：将萃 取物层析纯化，得瑞香狼毒素。 以瑞香狼毒的乙醇提取物、正己烷萃取物、瑞香狼毒素为样品，分别以样 品：二甲基亚砜：乳油= 1 ：2 ：1 的比例，以超声波细胞粉碎仪充分乳化混匀， 作为处理液，备用。对照液以双蒸水：乳油：二甲基亚砜；1 ：1 ：2 的比例配制， 作为对照液，备用。 1 1 2 2 对菜青虫的杀虫活性测定 1 1 2 2 1 采用浸叶法研究杀虫活性 浸叶法，将甘蓝叶片浸于药液中，晾干后，放于养虫笼中饲喂菜青虫。 将乙醇提取物样品处理液用水梯度稀释为2 5 0 x 1 0 4 、5 0 0 x 1 0 3 、1 6 7 x i 0 3 、 5 5 6 x i 0 、2 7 8 1 0 z m g l 1 浓度； 将正已烷萃取物样品处理液用水梯度稀释为6 2 5 x i 0 3 、2 0 8 x 1 0 3 、6 9 4 x 1 0 2 、 3 4 7 x l 旷、1 7 4 x 1 0 2 m g l - 1 浓度； 将瑞香狼毒素处理液用水梯度稀释为5 o o x l 0 3 、1 0 0 x 1 0 3 、5 o o x l 0 2 、 2 5 0 x 1 0 2 、1 2 5 x 1 0 2 m g l 1 浓度。 将对照液按相同梯度稀释。 选用3 龄试虫，每组2 0 头虫，重复3 次。处理后连续观察，分别于2 4 、4 8 和7 2 h 记录发病及死亡情况，计算出校正死亡率。 1 1 2 2 2 采用注射法研究杀虫活性 注射法f 2 1 1 ，用微量注射器取样品处理液2 a l ，从菜青虫胸部背板3 、4 节处 将药液注射到其体内。 将乙醇提取物的样品处理液用水梯度稀释为2 5 0 x 1 0 4 、8 3 3 x 1 0 3 、2 5 0 1 0 3 、 8 3 3 x 1 0 2 、4 1 8 x 1 0 2m g l - 1 浓度： 将正己烷萃取物样品处理液用水梯度稀释为1 5 0 x 1 0 4 、3 7 5 x i 0 3 、1 5 0 1 0 3 、 7 5 0 x l 、5 o l x l o 。m g l - 1 浓度； 四川大学硕士论文 将瑞香狼毒素样品处理液用水梯度稀释为8 3 3 x 1 0 3 、2 7 8 x 1 0 3 、9 2 6 x 1 0 2 、 3 0 9 x 1 0 2 、7 7 2 x 1 0 m g l 1 浓度。 将对照液按相同梯度稀释。 选用5 龄试虫，处理后于养虫笼中以新鲜甘蓝叶片饲喂。每组2 0 头虫，重 复3 次。处理后连续观察分别于别、4 8 和7 2 h 记录发病及死亡情况，计算出 校正死亡率。 用a b - b o t t 校正死亡率公式，计算死亡率，机率对数绘图法做毒力回归曲线 计算致死中浓度( l c s o ) 及致死中量( l d 5 0 ) 。 校正死亡率( ) = 1 2 试验结果 1 2 一浸叶法 处理组死亡率一对照组死亡率 卜对照组死亡率 1 0 0 在采用浸叶方法进行瑞香狼毒对菜青虫的杀虫活性试验中，结果如下： 瑞香狼毒乙醇提取物的试验结果见表1 1 ，7 2 h 的l c 3 0 为3 4 6 x 1 0 3m g l - 1 ； 瑞香狼毒正己烷萃取物的试验结果见表1 2 ，7 2 h 的1 - 1 2 5 0 为1 1 7 x 1 0 3 m 酽l - 1 ；瑞 香狼毒素的试验结果见表1 3 ，7 2 h 的l c s o 为6 6 0 x 1 0 2m g - u 1 。 