（作物遗传育种专业论文）橡胶树CBF信号通路相关基因的克隆表达及HbCBF1功能研究.pdf

摘要 在橡胶生产上，非生物胁迫严重影响了橡胶的产量，特别是低温、干旱。近几年 来，利用植物分子生物学技术来提高植物的抗寒、抗旱能力的研究进展十分迅速。特 别是，一类能调节许多抗寒、耐旱和耐盐相关基因c o r ( c o i dr e s p 0 璐i v e ) 的转录激 活因子c b f ( c m r e b i r l d i n gf 粥衄) 的研究甚多，它位于冷应答调控网络的节点 上，能激活下游众多与抗逆有关的功能基因的表达。目前对c b f 途径的研究是众多 冷应答途径中最为透彻的，功能最为明确的，也是植物抗寒分子育种目的基因的首选。 本研究以巴西橡胶树( 胁b 懈姚珊西) 为试验材料，通过同源克隆的方法，从冷 处理的橡胶树中分离到c b f 冷应答途径上的几个相关基因；对它们进行了序列分析、 功能预测、表达模式分析以及转化拟南芥的功能鉴定，内容概括如下： 1 利用间并引物进行p c r ，从巴西橡胶树中克隆出两个a p 2 e r e b p 类基因保守片 断序列分析显示，保守片断l 来自本实验室已获得的册c 8 f z ；片断2 则与拟 南芥a p 2 e i 冱b p 类转录因子有很高的同源性。 2 利用s a f a p c r 法成功获得励僦的启动子序列。通过预测分析，存在一条5 0 b p 的启动子序列，存在g a pb o x2 和i b o x 。 3 通过对巴西橡胶树冷处理c 研叮a 全长文库的序列筛选，获得与抗寒、抗旱相关的 基医h b d r e b 2 b 帮h b r d 2 2 。 4 n 0 懒b l o 钍i n g 杂交实验显示，励c 删、历c 腑均能被低温诱导表达，相比 而言，册c b 心被诱导的更为迅速；对于干旱胁迫，励c 刚没有应答，说明其 参与冷应答过程与干旱诱导途径互为独立；而王汤c 引叼则能迅速被脱水胁迫所诱 导表达；肪舢船能被低温和干旱诱导，且表达丰度不受胁迫时间影响：肋足d 2 2 亦能被低温和干旱诱导，能迅速增加表达量，但随着胁迫时间的增长，表达量随 之减少，甚至低于正常状态下的表达丰度。表明同类基因表达和功能具有多样性。 5 筛选鉴定出一些肋侧转化拟南芥的纯系植株。通过n o 舳杂交实验显示， 励，c 引吖在组成型强启动子c | 口 形罗船驱动下，能在正常生长条件表达，并且能诱 导拟南芥c o r l 5 a 和r d 2 9 a 基因的表达；在冷处理和干旱处理的情况下，励c 醒， 一的诱导效果则与拟南芥中内源c o r l 5 a 的表达途径叠加：另一方面却抑制了 r d 2 9 a 的表达。 i 6 测定了三个转化株系的抗寒、抗旱相关生理指标，结果显示册侧增强转化植 株的抗寒性，却有可能限制了其抗旱能力 综上所述，非低温驯化的巴西橡胶树中也存在c b f 冷应答途径，说明热带植 物在抗寒分子机制方面同源具有保守性，克隆得到的基因具有潜在的抗寒功能； 同时，同源基因间表达谱的差异有揭示它们功能上的多样性和复杂性；转化植株 的功能鉴定，表明册硎在功能上与同源拟南芥侧具有相同性也存在差异 性，需要更多的同源基因的筛选、鉴定，为橡胶树抗寒分子育种提供最佳的目标 基因。 关键词：巴西橡胶树：c b f ；冷应答途径；拟南芥；转基因 a b s t r a c t r l 妇rp r o d u c t i o ni sa 腩c “甜s e r i o 峭l yb ya b i o d cf a c t 0 取e s p e c i a l l yt 1 1 e 1 0 w 曲即1 p e r a ：t u r e 觚d 血ed 1 0 i i g h t i i l 托c e n ty e 哪，m es t u d yo fe n h 如c i i l gp l a n tc o l d t o l e r a n c ea i l dd r o u g h tu t i l 娩i n gp l a n tm o l e c u l 盯b i o l o g yt e c h i l i q u e sd e v e l o p e dr 印i d l y o n e k i l l do f 坞g i l l o n 劬i c hc o m 】砸s e d 们璐c r i 砸f a c t o rc b f 锄d 胁c t i o 砌g e 舱c o rw 弱 s t i l d i i 甜i i ld 喊1 t 1 l i sr e 叫o nl o c a t e di i lc o l d 陀s p o i 悦s i 弘m 咖r kn o d e s c 删y 血e s t i l yo f 也cc b fp a n l 、 r a yi s 血em o s tf e m 聆- i c l e 盯i n 圮c o l d 聆s p o n 娓，舳di sm e p 旒玎耐f o r 们l 娩e d i nb r d i i l g i nn l i s 吣w ec l o n e d 觚s e v e 豫lc o l dp a 廿1 w a y l a t e d g 眦s 妣l u d 啦h