（动物营养与饲料科学专业论文）鸡组织中链霉素残留检测方法的研究.pdf

吉林农业大学硕士学位论文 鸡组织中链霉素残留检测方法的研究 鸡组织中链霉素残留检测方法的研究 中文摘要 本试验选用吉林德大养鸡场一日龄肉仔鸡6 0 只进行饲养，肉仔鸡随机分成 3 组，每组2 0 只，分别作为空白组、空白添加组，供试组取样材料。饲养7 周 后分别取不同的组织进行不同处理后检测。 本研究采用柱前衍生化方法、紫外检测器的高效液相色谱法( h p l c ) 检测鸡 组织中链霉索的残留量，优化了样品的前处理方法和高效液相色谱条件( 包括流 动相的组成和流速) ，同时优化了前处理过程中洗脱液和提取液的用量。试验方 法的建立主要包括衍生化试剂的选择、衍生化条件和检测波长的确定、衍生化产 物稳定性的研究、色谱条件的建立、标准曲线的制备和加标回收试验。色谱条件 的建立包括对流动相的组成、比例、流速、缓冲液p h 值、柱温和进样量的确定。 结果表明：( 1 ) 通过试验确定了l ，2 一萘醌一4 一磺酸钠和氢氧化钠为最佳衍生 化试剂，在4 5 。c 条件下反应1 0 m i n 衍生化完全，并且在2 5 2 n m 波长处有特征性 的最大吸收，衍生化产物在5 h 内相对稳定。( 2 ) 色谱条件通过对各项参数的筛选， 表明：流动相为v ( 乙腈) ：v ( 醋酸盐缓冲液p h = 3 3 ) ：v ( 水) = l o ：1 0 ：8 0 ，流速 o 3m l m i n ，缓冲液p h 值为3 3 ，柱温3 5 ，检测波长2 5 2 n m ，进样量2 0 l 为 最佳检测条件。( 3 ) 前处理条件的筛选主要针对沉淀剂和洗脱液用量不同，筛选 最佳用量。结果表明：采用沉淀剂( 5 5 m 1 三氯醋酸) 沉淀蛋白质，洗脱剂( 1 0 m l 甲醇) 洗脱，3 种不同组织添加不同浓度标准溶液时测定回收率为添加2 0 0 垤m l 、1 0 0 “g m l 、5 0 垤m l 浓度时平均回收率分别为7 5 9 0 ，7 0 8 6 ， 6 4 7 5 ，变异系数均l o 。( 4 ) 同试样没1 0 个平行样进行检测，计算其变 异系数为5 7 2 ，说明该方法的重现性较好。( 5 ) 通过添加不同浓度的标准溶液 检测出最低检测限为肌肉1 2 0 o o “g k g ，肝脏1 2 3 0 0 k g ，。肾脏2 1 8 0 0 扯g k g 。 该指标符合兽药残留检测方法的要求。 关键词：链霉素，柱前衍生化，紫外检测器，高效液相色谱法 吉林农业大学硕士学位论文 鸡组织中链霉素残留检测方法的研宽 s t u d yo nt h ed e t e c t i o nm e t h o do fs t r e p t o m y c i ni k s i d u e s i nc h i c k e nt i s s u e s a b s t r a c t a e x p e r i m e n ts e i e c t e d t 0 1 - d a y s o l dc h i c k e n s t or a i s e f 沁mj i l j d ed a f a r m ，a n dr a n d o m l y d i v i d e di n t o3 9 r o u p s ，e v e r ) g r o u pc o n t a i l l e d2 0c h i c k e n s t h e3g r o u p sw e r ci h ec 伽仃o lg m u p t 1 1 ea d d i l l ge x p e r i m e n tg m u p ，a n ds 蜘p l i n ge x p e r i m e n tg r o u pa f t e r7w e e k s ，t h ed s s u e ss a m p l e s 、v e r et a k e nf r o mt | l cc h i c k e n s ，d o i n gd e f b r c n ld e a la i l dd e t e c t i l l gt h et i s s u e s h p l cw i t h p r e - c o l u m n d e r i v a t i s a t i o na l l du l t r a v l o l e td e l e c t i o nw a su s e dt od e t c c t s 仃e p t o m y c i nr e s i d u e si nc h i c k e nt i s s u e sd e t e c t i o nc o n d i t i o n s o fh p l ca n dd i s p o s a lm e t h o do f s a l n p l ei n c l u d i n gt h ep r o p o r t i o na n ds p e e do fm o b i l ep h a s e ，d o s a g eo fs o l u t i o na n de l u t i o nw c r e o p t