表1 1乙醇提取物的杀虫活性 浓度校正死亡率( ) ( m g l - 1 ) 2 4 h 4 8 h7 2 h 2 5 0 1 0 46 7 2 7 2 37 8 7 5 0 0 1 0 。4 1 74 7 2 5 9 8 1 6 7 1 0 62 8 33 1 8 3 8 7 5 5 6 1 0 。1 6 2 1 8 72 3 2 2 7 8 1 0 8 3 3 1 0 01 0 0 毒力回归式y = 1 4 2 9 2 + 0 9 1 5 2 xy = 1 5 1 7 2 + 0 9 2 6 4 x y = 1 3 0 5 2 + 1 0 4 3 9 x 相关系数0 9 9 7 30 9 9 7 80 9 9 1 5 l c ( m g l 。)7 9 7 x 1 0 35 7 5 x 1 0 3 3 4 6 x 1 0 3 比较表1 1 、表1 2 、表1 3 的数据，见图1 3 ，该组试验表明了瑞香狼毒素 一 塑型：= ! ：；兰翌主兰兰 _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ - _ - _ _ _ _ - _ _ 一。 对菜青虫的致死中浓度低于其它2 种，杀虫活性要高于瑞香狼毒乙醇提取物及 其正己烷萃取物，杀虫活性关系可表示为瑞香狼毒素 瑞香狼毒正己烷萃取物 瑞香狼毒乙醇提取物。 表1 2 正己烷萃取物的杀虫活性 诹万二：二二二二二丑暨重要正二二二二二 ( m g l - 1 ) 2 4 h 4 8 h 7 2 h 2 0 8 x 1 0 34 0 2 5 2 26 4 2 6 9 4 ( 1 0 22 3 7 2 9 8 3 4 8 3 4 7 1 0 2 1 3 81 6 7 2 5 0 1 7 4 1 0 26 。】7 1 2 7 1 4 。7 毒力回归式y = 0 8 4 9 2 + 1 1 8 8 8 x y = 1 1 0 6 2 + 1 1 9 3 6 xy = 1 0 1 9 0 + 1 2 9 7 6 x 相关系数 l c ( m g u 1 ) 0 ，9 9 6 8 3 1 6 1 0 3 0 9 9 5 6 1 8 3 1 0 3 0 9 9 7 8 1 1 7 x 1 0 3 表1 3 瑞香狼毒素的杀虫活性 浓度 t 校正死亡率( ) 1 0 0 1 0 34 1 75 7 2 6 8 3 5 0 0 1 0 22 5 0 3 6 34 5 7 2 5 0 1 0 21 3 2 2 i 72 7 2 1 2 5 1 0 。6 8 71 5 31 8 3 毒力回归式y = 1 2 3 4 8 十1 1 2 4 8 x y = 1 ，7 7 0 2 + 1 0 6 1 l x y = 1 6 2 2 4 + i 1 9 7 9 x 相关系数0 ，9 8 4 6 0 9 7 9 80 9 7 8 1 l c 。( m r l - 1 )2 ，2 3 1 0 。 1 i 1 1 0 66 6 0 1 0 。 