b c b f 2 ，h b r d 2 2 ，h b d r e b 2 bb yr a c e 妇e dh 0 脚l o g ) rc 1 0 n i n g 赋舳d 缸吼j 玉纠e 口拥f ，记珊纽t h ei l ：u c l e 矾d e 洲孙瑚峨s 、e 陀锄a ：i y 冼d ，a n d 如僦i o 璐 w e 把p r e d i c t e db yb i o m 嘶c a lm e m o d 1 k i r 懿p 陀s s i o nw 弱m l d i e db yn o m l 册 b l 删曲gm e t l l o d b e s i d e s ，w eo v e 他x p r e s s e dh b c b f l i n 加a b i d o p s i s ，a n di t s 矗m 舐0 nw 弱 i d 钮6 f i e d 1 f 1 他陀s u l t s 、坞s u m m a z e d f o l l o w ： 1 u s eo fd e g e n e r a t ep r i i 附sf o rp c t w oa p 2 e r e b pf a n l i l yg e 危哼n e n t sw e 陀 i i 删f 而m 也eh e v e ab m s i l i e i 坞i s s e q l i e n c e 觚a l y s i ss h o w e dt h a to n ew 舔t h es 觚圮弱 月z i c 踟蛐e dp 陀v i o u s l y ；a n dm e 州恼h a dl l i g l lh o i n o l o g ) ，、) l ，i ma p 2 e i 冱b p 仃a 璐c r i p t i o l i a lf 搬。墙i n 彳，口6 坳捃胁，肠，孵 2 u s a f a - p c kw e0 t 心d 册c 剧一2p 咖n o t 盯q u e n c e ，a l s ow i t l l5t e m l i l l a l s e q 眦n o ft t l i sg e i 圮肌c c e s s 矗m 弘b yp r o m o t e rp r e d i c t i o n 删y s i s ，t l l e r ee x i s t e da5 0 b p p m o t e rs e q 眦：n c 弓w m c hb e t l ) i ，e e ng 印b o x2 觚di j b ( x 3 s c 瞅：n i n gt l 坞触l - k ：n g 皿c d n al i l 姗w eo 曲e dm ec o l d 砚dd r o u g 如g 晚鹳 r e l a t e d g e n e s 册引蚴锄d 肋扣 4 n o h e mb l o t t i l l ge x p e i i n l e n t ss h o w e dt h a t 册c z 置f 了，励c l 屯f 2c o u l db ei n d u c e d b yl o wt e l i l p e 劬鹏，i n 讹c h 励c 腑、糯捌咖他呻i d l yt l 如h b c b f l 胁c 聊 l l a s 加聆s p o 璐e st 0d r o u g h ：t 砌c h 眦邮衄励凹门m v o l v c si nm e 印c e 胬o fc o l d 豫；p o l l s e sa n d 印a r t 舶md r o u g mm s p o n s i v ep a n l w a k 觑僦c 觚b e 砌u c e dm p i d l yb y d c 】h y d 角t i o n ；励别咂脚啪b ei r k l u c e db yl ) wt e l n p c 劬此a n d 曲) u 扯；a n d 地 a b 哪d a 酩ed i dn o tc h 觚g e 嘶me l o n g a t e ds 骶s s ；脚l r d 2 2w 撼a l s 0a b l ct ob ci i l d u c e db y i l o wt e m p e r a t u 豫a n dd r o u g 她b u t 也ee x p r e s s i o n 锄。吼td e c r e 笛e d 、i ml o n gt i i 北s h e 鼹， 趾d e v 钮i o w 盯t l l 觚m i a l e x p r e s s i o n i n a b 衄d a n c ea t l a s l 5 s c v e m lp u r e 蛔璐f 0 硼耐舡a b i d o p s i st h “a 胍l i l l e si i lw l l i c hh b c b f 1 g e n ew i 淝 o v e 托x p 他s s c dw e 他s c r c 即l e d n o r t h e mb i o 位i i l g 麟p e r i i n e n t s 舱s i l l t ss h o w e dt i l a tc o r l 5 a 髓dr