i m i z e dt h es e n i n go fm e t h o di n c l u d e dt h es e l c c t i o no fd e r i v a t i v er e a g e n t ，c o n d i t i o n so f 捌v a t i v ea n dd e t e c t i o nw a v e l e n g t l l ，t h es t i l d y i l l go fs t a b i l 崎o fd e r i v a t i v ep r o d u c t ，s e n i n go f c o n d i t i 0 1 l so fh p l c ，t h em a l ( i n go fs t 柚d a r dc h a r t s 锄dr e c o v e r ye x p 舐m e n tt h es e n i n go f c o n d i t i o n s o fh p l ci n c l u d e d l ep r o p o r t i o n 柚ds p e e do fm o b i l ep h a s e ，p ho fb u 如rn u i d ， e m p e r a n l r eo f c o l u ma t i dq u a n t i t yo f i n j e c t i o n ( 1 ) t h er c s u l t ss h o w e dt h a tl ，2 _ b e t ac o n s i g 咖e n t - 4 一h u a n g s u a l l n aa l l ds o d i u mh y d r o x i d e w e r et 1 1 eb e s td e r i v a t i v er e a g e n tb yt e s t m gt h er e s p o i l s ei sc o m p l e t e l yi n1 0m i no f4 5 。c a n d t l l e r ca r ei d e n t 时t h el a r g e s ia b s o r bw h e nm ew a v e l 铋g t hi s2 5 0 n mt h ed e “v a t i v ep m d u c ti s r c l a t i v e l ys t a b i em 5h o i l r ( 2 ) b ys c r e e n i n gt l l ec o n d i t i o n so fh p l ct oa l lp a r 舢e t e r s ，t h er e s u l t s ：t h e r ei sab e s t d e t e c t i o nc o n d i l i o l lw h e nt h ep r o p o n i o na i l ds p e e do fm o b l i ep 1 1 a s ei sa c e t o n i 们l e ，a c e t i ca c i d b u 能rs 0 1 u t i o na n dw a t e r ( 1 0 ：1 08 0 ) ，s p e e di s03m l m i n ，b 仰陆n u i dp hi s33 ，t e m p e r a 兀l r eo f c o l u mi s3 5 0 c ，w a v e i e n g t hi s2 5 2n m ，q u a n t 时o f l n j e c t i o ni s2 0u l ( 3 ) t h ed i s p o s a ic o n d i t i 伽so fs a m p l ei n c l u 曲1 9t h es e l e c t l 衄o fp r e c l p i t a n ta n dd o s a g eo f e l u e n tt h er e s u l t s ：d e t e r m i n e dt h er e c o v e “e s o ft i l r e ed i 伍：r e n tt i s s u e sa 1 1 dd i 骶r e n ta d d i t i o n c o n c e n 缸甚t i o nu s i n gp r e c i p i t a n t ( 5 ，5m l ) 锄de l u a n t ( 1 0m l ) t h er e c o v e r i e sw e r e7 5 曲o ， 7 0 1 扣8 6 a n d6 4 扣7 5 w h e na d d i t i o nc o n c e n 仃a 吐o n sw e r e2 0 ( ) 肚g ，i l l l ，1 0 0 “g n 1 l ，5 0 “g m l 吉林农业大学硕士学位论文 鸡组织中链霉素残留检测方法的印：究 t h ec o e m c i e n to f v a r i a t i o ni s 曼l o ( 4 ) t h ec o 娟c i e n to fv