1 2 2 注射法 在采用注射方法进行瑞香狼毒对菜青虫的杀虫活性试验中，结果如下：瑞 香狼毒乙醇提取物的试验结果见表1 4 ，7 2 k 的l d s o 为2 , 8 m g ，头；瑞香狼毒正 己烷萃取物的试验结果见表1 5 ，7 2 h 的l d 5 0 为2 5 l p 头；瑞香狼毒素的试验 结果见表1 6 ，7 2 h 的l d s o 为o 8 趴头。一 比较表1 4 、表1 5 、表1 6 的数据，如图1 4 ，表明瑞香狼毒索对菜青虫的 杀虫活性明显要高于瑞香狼毒乙醇提取物及其正己烷萃取物，杀虫活性关系亦 可表示为瑞香狼毒素 瑞香狼毒正己烷萃取物 瑞香狼毒乙醇提取物。 四川大学砸上论文 表1 5 正己烷萃取物的杀虫活性 3 0 0 x 1 07 4 78 6 39 l 8 7 5 0 4 5 26 3 77 2 7 3 0 03 3 3 4 1 35 3 3 1 5 02 6 83 4 7 4 3 7 1 0 21 7 22 7 2 2 7 。2 毒力回归式y = 4 0 8 4 0 + l - 0 3 5 8 x y = 4 3 4 8 8 + 1 _ 1 5 1 0 xy = 4 4 7 8 7 + 1 - 3 0 5 8 x 相关系数0 9 8 8 70 9 9 4 2 0 9 9 3 5 l d 5 0 ( 腿头) 7 6 6 3 6 82 5 1 室! ：! 堕量塑耋塞塑鲞皇煎竺 药量 校正死亡率( ) ( 恬头)2 4 h4 8 h 7 2 h 1 6 7 1 0 7 3 7 8 2 39 5 7 5 5 6 4 7 86 0 0 7 3 8 1 8 53 1 3 4 0 86 6 3 6 1 8 1 0 2 3 2 3 2 74 4 2 1 5 4 1 0 1 2 2 1 4 71 6 3 毒力回归式 y = 4 4 2 8 9 + 0 8 5 6 1 xy = 4 6 7 1 4 + 0 9 1 3 2 x y = 5 0 6 7 2 + 1 2 6 5 1 x 相关系数0 9 8 0 70 9 8 7 5 09 8 9 7 l d * ( 咆头) 4 6 52 2 9o 8 8 综上所述，出图1 3 及图1 4 ，2 组试验均表明瑞香狼毒3 种提取方法所提 出的含有瑞香狼毒有效物质的提取物，均对菜青虫有杀虫活性，且杀虫活性关 系可表示为：瑞香狼毒素 瑞香狼毒正己烷萃取物 瑞香狼毒乙醇提取物。 8 醑川大学硕士论文 ： 罩7 i6 ： 墓； 图1 3 瑞香狼毒3 种提取物对菜青虫 的致死中浓度 蜀乙醇提 取物 正己烷 萃取物 d 瑞番狼 毒素 图1 4 瑞香狼毒3 种提取物对菜青虫 的致死中量 1 3 讨论与小结 1 3 1 讨论 在供试昆虫的田间采集上，要注意菜青虫与其它蔬菜害虫的区别。在进行 试验之前，最好将采集的菜青虫在室内饲喂过夜，以保证试虫对室内环境有个 适应过程，以避免试虫在生存环境突然改变之后立即进行药效试验而产生的试 验误差。另外在饲喂过夜后，在试验前挑选依然活泼的生命力旺盛的菜青虫来 进行饥饿，以作为正式的试验备选试虫。 在试验中，观察到死亡的试虫虫体僵直萎缩或成“c ”形弯曲状，头尾部多 上翘，部分试虫中肠脱出肛外。在进行的注射法试验中，处理组的试虫伤口处 多有黑斑，且聚集在伤口外流出的体液为黑色；而对照组伤口外的体液依然为 浅绿色，伤口处也无黑斑。