d 2 9 ac 船e x p 糟s di i l 也en c 髓l a l 印w t l lc o 槭t i o n si nt l l e p l 龃s t s u n d e rc o l da n d d r o u g h ts 臼呛s s ，1 ee x p r c s s i o no fc o r l 5 aw 弱蚰彻玛e ri i lh b c b f lo v e r e 珥) r e ：s s i o np l a n t t h a nm a ti nw i l dt y p ea r a b i d o p s i s h o w e v e r o 也e r 切r g e t sg p n eo fc b f 仃孤塔c r i 硝o nf k t o r l m 2 9 毛妇r c 弱e de x p r e s s i o nt o w a r dc o l d 锄dd r 0 咄s t 呛s si i l 眦g e n i c s 6 t h ep h 胁o t y p e so ft l l l t r a 邺g 面cl i i l e sw e 坞砷，e s t i g a t i 斌砌c hs h o w c do v 脚 他s s i o no f 册c 8 f ，h 髓c e dt h e 毹钇i i l gt o l 锄ti n 仃暑吣础p l a 蝇b u tl n i 啦d e 伽e 私e d t ：h e t 0 i 删幻d r 0 u 扯 t os 啪u p 慨e x i s t e dc b f 鲥d 聆s p o 噼i nm e 姗c o l da c c l 鼬i 锄p l 勰t ，胁聊 6 阳s 矗f p 附趣w i l ic ! hm e a n sm a ta 强p a 曲w a yi sc m x s e r v 撕v ei n 也i s 细o p i c a l 仃a n d 恤 i s o l a t e lc b fg e 鹏l 潞让屺f i m 嘶o n 嬲n 皿ti n 触b i d o p s i s ，b m 丽n ls o m ed i 彘晌e s s 0 n 1 0 豫g e n e sa i 垃e d e dt 0b ei l a m e d 豳p o s s i b l ec 锄d i d a t e sf - o r 也eu i i lb r e e d i n g c 0 1 d 1 s i s i a n tc l o n e so fh e v e ab i a s i l i e n s i s k e yw o r d s ：h c v b r a s i i i e 潞i s ；c r tb i l 碰n g 细知r ：c o l d - 托s p o 娜ep a n l w a y ；a m b i d o p s i s ； 栅g 锄e 戳 e b e d t a k a n o d o i 强 p c r 尉f r t p c r s d s t h s c l x - g a l 缩略词 a b b r e v i a t l 0 n a b s c i 鳓ca c i d 鲫叩i c i l l i i l c - r e p e a tb i n d i l l gf 衙 n l l o r 锄n 1 ) h e n i c o l d i e 也y l p 班佻甜b m 咖 d 吐i ) 诅r a t i o n - 他s p o 璐i v ee l e i n t d e h y d f a t i o n _ 】燃p 0 璐i v ee l e m e n tb i l l d i n g e n l i d i u mb r o m i d e “i l y l 钌圮d i m 血et e 缸醐c e t i ca c i d 】c m 觚y c h i 0 p t i c a ld e n d i 锣 o p 啪r e a d i r 培岔嬲 p 0 1 ) r l n e r 弱ec l m i i i a c t i o n 砒缅n p i c i i i 托v e r s e 臼f a l 邸啷6 p c r 妁d i 唧d o d e c y ls 幽t e 耐sh y d r o c m 丽d e 5 - b r o m o - 4 - 砌。胁3 砌o l y i - d g a j 砌哪驰m o s i d e 脱落酸 氨苄青霉素 c - 唧锄结合因子 氯霉素 焦碳酸二乙酯 干旱应答元件 干旱应答元件结合 蛋白 溴化乙啶 乙二胺四乙酸 卡那霉素 吸光值 开放读码框 聚合酶链式反应 利福平 反转录p c r 十二烷基磺酸钠 1 h s 盐酸盐 5 - 溴4 氯3 吲哚b d 硫代半乳糖 丽s ，乙酸缓冲液 枞娜锄一|一 海南大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取 得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写 过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律结果由本人承担。 