a r i a t i o ni s57 2 c 伽i n gf r o mt h es a m es a m p i e st l l er e p e a t a b i h t yo f m e t h o di sg o o d ( 5 ) e 玢a d d l i l gd i f r c r e n tc o n c e n 仃a t i o na n dd c t e c t i n gt h em i n i m u md e t e c “o nl i m i t ，t 1 1 em u s c l e1 s 1 2 00 0 肛g 瓜g ，l i v e ri s 1 2 3 0 0 p g 瓜g ，k m d yi s2 180 0 “g ，l ( gt h e ym e e tt h er e q u e s to fv e t e r i n a r y p r o d u c t sr c s i d u et e s t l n gm e t h o d k e yw o r d s ：s 打e p i 伽l y c i n ，p r e c o i u m nd 撕v a t i s a t i o n ，u l t r a v i o l e td e t e c t i o n ，h p l c i i i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：薹疵久 签字日期：加年月胗日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解吉林农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意吉林农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 学位论文作者签名 导师签名： 劫瓦砧 罕锹 签字日期：神，年z 月2 日 签字日期：? 矽砂多年f 号l 日 吉林农业大学硕士学位论文鸡组织中链霉素残留检测方法的研究 第一章前言 兽药残留引起的食品污染问题不仅与公众的健康密切相关，而且直接影响产业界 的经济利益和国际贸易。2 0 世纪7 0 年代以来，畜牧业生产中抗生索、抗菌素、卜氏 促进剂等兽药和药物添加剂的长期大量使用，造成了不同程度的兽药在动物体内的残 留，这些残留的药物通过动物性食品进入人体和生态系统，进而影响了人类和环境的 健康。动物性食品中的药物残留问题直接影响着动物性食品的安全卫生问题，已经成 为当前供认的农业和环境问题。链霉素( s t r e p t o m y c i n ) 是一种广谱抗生素，曾作为饲料 添加剂和治疗动物疾病在畜牧业上j 。泛应用，在降低动物发病率与死亡率、促生长、 提高饲料利用率和改善产品品质等方面的作用十分显著，己成为畜牧业发展不可缺少 的物质基础。但是，由于链霉素长期用于治疗动物疾病和作为药物添加剂的使用会导 致动物体内药物的滞留和蓄积，并对人类和环境的健康产生了一系列的危害【l “”。1 “。 美国在2 0 世纪7 0 年代就开发研究了在屠宰场使用的快速、廉价的检测方法，通过残 留检测控制，使药物残留超标率连年降低【_ ”。我国动物性食品中兽药残留的检测工作 起步较晚，开始重视兽药残留问题是在2 0 世纪9 0 年代。目前我国采用的微生物法检 测链霉素残留存在着耗时长、准确性和稳定性差等缺点，且不能与国际需要接轨【8 、9 】。 目前，鸡肉组织中的链霉素残留分析方法国内尚未见报道。本试验进行了鸡组织中链 霉素残留检测方法的试验研究。 1 链霉素在畜牧生产中的应用 1 1 链霉素的理化特性 链霉素( s t r e p t o m y c i n ) 是从放线菌属的灰链丝菌( s t r e p t o m y c e s g r i s e u s ) 的培养 液中提取的抗生素。链霉素是氨基糖苷类抗生素( a g s ) 中常用的药物，在临床上一般 用其硫酸盐。有三个碱性中心，属于碱性化合物，极性高。易溶于水，难溶于酸，不 溶于甲苯和氯仿，白色粉末。具有旋光性，左旋。在水溶液中呈现碱性，且以离子形 式存在，带正电荷。 1 2 链霉素的作用机理 链霉素为杀菌性抗生素，敏感菌与药物接触后，细胞内的成分外逸，迅速死亡。 吉林农业大学硕士学位论文鸡组织中链霉素残留检测方法的研究 其作用机理为影响蛋白质，生成异常蛋白质的结果。链霉素对结核杆菌和多种革兰氏 阴性杆菌( 如人肠杆菌、沙门氏菌、布鲁氏菌等) 均有抗菌作用。 1 3 链霉素的临床应用 链霉素主要用- f 治疗各种敏感菌所致的急性感染症，如由大肠杆菌引起的乳腺 炎、肠炎等，由巴氏杆菌引起的牛出血性败血症、犊牛肺炎、猪肺疫、禽霍乱等；还 可用于治疗牛的结核，胎孤菌性流产、放线菌病；家禽的呼吸道感染( 肺炎、咽喉炎、 支气管炎等) 、泌尿道感染；鸡的白痢、传染性鼻炎、急慢性呼吸道感染等。链霉素 可以削弱鸡小肠、盲肠消化器官内有害微生物，并使肠壁变薄，有利于养分渗透和吸 收，增加动物食欲，增加采食量，同时，可刺激脑下垂体分泌激素，促进发育1 。另 外链霉素还曾经作为药物添加剂广泛应用于畜牧业生产中。 