表明瑞香狼毒对菜青虫虫体有着确实的影响，且中 肠脱出肛外的情况说明可能存在胃毒的作用。 在进行浸叶法的试验中发现，大量试虫爬到养虫笼的顶端或远离甘蓝菜叶 端，而且在处理2 4 h 之前甘蓝菜叶很少被取食，考虑瑞香狼毒对其含有一定的 避忌作用，应该设计相关试验来验证瑞香狼毒对菜青虫的具体拒食作用大小。 3 种提取方法得到的的不同瑞香狼毒均对菜青虫具有杀虫活性，处理组与对 照组试虫相比，有些试虫发育迟缓，特别在注射组中发现到很多没有像对照组 那样化蛹，已经化蛹的多为黑褐色，不像对照组中的蛹那样最初是浅绿色而后 老熟为褐色，表现出畸形；而在浸叶法中有些试虫又相较于对照更早的进入了 蛹期，考虑是由于取食过少，虫体的自我保护机制促使自身提前进入蛹期。 四川大学硕士论文 另外，在田间采集的饲养在实验室的菜青虫中，还发现有些菜青虫的虫体 悬吊在大的养虫笼的纱罩上，死亡，虫体为灰黑色，还有些虫体软化，一碰既 化为一滩浓水，查阅资料考虑是感染寄生菌等而导致其死亡；还有些菜青虫的 虫体，由它的体内向外钻出体型很小的蛆，将虫体蚕食的千疮百孔，最后干瘪 而死，特别在5 、6 月份极其多见，在养虫笼内发现黄色的茧( 见图1 5 ) 及从 中羽化出黑色昆虫( 见图1 6 ) ，考虑为寄生蝇，经观察发现它产卵在菜青虫体 内，其幼虫9 睁化后蚕食菜青虫。虽然天敌昆虫及病原菌、病毒等在对菜青虫的 生物防治上有着极其重要的意义，但对于室内利用菜青虫进行药效试验而言却 很不利，因此要密切注意饲养菜青虫的环境卫生及防治寄生昆虫潜入养虫笼。 图1 5 寄生蝇的茧 1 3 2 小结 图l _ 6 寄生蝇 1 、3 种不同提取方法制备的瑞香狼毒，即瑞香狼毒乙醇提取物、瑞香狼毒 的正己烷萃取物、瑞香狼毒素，在对菜青虫的杀虫活性上，7 2 h ，瑞香狼毒乙醇 提取物的i , c 5 0 为3 4 6 x 1 0 3m g l - 1 、瑞香狼毒正己烷萃取物的l c 5 0 为1 1 7 x t 护 m g l 1 、瑞香狼毒素的l c 5 0 为6 6 0 x 1 0 2m g l 1 ；在采用注射法进行瑞香狼毒对 菜青虫杀虫活性的试验中，7 2 h ，瑞香狼毒乙醇提取物的l d s o 为2 8 l a 头、瑞 香狼毒正己烷萃取物的l d s o 为2 5 m g , 头、瑞香狼毒素的l d 5 0 为0 8 舡头。因 此在瑞香狼毒的3 种不同提取方法所得的物质的杀虫活性强弱可表示为：瑞香 狼毒素 瑞香狼毒正己烷萃取物 瑞香狼毒乙醇提取物。 2 、需要对瑞香狼毒的具体杀虫作用方式进行研究，鉴于瑞香狼毒素的杀虫 活性最好，可以选用瑞香狼毒素进行试验，根据试验现象可以初步对触杀活性 及胃毒活性进行研究。 3 、在杀虫活性的初步研究中，观察到了一些发病症状及死亡现象，需要在 下面的试验中更仔细的观察，详实的记录发病情况，作为继续试验的重要参考。 另外，在试验中发现处理组的菜青虫发生了拒食现象，需要进一步试验研究。 四川大学硕士论：史 第二部分：瑞香狼毒素对菜青虫的触杀和胃毒活 生研究 摘要 以瑞香狼毒素研究瑞香狼毒对菜青虫的触杀活性和胃毒活性。采用f a o 推 荐的微量点滴法研究触杀活性、以叶片夹毒法和灌喂法研究胃毒活性。