论文作者签名： 蒸冯谬 日期：删年厂月，岁日 学位论文版权使用授权说明 本人完全了解海南大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权海南大 学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。本人在导师指导下完成的论文成果，知识产权归属海 南大学。 保密论文在解密后遵守此规定。 论文作者签名： 荔瑶厦 日期：舢年艿月1 3 日 导师签名： 日期：。节。占年6 月f 弓日 本人已经认真阅读“a 也i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的学位论 文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中规定享受相关 权益。回童迨塞握銮唇滢唇i 旦兰生i 旦= 釜i 睦垒叁查。 论文作者签名： 荔响礁 导师签名： 日期：蹄6 月，弓日 文献综述 1 植物冷相关基因及其调控途径的研究进展 1 1 引言 低温寒害经常对植物造成伤害并影响作物产量，限制了植物地理分布和生长发 育。长期以来，人们从生理学、形态学、生物化学、生物物理学等多个方面对植物抗 寒机制进行了广泛的研究( 简令成，1 9 9 2 ) 。在综合应用分子遗传学及生物信息学手 段下，大量冷诱导基因被检测或被分离出来，其中有些被实验证明对提高植物的抗寒 性有着重要作用；同时，对冷驯化过程中的基因表达调控进行了深入的探索，初步提 出低温信号转导以及调控途径的模型，从而揭示了冷诱导基因表达调控的复杂性与多 样性。 植物在长期的进化过程中，演变产生了多种多样的耐逆机制。在低温环境胁迫下， 植物体内会有多种基因诱导表达并发生一系列的生理生化变化，从而使植物对这些胁 迫作出抵御的反应( 1 k 腿鹪h o w ，1 9 9 9 ) 。冷胁迫诱导表达的基因产物按其作用可分 成两大类，一类产物直接保护细胞免受环境胁迫的伤害，如皿f 4 蛋白、抗冻蛋白、 伴侣蛋白、脂肪酸去饱和酶和脂肪迁移蛋白等功能蛋白，为各种渗透保护剂的生物合 成所需的酶以及清除活性氧自由基的解毒酶等( g i b s 0 n 和觚i l ( 1 e l ，1 9 9 4 ；h u g h e s 和 d u n i l ，1 9 9 6 ；i n 踞吼和b a 他l s ，1 9 9 6 ：s m z a l i 和y a n l a g u c h i - s m n o z a l 【i ，1 9 9 7 ；b r a y ， 1 9 9 7 ) ；另一类产物包括转录因子、蛋白激酶和与磷酸肌醇代谢有关的酶，它们在调 控基因表达、感应和转导胁迫信号中起重要作用( j i b m s h o w ，1 9 9 0 ；刘强等，2 0 0 0 ) 。 随着拟南芥冷应答调控网络图谱的绘制成功，对冷诱导基因及其调控关系的深入研 究，不仅使我们在分子水平上深入理解植物的抗寒机制，而且为人们通过基因工程手 段进行植物抗寒育种提供了新的理论依据和新的策略。 1 2 f d r 印转录因子的研究 1 2 1 顾式作用元件d 旺的发现 y 距l 删s 1 1 i n 0 盈l 【i 和s o 盟k i ( 1 9 9 4 ) 从肋2 9 口基因的启动子中鉴出一个9 b p ( t a c c g a c a t ) 的d n a 调控元件d 衄( d e h y d m t i o n r e s p o 吣i v ee l e 咖t ) ( y a m a 哥l c b i s i l i i l o z a k ia n ds h 舢z a k i ，1 9 9 4 ) 。同年，b 也盱等从c o r j 勋基因的启动 子中又鉴定出另一调控元件c r r ( c 哪p e a t ，1 g g c c g a c ) ( b a k e r ，1 9 9 4 ) 这两个 元件均含有c c g a c 核心序列，即三刃隰( l 0 w - 觚p e r a t u 静础踞 0 璐i v ee l e m e n t ) 元件 ( j i 锄ge ta 1 ，1 9 9 6 ) 。随后的众多研究表明，c 足彤d 衄或其核心序列普遍存在于冷诱 导和脱水诱导基因的启动子中，为这类基因的冷诱导和脱水诱导表达所必需。 1 2 2c b f d r 印转录因子家族的发现 冷驯化过程涉及多种基因的调控表达，包括c o r ( c o l d 啪阱l 砷e d ) 基因( h 萄e l a ， 1 9 9 0 ) 。而许多c o r 基因的协同诱导表达则表明可能存在调节c o r 基因表达的调控 因子( h 勾e l a ，1 9 9 0 ；j 0 9 l o 删o ，1 9 9 8 ) 。人们进一步研究发现，这些c o r 基因的 启动子中存在一个共同序列c c g a c ，称为c r t 或d r e 序列。随后，s t o 幽n g e r ( 1 9 9 7 ) 通过酵母单杂交从拟南芥c d n a 文库中分离得到一条c d n a 序列，其编码产物能与 c m i 逻特异结合，且在酵母系统中可激活含有c 咖r e 作为上游激活子序列的报 告基因的转录。