2 链霉素残留对人类的危害 链霉素的大量长期使用造成了在动物体内的滞留和积蓄，并通过动物性食品影响 着人类和环境的健康，进而对人类和环境的健康造成危害。其主要危害体现在以下方 面： ( 1 ) 毒理作用：氨基糖苷类抗生素如链霉素、庆大霉素和卡那霉素主要是损害前庭 神经和耳蜗神经，导致眩晕和听力减退。链霉素又具有潜在的致畸作用。 ( 2 ) 诱导耐药菌株：诱导耐药菌株是使用亚治疗剂量抗微生物药最受关注的方面。 亚治疗剂量抗微生物药及其造成的药物残留对人体健康的影响可以分为两个方面。其 一，易于诱导耐药菌株特别是携带多抗性r 质粒的菌株，这些耐药菌株能够通过食 物链向人传播。其二，组织残留可能干扰人肠道内的正常菌丛和诱导耐药的病原菌株。 ( 3 ) 变态反应和过敏反应：能引起变态反应的药物不多，其中包括青霉素类，磺胺 类，四环素类和氨基糖苷类。轻度的变态反应和过敏反应仅引起皮炎和皮肤瘙瘁，严 重的变态反应能够导致虚脱危及生命。 ( 4 ) 对环境的影响：动物排泄物中的药物和耐药菌株被释放到环境中后将污染水源 和土壤。在污泥中细菌可长期保持耐药性质。 3 兽药残留分析技术研究进展 兽药残留分析技术是复杂混合物中痕量组分的分析技术。残留分析最昆著的特点 吉林农业大学硕士学位论文 鸡组织中链霉素残留检测方法的嗣：究 是需要严格的样本枪测技术。待测物的样品前处理和检测是药物残留分析的两个基本 主题。本世纪5 0 年代以前，兽药残留分析技术还仅限于化学分析法、比色法和生物 法，缺乏专一性，灵敏度低。在5 0 6 0 年代后，薄层色谱( t l c ) 和气相色谱( g c ) 的出现，使许多高灵敏度的检测器开始使用。7 0 8 0 年代后，高效液相色谱( 坤l c ) 大大拓展了分析范围，提高了分辨率和灵敏度，使兽药残留分析技术又向前迈进了一 步f 2 3 。4 1 2 1 3 1 4 2 ”。 31 样品前处理技术研究进展 现阶段，色谱、质谱、电泳、免疫分析及联用技术不断优化和目趋完善，药物残 留检测工作逐渐简化，而样品的前处理越来越成为兽药残留分析过程中的关键。经典 的样品前处理方法通常繁琐复杂、操作时间长、选择性差，逐渐满足不了兽药残留分 析的发展要求，一些新的样品前处理技术被应用到这个领域。 3 ll 固相萃取( s p e ) 固相萃取( s p e ) 是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品的 基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱达到分离和富集目标化合物的目的。s p e 既可用于复杂样品中微量或痕量目标化合物的提取，又可用于净化、浓缩或富集，是 目前兽药残留分析样品前处理中的主流技术。 3 1 - 2 基质固相分散技术( m s p d ) 基质固相分散技术( m s p d ) 是b a r k e r 在1 9 8 9 年提出并给予理论解释的一种快 速样品处理技术。它是将样品直接与适量反相键合硅胶一起混合研磨，使样品均匀分 散于固定相颗粒的表面，制成半固态装柱，然后采用类似于s p e 的操作进行洗脱， 是一种在s p e 的基础上改进后的样品处理方法，其固定相处理样品的比容量大，提 取净化的效率较高。对生物组织样品的处理较有效，但研磨的粒度大小和填装技术的 差别可能会使淋洗曲线有所差异，方法不易标准化。 3 1 3 超临界流体萃取( s f e ) 超临界流体萃取( s f e ) 技术是超临界状态下的流体为溶剂，利用该状态下的流 体所具有的高渗透能力和高溶解能力分离混合物的过程。具有速度快、效率高、选择 性强等优点。但是装置价格昂贵，不适合水样分析 3 1 4 免疫亲和色谱( i a c ) 免疫亲和色谱( i a c ) 是以抗原抗体的特异性、可逆性免疫结合反应为原理的色 谱技术，其基本过程为将抗体与惰性基质偶联制成固定相，装柱。i a c 最显著优点在 于对待测物的高效、高选择性保留能力，特别适用于复杂样品极稀组分的净化与富集， 吉林农业大学硕士学位论文 鸡组织中链霉素残留检测方法的研究 但尚处探索阶段，仍限于常规技术净化困难的重要残留组分样品处理过程。 3 1 5 其他技术 除此以外，还有一些高效的样品提取净化技术和专门的自动化提取装置，如微波 辅助提取( m a e ) 、超声波辅助提取( s a e ) 、固相微萃取( s p m e ) 、膜分离技术( 渗析、 超滤) 、分子印迹技术( m i p ) 、吹扫捕集( s c d ) 、制备色谱法等也在兽药残留分析中 得到应用。 3 2 兽药残留检测方法的国内外现状 目前，国内外采用的兽药残留检测方法主要有微生物法、仪器法、免疫分析法、 仪器联用分析法等。陈光哲于2 0 0 0 年使用微生物培养杯碟法检测肉类食品中链霉素 的残留量，其回收率在8 56 以上口l 。郭文新等也使用了生物法对牛奶中链霉素进行 了检测 6 】。但是由于微生物法的耗时性和不易标准化特定，目前国内外普遍采用高效 液相色谱法。而且高效液相色谱法是国内外药物残留检测应用最普遍、最有效的分析 方法，已经广泛应用于测定青霉素、四环素类等抗生素及呋喃类( 呋喃西林、呋喃唑 酮) 药物、磺胺类药物的残留检测【”。