7 2 h 触杀 活性的致死中量( l d s o ) 为0 9 6 # g 头 致死中浓度( l c s o ) 为3 8 2 x 1 0 3 m g l 1 在胃毒活性试验中，7 2 h 叶片夹毒法的 灌喂法的l d s o 为3 8 0 g 头。试验表明， 瑞香狼毒有效成分，即瑞香狼毒素对菜青虫具有较好的触杀活性和一定的胃毒 活性，且触杀活性高于胃毒活性。 关键词：瑞香狼毒素菜青虫触杀活性 胃毒活性 叫川大学硕士论文 2 1 材料与试验方法 2 1 1 材料 2 1 1 _ 1 供试药剂 瑞香狼毒根采自四川若尔盖草原；乳油6 2 0 2 ，金陵石化总厂生产；其它均 为分析纯。 2 1 1 2 试虫 菜青虫，采自本室甘蓝试验田，从中选择虫体均匀一致的3 龄幼虫，试验 前饥饿6 h 时。采用灌喂法研究胃毒活性的试验中要选用4 龄幼虫。 2 1 2 试验方法 2 1 2 1 药品配制 样品处理液以瑞香狼毒素：二甲基亚砜：乳油= 1 ：2 ：1 的比例配制，用超 声波细胞粉碎仪充分乳化均匀，备用。对照液以双蒸水：二甲基亚砜：乳油= 1 ： 2 ：1 的比例配制，各用。 2 1 2 2 瑞香狼毒素对菜青虫的触杀活性 采用f a o 推荐的微量点滴法吲，来进行瑞香狼毒索对菜青虫的触杀活性的 试验研究。每头幼虫点滴躯l 后，放于养虫笼中，饲喂洁净甘蓝叶片。 将瑞香狼毒素样品处理液用水梯度稀释为6 2 5 x 1 0 3 、2 0 8 x 1 0 3 、6 9 4 x 1 0 2 、 2 3 1 x 1 0 2 、7 7 2 x 1 0m g o l l 浓度。将对照液按相同梯度稀释。 2 1 2 3 瑞香狼毒素对菜青虫的胃毒活性 分别采用叶片夹毒法和灌喂法1 2 ”，研究瑞香狼毒素对菜青虫的胃毒活性。 叶片夹毒法：以直径2 c m 的打孔器，打取叶碟，将药液均匀涂抹在叶碟一侧， 并将2 片叶碟带毒- - f l u 用明胶粘合，形成夹毒叶碟，饲喂菜青虫。灌喂法：用 微量注射器分别取私l 样品处理液灌喂4 龄菜青虫，处理后饲喂洁净甘蓝叶片。 将瑞香狼毒素样品处理液用水梯度稀释为5 0 0 x 1 0 4 、1 6 7 x 1 0 4 、5 5 6 x 1 0 3 、 1 8 5 x 1 0 2 、6 1 7 x 1 0 2m g l 1 浓度。将对照液按相同梯度稀释。 四川九学硬j ：论文 在触杀活性及胃毒活性试验中，均采用每组2 0 头虫，重复3 次。处理后连 续观察，分别于2 4 、4 8 和7 2 h 记录发病及死亡情况，计算出校正死亡率。 用a b b o t t 校正死亡率公式，并将死亡率转化为机率值、样品梯度处理液的 浓度转化为对数，用机率对数绘图法做毒力回归曲线，求出毒力回归方程，并根 据毒力回归方程计算出相应的致死中浓度( l c s o ) 、致死中量( l ，d s 二、 校正死亡率( ) = 2 2 试验结果与分析 处理组死亡率一对照组死亡率 卜对照组死亡率 1 0 0 2 2 1 触杀活性 采用点滴法测定样品处理液的触杀活性，结果见表2 1 。7 2 h 的l d 5 0 为o 9 6 头；在1 2 5 1 0 头的处理组中7 2 h 的校正死亡率为9 2 2 ，显示了瑞香狼 毒素对菜青虫具有较好的触杀活性。 