所以，此蛋白具有转录激活因子的作用，被命名为c 啪r e 结合因 子( c l 盯b 础n g 胁l ，c b f l ) 。c 嗣在拟南芥中过量表达，在非寒冷情况下可诱 导c o r 基因的表达并能提高拟南芥的抗冷性、抗旱性和抗盐性，但c b f l 基因的 表达只受低温诱导，并不受干旱和高盐的调控( j 0 9 1 0 0 n o s o r ，1 9 9 8 ) 。m e d i i le ta l ( 1 9 9 9 ) 的研究则表明，提高a b a 水平并不能提高c b f 基因的表达量，这就表明此通路为独 立于a b a 的途径随后的两年里，利用c 刚编码区的片段作为探针，从拟南芥文 库中筛选获得c 腑和c 8 丹基因( q l i n o m e ta l ，1 9 9 8 ；m e d i me ta l ，1 9 9 9 ) 同时 另一个科学家“ue ta l ( 1 9 9 8 ) 从拟南芥中鉴定出5 种d r e 结合蛋白( d 肚b 砌i i l g p r o t e i l l ) ，后面比对发现，其中脚以、删凹和沏j c 分别对应于c 8 乃、 c 删和c 腑3 个f 基因构成一个小基因家族，以c 肿c 8 乃8 心的顺序正 向排列于拟南芥染色体w 短臂的7 2 8 皿处，相互之间连锁( g i h n o 毗e ta i ，1 9 9 8 ： 2 s h i n w a r ie ta l ，1 9 9 8 ；m e d i i 协e ta l ，1 9 9 9 ) 。c 8 尉是蝴j 家族中发现的第4 个成 员，同样，删在拟南芥中的超表达能引起c o r 和l m 基因的活化，然而它被干旱 和a b a 所诱导，但不被低温所诱导，组成表达洲的转基因植物却表现出和转c 啪 一样具有抗寒性的显著提高( i 勰k ee ta l ，2 0 0 2 ) 。s a l c 眦ae ta 1 ( 2 0 0 2 ) 又相继分离 出d r e b 家黼几个颧成员：d r e b l d 、d l 也b l e 、d r e b l f 、d r e b 2 c 、d r e b 2 d 、 d 尼e 8 姬、d r e 8 2 r 傩皿2 g 、d 尼e 口2 日，但它们在逆境抗性中的作用都不如姗以、 d r e b l b 昶d r e b l c 那么观显。 1 2 3 f d r 印转录因子的结构与特性 c b f 转录激活因子属于彳p2 ：侣r e b 尸类转录因子，其一级结构中含有彳心d n a 结合域、推断的碱性核定位信号区和潜在的酸性转录激活域( s t i 删k i n i 蓉e r 等，1 9 9 7 ： l i ue t2 l i ，1 9 9 8 ；m c d i me ta l ，1 9 9 9 ) 。刎吁d n a 结合域为植物所特有，存在于拟南 芥蛋白刎堰勿以2 ( a p 2 ) 、彳肼珏g 硼删和2 r 趴吼烟草乙烯应答元件结合蛋白 ( 脚l e 肿r e s p o 越i v ee l c 嗍l tb i i l 曲1 9 胁t e i n ，职e b p ) 以及许多其它功能未知的植 物蛋白中( 慰e c h m a n n 和m e y e r 0 丽t z ，1 9 9 8 ) 。它由大约6 0 个氨基酸残基组成，在不 同植物中非常保守( u r oc tm ，1 9 9 7 ) 。在拟南芥伽、c 腑和c 聃转录激 活因子中均发现有蛋白激酶c 和酪蛋白激酶的潜在识别位点，这些位点在3 种c b f 蛋白中是保守的，如丝氨酸1 3 、丝氨酸5 6 、苏氨酸1 5 l 等，其中前二者位于a p 2d n a 结合域内( m e d i n ac ta l ，1 9 9 9 ) 。比较发现，来自拟南芥、油菜、小麦、黑麦和番茄 的f 蛋白都含有两段短多肽序列，即p k 敞刚g j 默僦聊和d 鼢腮( j a g l o 或 a l ，2 0 0 1 ) 前者直接位于刎叼d n a 结合域的上游，后者就在彳心d n a 结合域的下 游。在预测由拟南芥编码产生的1 4 0 多种彳p 2 伍re ：8 p 域蛋白中( 慰e c 妇e ta l ， 2 0 0 0 ) ，只有c 8 用、c 髓2 和c 明町才具有这两段短多肽序列，因而称它们为c b f 蛋白的特征序列( s i 印a n 鹏s e q u ) 。剧殛确拗g j 既僦脚序列与核运输信号相 近，可以推断其与以前认为的蛋白运输可能有关。 从预测的二级结构中可以看到，拟南芥侧蛋白中只有2 个a 螺旋，一个在n 末端区域，另一个在么刀d n a 结合域内。彳p 2 域中的亲水脂a 螺旋被认为是c b f 蛋 白的一个核心结构，参与同其它转录因子及d n a 间的相互作用( k a 柏y ae ta l ，1 9 9 9 ； 刘强等，2 0 0 0 ) 。该域中还有3 个b 折叠，它们通过与d n a 大沟内碱基对的互作对 3 识别各类顺式作用元件起关键作用( a a l l 钮文a l ，1 9 9 8 ) 。