2 “2 8 。”。许多国家都将高效液相色谱法作为国家 标准分析方法，我国将其作为畜禽肉品中土霉素、四环素、金霉素残留检测等的国标 方法( g b t 1 4 9 3 1 1 9 4 ) 。陈晓红( 2 0 0 4 ) 使用高效液相色谱法，采用双试剂柱后衍 生化法，荧光检测器，测定了蜂产品中链霉素的残留限量，其回收率为8 79 9 38 ， 同一样品中链霉素残留量为0 0 8 5 0o 0 0 9 2 “咖l ，变异系数为l0 8 ，说明该方法及 仪器的重现性、稳定性好【”。并且已经被确定为国家的标准检测方法。 在国外，高效液相色谱法也广泛应用于农药和兽药的残留分析。在加拿大，最初 对于链霉素和双氢链霉素的检测主要是使用薄层色谱分析和生物自显影法，但是由于 这些技术和方法缺乏灵敏性和专一性，并且是定性测定的，于是逐渐发展开始使用液 相色谱法分析。1 9 9 4 年g cg e r h a r d t ，cdcs a l i s b u r v 和jdm a c n e i l 使用在线样品富 集液相色谱法测定了猪和牛肌肉组织、肾组织中链霉素和双氢链霉素的残留量，其检 测限量分别为l o p g i ( g 和2 0 u g l ( g 样品回收率分别为6 11 和5 53 【8 】。同年三人又 使用反相液相色谱法检测了牛奶中链霉素和双氢链霉素残留，其检测限爨分为 l o g 1 ( g 和2 0 珧g ，样品回收率在5 0 6 5 川。1 9 9 5 年h o r m a z a b a l 和y n d e s t a d 使 用液相色谱法对牛奶中的双氯链霉素残留进行了检测分析，检测限量为1 5 “g m 舀样品 回收率为8 3 i l 。1 9 9 6 年，k o c h e r 使用同样的方法检测了蜂产中链霉素的残留量， 其检测限量小于3 0 “g m g ，样品回收率为7 8 【1 1 1 。 当前，随着科学技术的发展和人们生活水平的提高，兽药( 包括药物添加剂) 在 4 吉林农业大学硕士学位论文 鸡组织中链霉素残留检测方法的j | ： = 究 畜牧业中的应用日益广泛，已成为畜牧业发展不可缺少的物质基础。但是由于兽药的 不规范使用，也造成了动物性食品中药物残留问题的发生，动物性食品中的兽药残留 问题已经成为各国政府关注的问题。联合国食品中兽药残留法典委员会于1 9 8 7 年提 出了“兽药残留分析方法准则”和“兽药残留控制取样文件”p 】。我国政府在1 9 9 9 年发布 了农牧发 1 9 9 9 】1 7 号动物性食品中兽药最高残留限量文件，规定了动物性食品中 兽药链霉素最高残留限量：肌肉、肝脏和脂肪为6 0 0 i i k g ，肾脏为l 0 0 0 “b 。 4 本试验研究的目的和意义 兽药残留对人类的危害有目共睹，根据目前的国际形式，特别是我国加入w t 0 以后，对于食品进出口的质量要求越来越高。中国是世界鸡肉生产、消费和贸易的大 国，2 0 0 4 年生产鸡肉9 4 7 万吨，占世界鸡肉产量的1 4 ，是世界第二大鸡肉生产国。 从世界范围来看，鸡肉、猪肉产量分别占肉类总产量的2 5 和3 9 。近年来，肉鸡 产品出口量连年下降，主要原因就是我国肉鸡产品质量与国际标准有差距，达不到进 口国的要求。2 0 0 1 年、2 0 0 3 年、2 0 0 4 年中国鸡肉出口连续三年遭到进口国封关禁令， 中国鸡肉出口量逐年下降，到2 0 0 4 年出门量降至2 5 2 万吨，严重制约了中国鸡肉 产业的发展。为了提高我国鸡肉的出口质量和数量，最大限度地满足人们生活需要和 保证动物性食品的卫生安全，这就要求我国必须严格控制肉鸡的产品质量以提高出口 量。目前食品卫生安全和药物残留问题已经成为全国热切关注的问题。动物性食品中 鸡肉及部分鸡组织中链霉素残留分析方法尚未建立法定标准，因此本研究对鸡的肌 肉、肝脏、肾脏组织中链霉素残留分析方法进行研究试验，以建立一种高效、安全、 简便、快速的链霉素残留检测方法，为畜牧业的广阔发展提供科学的依据。 吉林农业大学硕士学位论文 鸡组织中链霉素残留检测方法的研究 l 材料与方法 1 1 试验动物及分组 第二章试验内容 本试验选用一日龄的肉仔鸡( 吉林省德大养鸡场) 6 0 只，体重平均为5 5 6 0 9 ， 随机分成3 组，每组2 0 只。分别作为为空白组、空白添加样品组和供试样品组取样 材料。 1 2 试验动物日粮及饲养管理 饲料购于吉林德大养鸡场，为全价配合饲料，分为初期、中期、后期三个阶段饲 养，饲料号为：5 1 0 、5 1 l 、5 1 3 。控制饲料和饮水中不含有任何氨基糖苷类抗生素， 按照常规程序免疫和饲养。 1 3 试验设计 1 3 1 三个采样组别 空白组：不给药取样测定，作为空白对照实验组； 空白添加组：不给药取样后添加不同浓度的标准品溶液测定； 供试组：给药后取样测定，5 0 日龄时，选则其中部分健康的肉鸡进行肌肉注射给 药，剂量按照常规的方法一次给药( 每k g 体重给药2 5 m g ) ，并在给药7 2 小时后屠 宰、取样，检测肌肉中链霉素残留量，作为验证方法精密度试验所用的试样。 