表2 1 瑞香狼毒素对菜青虫的触杀活性 药摄 校正死亡率( ) ( 头) 2 4 h 4 8 h 1 磊 2 2 2 瑞香狼毒素对菜青虫的胃毒活性 2 2 2 i 灌喂法研究瑞香狼毒素对菜青虫的胃毒活性 采用灌喂法研究瑞香狼毒素对菜青虫的胃毒活性，结果见表2 2 ，7 2 h 致死 中量为3 8 0 g 头；1 0 0 x 1 0 2p g 头处理组，7 2 h 校正死亡率为9 6 8 。由灌喂 法的试验结果来看，表明瑞香狼毒素对菜青虫具有胃毒活性； 羽j i l 大学硕士论文 表2 2 灌喂法研究瑞香狼毒素对菜青虫的胄毒活性 孬疆 校正死亡率( ) ( r t g 头) 2 4 h 4 8 h ! 垫 一 1 0 0 1 0 2 7 7 2 8 5 39 6 8 3 3 4 1 05 8 8 7 2 88 5 2 1 1 2 1 0 4 6 75 9 77 4 7 3 7 0 1 9 34 0 0 。 4 9 3 1 2 3 9 2 1 9 82 6 8 毒力回归式 y = 3 5 8 0 8 + 1 1 0 2 7 xy = 4 1 4 8 8 + 0 9 6 8 0 xy = 4 2 6 5 6 + 1 _ 2 6 6 6 x 相关系数 9 9 9 2 00 9 9 2 5 0 9 8 2 6 l d ( 头) 1 9 47 5 73 8 0 2 2 2 2 叶片夹毒法研究瑞番狼毒素对菜青虫的胃毒活性 叶片夹毒法研究胃毒活性的试验结果见表3 ，7 2 h 致死中浓度为3 8 2 x 1 0 3 m g l - 1 ；5 0 0 x 1 0 4r a g * l 1 浓度处理组，7 2 h 菜青虫的校正死亡率为9 1 2 。叶片 夹毒法的试验结果依然表明瑞香狼毒素对菜青虫有胃毒活性。 表2 3 叶片夹毒法测瑞香狼毒素对莱膏虫的胃毒活性 浓度 校正死亡率( ) ( m g r )2 4 h4 8 h7 2 h 5 0 0 1 0 45 7 8 8 2 39 1 2 1 6 7 x 1 0 4 0 05 8 37 8 8 5 5 6 1 0 42 8 24 5 85 7 8 1 8 5 l 仃1 5 3 2 7 7 3 5 7 6 1 7 1 0 26 3 0 1 2 21 6 0 毒力回归式 y = 0 9 5 6 1 + 1 0 4 0 3 x y = 0 9 5 4 6 + 1 0 4 0 7 xy = o 6 2 0 7 + 1 2 2 2 3 x 相关系数0 9 9 7 4 0 9 9 3 20 9 9 9 6 l c 钟( m g l 。1 ) 2 8 9 1 0 7 7 1 1 0 33 8 2 1 0 3 比较表2 2 和表2 3 ，发现两种试验方法表现出的胃毒活性具有较大差异， 灌喂法试验所表现出的胃毒活性远大于叶片夹毒法的，究其原因，是给药途径 的差晃。在进行叶片夹毒试验时，通过试验观察发现瑞香狼毒索产生使菜青虫 不取食或取食量明显减少的拒食、避忌等作用，导致菜青虫的取食量极少，因 而实际摄取到它体内的瑞香狼毒素微乎其微。而在灌喂法研究胃毒活性的试验 中，则是把瑞香狼毒素一一次性灌喂到菜青虫体内。给药途径的差异最终造成了 菜青虫摄取有毒物质的量上的差别，从而造成了2 组试验数据的较大差异。 