k a n a y ae ta l ( 1 9 9 9 ) 通过测 定完整和截断的鲫蛋白的圆二色性光谱研究该蛋白二级结构随温度而变化的结 果表明，c 柳蛋白的n 末端区域和c 末端酸性区域在一5 0 3 0 的范围内表现出可 逆冷变性，而彳尸1 2d n a 结合域在4 0 6 0 之间表现出热变性。这种冷变性引起 c 召盯蛋白分子的伸展，因而被看作是c 删蛋白的一种对冷胁迫的生理上很重要的 结构响应的特性。同时还有研究还表明，c b 几二级结构在3 0 左右时最稳定，温度 上升到7 0 时仍维持相当量的热稳定二级结构。 1 2 4 f d r 印转录因子的表达特性 在正常生长温度下，植物体内的c b f 基因不表达，然而在a b a 处理和脱水胁迫 条件下，同样检测不到其转录物的存在。说明该途径独立于a b a 途径只有在低温 环境中，3 个c b f 基因的转录在1 5 n l i i l 内明显提高，在接下去的l 2 h 之间继续提 高，2 h 后开始下降，但在2 4 h 内仍然保持着比正常温度下生长的植株中要高的水平 与拟南芥中的情况一样，油菜、小麦、黑麦和番茄中类似c b f 基因的转录也在经受 低温胁迫后1 5 3 0 m i i l 内快速提高，几小时内达到最高，随后开始下降( j a g l oe ta l ， 2 0 0 1 ) 。而且，c b f 基因转录物在叶、茎、根等器官中能积累到相似的水平( s h j n w a d e ta 1 ，1 9 9 8 ；m c d i me ta l ，1 9 9 9 ) ，这些结果表明，c b f 基因的表达为低温特异诱导 而不受a b a 和脱水胁迫的调控，同时也是非器官特异的。组成型强启动子c 删乃镕 连接拟南芥c 聊、c 尉嘭和嗍基因并导入拟南芥和油菜后，侧、c 聊和c 啪 基因能在没有低温刺激的条件下表达，而在低温胁迫下的表达大多会得到进一步的加 强( j a g l 伊嘶ne ta l ，1 9 9 8 ；l i l le t a l ，1 9 9 8 ；k 笛u g ae ta l ，1 9 9 9 ；j a g l oc ta l ，2 0 0 l ； l i ue ta l ，2 0 0 2 ) 。 c b f 转录因子在植物抗寒中起重要作用，其超表达转基因植株在没有低温刺激的 情况下提高转基因植株的低温耐性( j a g l o o 仕0 s c ta l ，1 9 9 8 ；“ue ta 1 ，1 9 9 8 ：l 白跚g a da l ，1 9 9 9 ) ，或进一步增强冷驯化转基因植株的抗冻能力( 埘oe t a l ，2 0 0 l ；l i ue ta l ， 2 0 0 2 ) 未经冷驯化条件下，在一5 一6 环境中冷处理l 2 d 拟南芥野生型植株 全部死亡或存活很少，而超表达c 删或c 屡刀的转基因拟南芥植株仍保持相当高的 存活率( 埘伊。饥o s 饥c ta l ，1 9 9 8 ：l i uc ta l ，1 9 9 8 ：k a 羽l 鲷c ta l ，1 9 9 9 ；l i ue ta l ，2 0 0 2 ) 在超表达拟南芥伽、c 8 砣和c 引町的油菜转基因植株中，也获得了同样的结果 ( 蚓oe ta l ，2 0 0 1 ) 。这些研究结果还表明，侧转录激活因子超表达植株的低温 耐性与目标基因在非胁迫条件下的表达水平正相关。目标基因高水平表达的c 8 丹转 基因拟南芥植株冷处理后整株存活率达8 3 9 ，远远高于目标基因低水平表达植株的 3 5 7 ( s t o c k 岍e ta l ，1 9 9 7 ；l i ue ta l ，1 9 9 8 ) c b f 超表达转基因植株提高转基因植株的低温耐性的原因是其启动了下游相关 基因的表达。植物的许多冷诱导和脱水诱导基因的启动子中都存在有c r 彻r ed n a 调控元件，c b f 转录激活因子能与该d n a 调控元件特异结合，在酵母和叶片原生质 体中激活以这一元件作为上游激活子序列的报告基因的转录( s t o c k 地e re ta l ，1 9 9 7 ； l i ue ta l ，1 9 9 8 ：l i ue ta l ，2 0 0 2 ) 。启动子中含有c 尺d r e 调控元件或其核心序列的 拟南芥冷诱导基因c 锨反6 、足，毙、肼7 、c a 吸殆、圈m 和e 尺d j d 分布在整个 基因组上，与c b f 基因不连锁，相互之间也不连锁( l i ue ta l ，2 0 0 2 ) ，它们编码产 生u 狐蛋白或亲水多肽( l i i la n d 低m 瑚1 0 w ，1 9 9 2 ；y a m a 訇l c i l i s h i 】动k i 锄d s i l i i l o z a l 【i ，1 9 9 3 ；h s i e he ta l ，2 0 0 2 ) 。拟南芥植株经受低温胁迫后1 5 m i n 内，3 个c b f 基因的转录明显提高；到了2 h 左右，c 锨，毙和c 锨7 艿的转录物开始积累( l i ue ta l ， 2 0 0 2 ) 转基因实验证明，拟南芥转基因植株中c b f l 和c b f 3 的超表达导致正常温 度下上述6 个拟南芥冷诱导基因的表达，或增强这些基因在低温胁迫下的表达 ( j a 出o - o t t o s e ne ta l ，1 9 9 8 ：l i ue ta l ，1 9 9 8 ；k 嬲u g ae ta l ，1 9 9 9 ；l i u 吼a l ，2 0 0 2 ) 。 