1 3 2 样品采集 采集时间2 0 0 4 年6 月2 0 目 保存条件一2 0 0 c 冰箱保存 取样程序 屠宰一取组织一放入自封袋内，封好，标记一一2 0 0 c 冰箱保存 取样顺序 肌肉：随即从左右胸肌取样，3 5 片胴体上取样混为一份约2 0 0 9 左右， 放入自封袋内，封好，标号： 肝脏：取全部肝脏，放入自封袋内，封好，标号； 肾脏：取全部肾脏，放入自封袋内，封好，标号； 6 吉林农业大学硕士学位论文鸡组织中链霉素残留检测方法的研究 1 3 3 试验检测方法建立 1 3 3 1 前处理 衍生化试剂的选择 反应时间选择：5 m i n 、1 0m i n 、1 5m i n ； 衍生化反应温度选择：4 0 。c 、4 5o c 、5 0 0 c ； 衍生化产物的稳定性试验：反应后不同间隔时间测定其峰面积； 提取液( 沉淀剂) 用罱选择：5 n l l 、1 0m l 、15m l 、2 0m l ； 洗脱液液用量选择：5m l 、1 0m l 、1 5m l ； 1 3 3 2 色谱条件的优化 检测波长的确定：通过紫外扫描确定 流动相组成的选择：甲醇、水、乙腈、醋酸盐缓冲液不同比例的筛选 流动相流速的确定 柱温的选择：3 0 。c 、3 5 0 c 、4 0 0 c 进样量的确定：定量环确定 1 3 4 样品回收率、精密度、灵敏度试验 1 4 动物药品及标准品来源 注射用硫酸链霉素 药品来源：圣泰动物药业 规 格：1 0 0 万单位( 1 9 ) 批号：2 0 0 3 0 9 0 5 硫酸链霉素标准品 来源：中国兽医药品监察所提供 规格：7 1 2 单位m g ( 7 1 2 ) 批号：2 0 0 3 1 0 0 9 1 5 检测方法的试剂和仪器 以下所用试剂，除特别注明外均为分析纯。水为符合g b t 6 6 8 2 规定的二级水。 甲醇、乙腈为色谱纯。 吉林农业大学硕士学位论文 鸡组织中链霉素残留检测方法的研究 1 5 1 试剂 ( 1 ) 甲醇色谱纯；( 2 ) 乙腈色谱纯；( 3 ) 三氯醋酸( 5 ) ； ( 4 ) 氢氧化钠( o2 m o 儿) 称取8o og 氢氧化钠用1 0 0 0 m l 超纯水溶解。 ( 5 ) 1 ，2 一蔡醌一4 一磺酸钠溶液( oo 0 0 8 m o i 几) 称取o1 0 5 2 9 ，溶于5 0 0 m l 超纯水中，4o c 冰箱中保存( 不超过1 周) 。 ( 6 ) 冰醋酸；( 7 ) 醋酸钠；( 8 ) 醋酸盐缓冲液( 00 1m o l l ，p h = 33 ) ； ( 9 ) 衍生化试剂的配制1 ，2 一萘醌一4 一磺酸钠溶液( o0 0 0 8m 0 1 l ) 和氯氧化钠 ( o2 m o l l ) 等体积混合。 ( 1 0 ) 硫酸链霉素标准溶液准确称取o0 2 0 0 旦标准品，用超纯水溶解定容至l o o m l ， 配制成o2 0 0 0 m g m l 的标准储备液，置于4 。c 冰箱中保存，使用时再稀释成 适当浓度的标准工作液。保存不超过1 个月。 ( 1 1 ) 邻苯二甲醛；( 1 2 ) 巯基乙醇；( 1 3 ) 1 庚磺酸钠 1 5 2 仪器和设备 ( 1 ) 高效液相色谱仪( 配紫外检测器) ；( 2 ) 电子天平感量oo 0 0 1 9 ； ( 3 ) 组织匀浆机；( 4 ) 水平振荡器；( 5 ) 离心机：( 6 ) 旋转蒸发仪； ( 7 ) 天平感量o0 1 9 ；( 8 ) 固相萃取装置；( 9 ) 隔膜真空泵；( 1 0 ) 溶剂过滤器； ( 1 1 ) 电热恒温水浴；( 1 2 ) 聚丙烯离心管( 5 0 m l ) ；( 1 3 ) 鸡心瓶( 5 0 m l ) ； ( 1 4 ) 微孔滤膜( 0 4 5 ”m ) 和针孔滤器( o2 2 p m ) 。 1 6 测定方法 1 6 1 试料的制备 试料的制备包括： 取绞碎后的供试样品，作为供试试料。 一取绞碎后的空白样品，作为空白试料。 取绞碎后的空白样品，添加适宜浓度的硫酸链霉素的标准溶液，作为空白 添加试料。 1 6 2 提取 称取5 o g 试料，放入5 0 m l 聚丙烯离心管中，加入5 m l 5 的三氯醋酸，匀浆、 加盖，置水平振荡器上振荡5 m i n ( 1 2 0 次m i n ) ，再离心l o m i n ( 3 0 0 0 r m i n ) ，倾出 上清液于5 0 m l 锥形瓶中。 1 6 3 净化和衍生化 0 d s c 1 8 固相萃取小柱先用5 m l 甲醇活化，接着用1 0 m l 水润洗真空抽干，使 上述备用液过柱，控制流速在1 滴秒左右，当最后一滴流下后用l o m l 水淋洗，再 童塑壅些查兰塑主兰壁丝室 苎垒塑! 燮查堕塑苎竺塑生型! 旦j l 用l o m l 甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，4 5 。c 蒸发置约5 m l 左右，然后加入衍生化试 剂l ，2 一萘醌一4 一磺酸钠溶液和氢氧化钠溶液各2 m l ，4 5 。c 水浴中反应1 0 m i n 取出，再 用甲醇定容到l o m l ，摇匀，过o2 2 p m 滤膜，供高效液相色谱测定。 