四川大学顾士论文 比较表2 1 和表2 2 中2 4 、4 8 和7 2 h 时各自最高浓度处理组的校正死亡情 况：在灌喂法研究瑞香狼毒素对菜青虫的胃毒活性试验中，1 0 0 1 0 2 g 头处理 组校正死亡率分别7 7 2 、8 5 f 3 、9 6 8 ；在瑞香狼毒素对菜青虫的触杀活性 的研究中，1 2 5 1 叽g 头处理组2 4 、4 8 、7 2 h 的校正死亡率分别为6 2 2 、7 3 2 、 9 2 2 。灌喂法研究胃毒活性的施药量是e 虫杀活性中的8 倍，而前者的死亡率仅 略高于后者的。同时比较表2 1 和表2 2 中2 4 、4 8 、7 2 h 时的致死中量( l d 5 0 ) ， 触杀活性试验中的l d 5 0 值分别为6 8 4 、3 3 0 、0 9 6 肛g ，头；而胃毒活性中的l d 5 0 值分别为1 9 4 、7 5 7 、3 8 0 肛g 头。因而不论是从校正死亡率来看还是从致死中 量来比较，都说明瑞香狼毒素的触杀活性要好子胃毒活性。 综上所述，瑞香狼毒索对菜青虫具有较好的触杀活性与一定的胃毒活性， 且触杀活性高于胃毒活性。 2 2 3 对菜青虫发病症状及死亡现象的观察 施药后连续动态观察，发现胃毒活性及触杀活性试验中，菜青虫经过瑞香 狼毒素处理后，表现出相同的发病症状：处理初期取食很少，爬至远离甘蓝叶 端或爬行到养虫笼顶；养虫笼内的保湿滤纸上留有绿色水渍，经观察为菜青虫 吐出的体液；处理组养虫笼内的粪便有些为红色，而对照组的粪便为深绿色或 浅绿色( 经长期试验观察，粪便颜色的深浅与取食的甘蓝叶颜色有关。未成熟 的甘蓝，叶片深绿，粪便为深绿色；成熟的甘蓝菜球才浅绿色，粪便为浅绿色。) 菜青虫在处理后有以下发瘸症状：一般在处理后会有段时间出现不取食或 取食很少等拒食现象；有痉挛现象出现( 见图2 1 ) ，头胸或头胸尾翘起，不停 的抽搐；虫体的体节皱缩、发黑( 见图2 2 ) ，还发现有麻痹症状( 见图2 3 ) ， 即僵直或侧卧躺倒不动，貌似死亡，但经针刺仍有微弱反应；死亡后，虫体弯 曲为头尾翘起的“c ”型( 见图2 4 1 或“v ”型。 经观察将菜青虫的中毒发病症状归纳为潜伏期、兴奋期、痉挛期、麻痹期 及死亡5 个阶段。中毒症状的几个时期可按以下的特点加以区别，一般症状： 忌避，尾节发黑，吐胃液，头胸、尾昂举，痉挛，体躯缩小。面从潜伏期到死 亡的各阶段的中毒症状亦有差异，具体如下： 潜伏期，接触农药后活动仍看似正常或接近正常； 兴奋期，活动异常，如拒食、乱爬、避忌等，不取食及避忌现象尤为明显； 1 5 四川大学硕上论文 痉挛期，强烈痉挛、挣扎，吐液，排粪异常，如红色粪便或粪不成形等 麻痹期：体躯或皱缩或僵直，经针刺有反应，背管有微弱的搏动； 死亡期：针刺全无反应，背管停止搏动。 图2 1 处理组菜青虫痉挛现 图2 2 处理组菜青虫体节皱缩发黑 图2 ，3 处理组菜青虫的麻痹现象 图2 4 处理组菜青虫的死亡形态 菜青虫在“痉挛期”和“麻痹期”所表现出的抽搐、虫体皱缩及麻痹等现 象，可能与以下原因有关：一作用于菜种或几种对神经兴奋传导起关键作用的 酶( 如乙酰胆碱酯酶) 【2 7 l ；二作用于神经轴突及突触神经传导的受体【2 8 。7 1 。根据 菜青