而且，冷诱导基因的表达水平与c b f 基因的表达水平相关，c b f 基因表达越多，冷 诱导基因的表达就越强( l i ue ta l ，1 9 9 8 ；跏u g ae ta l ，1 9 9 9 ) 。番茄c b f 编码序列 在转基因拟南芥植株中超表达，在没有低温刺激的情况下也激活了c 锨j 毙和 r 反6 基因的表达( j a g l oe ta l ，2 0 0 1 ) 。将拟南芥的3 个c b f 基因导入油菜基因组， 它们在正常温度下的组成型表达引起砌n 5 和跏8 转录物的积累。勘船是一个与拟 南芥足丘6 相似的基因，其编码蛋白在未经冷驯化的转基因植株中积累，而在冷驯 化转基因植株中的含量要比对照植株中高( j a g l o e ta l ，2 0 0 1 ) 以上结果表明，c b f 转录激活因子通过与c 足彤d 船d n a 调控元件的特异结合，激活启动子中含有这一顺 式作用元件的目标基因的表达。这是c b f 转录激活因子的最主要的生理生化功能 拟南芥和其它植物在冷驯化过程中，脯氨酸生物合成关键酶1 ，2 二氢吡咯羧酸合 成酶( 1 ，2 p y r r o l mc 州，o 巧l a t es ) ，i l t l l e t a ，p 5 c s ) 基因的转录物水平和脯氨酸 含量会提高( m c k 0 、 i l e t 砒，1 9 9 6 ；x i n 锄db 删，1 9 9 8 ；w 栅a n d 圳l a ，1 9 9 9 ) c b f 转录激活因子超表达能产生类似的作用研究表明，在非冷驯化生长条件下， 5 c 踊超表达拟南芥转基因植株中彤c s 转录物水平大约比未转化对照植株高4 倍， 而在冷驯化删超表达植株中丹田转录物水平较冷驯化的未转化对照植株高2 3 倍与此相一致的是，非冷驯化生长条件下c 鹏超表达植株中的自由脯氨酸含量大 约比未转化对照植株高5 倍，受到冷驯化后，前者较后者高2 3 倍( l i ue ta l ，2 0 0 2 ) 拟南芥转基因植株中c b f 转录激活因子的超表达导致多方面的生理生化变化， 包括多种剧掰蛋白或亲水多肽的启动表达、脯氨酸和多种简单糖类的合成积累等， 这些变化在植物冷驯化过程中普遍发生。由此认为，c b f 转录激活因子就像是一个 “总开关 ，综合激活冷驯化反应的多种组成因子( 1 1 1 0 m 棚e ta l ，2 0 0 1 ；l i ue ta l ， 2 0 0 2 ) 。研究c b f 下游蛋白对于破析低温条件的信号途径，揭示植物低温条件下基因 表达调控，进而研究其生理机制有重要的作用，已有大量的工作对冷诱导及c b f 下 游基因组学进行研究( s e l 【ie ta l ，2 0 0 1 ；m a 九l y a m ae ta l ，2 0 0 4 ：f 0 w l e re ta l ，2 0 0 5 ) 1 3 冷调控基因c o r 的研究 1 3 1 r 基因的发现 许多植物在经过0 以上至1 0 以下的低温锻炼后就具有抗冻能力，在一5 一3 0 甚至更低的冰冻温度下能够存活。这类植物共同的特征是具有冷驯化响应 ( c o l da c c l i m a t i o n 他s p o r 哟) 的特征。在这一过程中植物发生了一系列生理和生化变 化w e i s 盯( 1 9 7 9 ) 认为植物在低温锻炼过程中基因表达会发生了改变。g u ye ta l ( 1 9 8 5 ) 最先证实菠菜在低温锻炼中基因表达确实发生了改变，随后开始了分离冷调控基因 ( l d 陀趴l a t e dg e ，c o r ) 的工作。随后，相继被证明低温锻炼可以诱发许多基因 表达( 1 b m 船h o w ，1 9 9 4 ：h u g h e s ，1 9 9 6 ) 因此植物抗寒分子机理的研究是从研究 冷驯化过程中基因的表达开始的。 低温驯化诱导了大量蛋白质的合成，其中大多数既可对低温作出快速反应，又能 受a b a 和脱水胁迫的诱导，称为冷诱导基因( c o l d i n m l c e dg c n 船) 或冷调节基因 删d 玳g p l a t e dg e s0 rc o l d 一他s p 0 璐i v eg e m s ，c o r ) 。n 伽a s h o w ( 1 9 9 4 ) 从拟南芥 中分离鉴定了4 个抗寒c o r 基因：s h i l l o z a l 【i 和y a m a 目l c h i s 址埘啪( 1 9 9 6 ) 在拟南 芥中发现了一组抗旱基因( 他唧et o d e h y 血i t i 肌，r d ) ，d n a 序列分析结果表明， 其中两个c o r 基因与r d 基因是相同的，即足殆和剐) 2 9 a ，雕7 与肋7 分别 6 是同一基因。随后从拟南芥、油菜、苜蓿、菠菜、马铃薯、小麦、大麦等作物中也克 隆和鉴定了大量c o r 基因( 邓江明和简令成，2 0 0 1 ) ，如拟南芥中的魁m ， a 微丘6 仪w 2 ，c o r j 免，c 锨彳加j 7 ，尺嬲倪d 2 9 口红，订殆和e r d j d ，油菜中的 丑! 