1 6 4 色谱条件 色谱柱：e x t e n d c 1 8 柱 1 5 0 m m 46 m m ，粒径5 u m 。 流动相： 流速： 柱温： 乙腈+ 醋酸盐缓冲液( p h = 33 ) + 水( 1 0 + 1 0 + 8 0 ) ，用前过04 5 “m 滤膜。 o3 m l ，m i n 3 5 0 c 检测波长：2 5 2 n m 进样量：2 0 u l 1 6 5 测定法 根据试样溶液中硫酸链霉索残留情况，进行标准曲线或单点校准。当残留量在标 准曲线范围之内时，采用标准曲线校准，当残留量超过标准曲线浓度最大点时，选定 峰面积相近的标准工作溶液进行单点校准。 1 6 6 空白试验 除不加试料外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。 1 6 7 结果计算和表达 标准曲线校准 准确量取标准储备液适量，加水稀释成不同浓度的硫酸链霉素标准工作液，加 入等体积的衍生化试剂进行衍生化后过滤，供高效液相色谱分析。得到平均峰面 积与浓度数据制定出标准曲线。将标准曲线的浓度和对应平均峰面积进彳亍回归分 析计算得回归方程。 1 6 8 组织中硫酸链霉素的残留量可以用以下公式计算： 。一q 翌 “一m x ：组织中链霉索的残留量( m g ，k g ) c ：试验所用样品溶液浓度( p g m l ) v ：样品溶液最终定容体积( m l ) m ：最终样品溶液所相当的试样量( g ) 吉林农业大学硕士学位论文 鸡组织中链霉素残留检测方法的研究 1 6 8 标准品，添加标准品的组织，样品组织色谱图如下： 标准盛色谱圈l 1 0 吉林农业大学硕士学位论文 鸡组织中链霉未残留检测方法的研究 瑚 挪 1 添舶魏藉圈2 f 扎矽0。i。i 胍 ll，iiilliiill t b 吉林农业大学硕士学位论文鸡组织中链霉素残留检测方法的研究 加口 嘏1 湖 韵 动 瑚 绷 a 5r |8 一，、ji、。l一一，、。 1 2 吉林农业大学硕士学位论文鸡组织中链霉素残留检测方法的研究 2 试验方法的建立 2 1 高效液相色谱法原理 目前使用最多、效果最好的试验方法就是高效液相色谱法，它具有高效、快速、操 作简便等优点。高效液相色谱法分析原理简单，易于理解和操作。见下原理图。 取样与样品制备 ( 样品预处理) 厂 分离 l 提取 、 i 净化样品处理 i 浓缩 i j l 衍生化 分辨 、 l ，- 测定 检测 ， 建立一个方法包括样品前处理方法的建立和色谱检测条件的建立。前处理方法包 括除蛋白、净化( 固相萃取) 和衍生化。除蛋白一般通过使用酸或碱使蛋白质沉淀除 去。净化方法一般有过滤、萃取等净化方法。固相萃取为常用的净化方法，分为固定 相活化、平衡、样品上柱、洗涤和洗脱等步骤。衍生化方法分为柱前衍生化和柱后衍 生化，柱前衍生化为手动衍生，将组分与衍生化试剂反应后在进行 丑，l c 检测，反应 时间、条件和试剂等不受色谱条件的限制f 2 5 3 5 。3 ”。柱后衍生化是在线衍生，对仪器 设备要求较高。本试验采用柱前衍生化，主要对试剂、反应温度、反应时间等条件优 化。色谱检测条件主要包括对流动相的组成、比例、缓冲液p h 值、和流速的优化； 对检测波长、柱温和进样量的选择。 吉林农业大学硕士学位论文 鸡组织中链霉素残留检测方法的研究 2 2 衍生化试剂的选择 本研究采用柱前衍生化方法和紫外检测器检测氨基糖苷类抗生素硫酸链霉素。硫 酸链霉素( c 2 l h 3 9 n 7 0 1 2 ) 3 h 2 s 0 4 分子羹；= 为1 4 5 65 3 8 ，有三个碱性中心，属于二碱性化合物， 极性高。易溶于水，难溶于酸，不溶于甲苯和氯仿，白色粉末。在水溶液中璺现碱性， 且以离子形式存在，带正电荷。由于具有以上理化特性，可以使用高效液棚色谱法进 行分析。但是由于链霉素的极性和离子特征，它通常在反相色谱柱上不易分离，h 分 子中缺少紫外发光团和荧光团，在化学分析中需要将它转化为具有紫外发光团或荧光 团的衍生物使其极性下降以改善分配性能，本试验主要选择了两种衍生化试剂，并对 两种试剂进行了最佳的优化。 2 2 1 邻苯二甲醛衍生化 邻苯二甲醛足比较常用的衍生化试剂，主要用于柱前和柱后衍生化，根据资料显 示，曾经有人用于在线柱前衍生化瑚，l c 法测定牛磺酸软胶囊中牛磺酸的含量【3 ， 因此本试验对其是否适用于链霉素的柱前衍生化进行了研究。其配制方法采用国家标 准的药典方法。本试验对此试剂与硫酸链霉素的物质的量反应比例进行了试验，即二 者物质的量比例达到2 1 0 ：l 时，衍生化试剂大大过量，衍生化反应完全，但是彳；影 响测定，且通过紫外扫描在2 7 2 n m 处有最大响应。但是在进行紫外扫描中发现，此 衍生化产物极其不稳定，在1 4 m i n 内吸收峰出现很大的波动，并随着时间的延长吸 收度不断变化，衍生化反应l5 m i n 、25 “n 、35 m i n 时通过紫外扫描测测定的吸收值 分别为o3 2 8 、o3 3 8 、03 5 3 。通过高效液相色谱检测时也发现吸收值不断变化，由于 本试验采用的是柱前手动衍生化，要求反应产物在可以控制的时间内应该相对稳定， 必须使用比较稳定的试剂进行衍生化。因此对第一种衍生化试剂进行了试验。 2 2 2 l ，2 萘醌4 磺酸钠和氢氧化钠衍生化 9 0 年代g cg e r i l a r d t ，cdcs a l i s b u r v 和j d m a c n e i l 等人的试验中都使用过这两 种试剂来作为链霉素的衍生化试剂，进行在线的柱后衍生化，测定了猪和牛肌肉组织、 肾组织中链霉素和双氢链霉素的残留量，试验证明其产物很稳定。陈晓红于2 0 0 3 年 也采用了这两种试剂进行柱后衍生化，荧光检测器检测，测定了蜂产品中链霉素的残 留限量，也证明该衍生化产物很稳定。l ，2 一萘醌4 磺酸钠与硫酸链霉素在氢氧化钠 的作用下反应生成具有强的荧光团的物质，同时强的荧光团也具有强的紫外吸收，且 反应的条件容易控制。因此，本试验对该试剂作为柱前衍生化试剂并使用紫外检测器 进行检测的可行性进行了验证。 吉林农业大学硕士学位论文鸡组织中链霉素残留检测方法的簪究 2 3 衍生化条件和检测波长的确定 本研究在参考了大餐国内外资料的基础f ，对衍生化反应的试剂条件进行r 试 验。h o r m a z a b a i 、y n d e s t a d 、k o c h e r 和陈晓红等研究表明，1 ，2 萘醌一4 磺酸钠和氢 氧化钠与硫酸链霉素的最佳反应温度是在5 0 6 5 。c 之间，且反应可以在极短时间内完 成。由于本试验采用柱前手动衍生化，所以可以选择将温度范围降低这个条件来延长 反应时间，即从4 0 6 0 0 c 温度范围进行选择，且将反应时间定为1 0 m i n ，以便于实验 操作。结果证明温度在4 5 0 c 时，时间在1 0 1 5 m i n 即可以反应完全，温度超过5 0 0 c ， 反应时间超过1 0m i n 时反应产物出现分解现象，且出现杂峰。为统一试验条件，便于 操作，本试验将最后的条件定为反应温度4 5 0 c ，反应时问l o m i n 。由于过量试剂并不 影响测定，所以采用试剂大大过量，并采用2 0 0 g m l 浓度的硫酸链霉素与等体积的 衍生化试剂在4 5 0 c 反应1 0 m i n ，然后进行紫外扫描检测其波长。反应产物通过紫外 扫描得出在2 5 2 n m 波长处( 即图中的峰2 处) 有特征性的最大吸收，因此将检测波 长定为2 5 2 n m 。紫外扫描结果见下图。 吸 收 值 波长 ：辫! ! 譬鲤 g 2 5 2 o o ：1 喇 3 船吩且谢a l ，2 一萘醌一4 一磺酸钠和氧氧化钠与2 0 0 “m l 的标准品溶液等体积衍生化 l o m i n ( 4 5 ) ，然后经过紫外扫描检测。 吉林农业大学硕士学位论文鸡组织中链霉杀残留检测方法的研究 24 衍生化产物的稳定性试验 衍生化产物是否稳定是柱前衍生化成败的关键，衍生化产物的稳定性会对实验 结果影响很大。本试验对此衍生化产物的稳定性作了验证。试验结果表明，此衍生化 产物至少在5 小时内是相对稳定。同样品相同进样量，不同时间进样，其峰面积无 较大变化。因此该衍生化试剂完全适合进行柱前衍生化，使用该衍生化试剂是可行的。 结果见表l 。 表1衍生化产物的稳定性试验数据 1 a b l e1 d a t eo fs t a b i l i t ye x p e r i m e n to fd e r i v a t i v ep r o d u c t 注：2 0 0 g m l 的标准品溶液与等体积的衍生化试剂反应( 4 5 0 c ) 1 0 m i n 25 色谱条件的建立 2 5 1 流动相组成和流速的选择 由于硫酸链霉素极性高，易溶于水等性质本试验选择了四种流动相组成比例进行 试验。甲醇和水；乙腈和水；乙腈和l 一庚磺酸钠；乙腈、醋酸盐缓冲液和水四个组成 进行试验，通过调整各个组成成分的比例和流动相的流速，结果甲醇和水；乙腈和水； 乙腈和1 庚磺酸钠；三种组成作为流动相时，试剂峰和组分峰不能分开，只有乙腈、 醋酸盐缓冲液和水组成时可以分开，因此选择乙腈、醋酸盐缓冲液和水组成作为流动 相组成成分进行进一步条件的优化。主要选择以下比例和流速进行条件优化，针对不 同的组成比例和流速获得不同的峰形、保留时间、分离度。 结果见表2 及以下色谱图1 ，图2 ，图3 ，图4 。 吉林农业大学硕士学位论文 鸡组织中链霉素残留检测方法的研究 表2 不同流动相组成比例和流速对测定结果的影响 t a b l e2 e 仃e c to fd i f f e 咖tp r o p o r t i o na n ds p e e do fm o b i l ep h a s et or e s u i t s 注：2 0 0 垤m l 的标准品溶液与等体积的衍生化试剂反应( 4 5 。c ) 1 0 i n 吉林农业大学硕士学位论文鸡组织中链霉素残留检测方法的研究 乙躺：醺哺 盐缓冲液：水- 1 5 ：l ：流遮：l mm u 嘲n 色谱翻l 吉林农业大学硕士学位论文 鸡组织中链霉素残留检测方法的研究 乙骑漕礞黯缓冲横：康咚：l ： 藏迪：t 孽_ l 翩籼 色谤陶： 吉林农业大学硕士学位论文 鸡组织中链霉素残留检测方法的母；究 矗腑：精酸齄缓种液：水叫# ：i n ：溉速。瓤i 1 l 堋t 也潜罔a 吉林农业大学硕士学位论文鸡组织中链霉素残留检测方