脚和尉w j j ，小麦中的黝脚2 d 和翮等。这些基因分别被称为u 1 ( 1 0 w 蛔叩哟：t i 鹏i i l d u c e d ) ，n ( c 0 1 di ! l d u c e d ) ，r d ( r e s p o l l s et od e h y d r a t i o n ) ，e r d ( e a d y d e h y d 瞰i o n 砌u c i b l e ) 等。 3 2 r 基因的功能研究 许多冷诱导基因编码产生l e a 蛋白或亲水多肽( 1 h o 蛐w ，1 9 9 8 ) 。根据氨基 酸序列的同源性将c o r 基因分为四类( 1 k m 础o w ，1 9 9 4 ) 。尽管它们编码的蛋白 质有所不同，但这些蛋白都具有极强的亲水性和热稳定性，能提高植物的抗冻能力。 例如，拟南芥抗冻基因忍，如是由低温、干旱和a b a 诱导表达的( n o m a s h o w ， 阴4 ) ，它编码一种1 5 k d a 的多肽。在输入叶绿体基质片层中后加工成9 佃a 的成熟 多肽c ( 琥酗肌( b a l ( 钉c t 甜，1 9 9 4 ；a n 吣e ta l ，1 9 9 6 ) 。此多肽是一个由1 3 种氨基酸 组成的基序( m o t i f ) 重复4 次排列，可形成亲水和亲脂性的a 螺旋。它具有高度的亲 水性，即使在沸水中仍能保持溶胶状态。加t 姻c ta l ( 1 9 9 6 ) 构建了组成型表达 r j 鲥m 多肽的转基因的拟南芥，对c d r j f 毙转基因拟南芥叶绿体、原生质体的抗 冻性进行了比较研究。结果表明，c 伽j 铴转基因拟南芥叶绿体的抗冻能力比对照提 高l 砣，但冷锻炼的拟南芥叶绿体的抗冻能力比对照提高了6 ( 觚u se t2 i l ， 1 9 9 6 ) 。a d 吹j 砌转基因拟南芥原生质体在一8 一一4 范围内保持较高的存活率， 经冷锻炼的拟南芥原生质体在8 2 范围内也具有较高的存活率。因为一4 一一2 的低温对细胞的伤害是由于细胞的扩张所引起的细胞溶解；在一8 一一4 的低温 下，主要是由于形成六角形相脂。由此推测c o r l 5 a 基因的表达可减少膜遇冷时 所产生的由膜脂双层向六角形相转变的几率( s t e p 0 i 】k 嵴na 1 ，1 9 9 8 ) 。于是， 融：p 0 i 岫( 1 9 9 8 ) 等提出内部弯曲假说( 砷r i i 娥c u r v 孤聆1 1 y p o t h e s i s ) ：某些两亲性 的a 螺旋对膜磷脂层内部的弯曲有很强的作用，并影响它们形成六角形i i 相。很好地 解释了c 0 吸j 鲥伪增加植物细胞抗冻性的机制，同时也可以解释其它类c o r 基因编 码的亲水多肽的作用，它们均具有两亲性。 同时，人们在研究中也看到，c d 贝j 勘转基因拟南芥在器官和细胞水平( 叶绿体、 7 原生质体) 的抗冻性提高了，但是在整个植株水平上的抗冻性却没有显著提高人们 认为其原因可能是低温驯化诱导多个c o r 基因共同表达并协同发挥抗冻作用，而不 是由单个c o r 基因来提高植物的抗冻能力， 1 4 冷相关基因的调控途径 1 4 1l c e l 转录蛋白 弛1 0 u re ta l ( 1 9 9 8 ) 根据低温胁迫下c b f 转录物迅速积累、c b f 调控发生在转 录水平以及c b f 启动子能介导转基因植株中g u s 报告基因的低温诱导表达等研究结 果，提出了一种模型：正常生长温度下植物体内存在有一种转录因子c b f 表达诱导 物i c e ( i 1 1 d u c e ro f c b fe x p 代s s i o n ) ，该转录因子能识别c b f 启动子并在低温反应中 被激活。在温暖的环境条件下，妃芑处于一种不活动状态，其原因可能是它被一种负 调节蛋白分隔在细胞质中，或者以不能与d n a 结合或不能有效激活转录的形式存在。 然而，一旦植株经受低温，就会激活一条信号转导途径，导致此匹或相关蛋白的修饰， 识别每一c b f 基因启动子中存在的一个冷调控元件( i c e 盒) ，从而使此冱能诱导 c b f 基因的表达。 最早分离得到i c e 是，c h i n n l 玛锄ye ta l ( 2 0 0 3 ) 采用p c b 丹? ? 三生物荧光遗 传筛选的手段，从一种突变体鉴定了c b f 3 上游一个转录因子基因，命名为诚i u r o f c b fe x p s s i o nl ( 腰j ) 。赢凹j 突变体内c ! 鹏不能表达并减少众多c b f 下游靶基 因的表达水平( c l l i 】珊姗ye ta l ，2 0 0 3 ；l e ta l ，2 0 0 5 ) ，同时，耙e j 突变体明显影 响了植株的耐寒性和冷驯化过程。i c e l 编码一个m y c 类型碱性螺旋一环一螺旋 上昆胁如q p j l p 船( 6 _ 脚) 转录因子，当冷胁迫时，它结合在c 鹏上游的顺式元件 m y c 上，并激活侧的表达。另一方面，组成超表达圮e j 增强了