（作物遗传育种专业论文）油菜细胞质雄性不育系681a恢复基因的定位.pdf

油菜细胞质雄性不育系6 81 a 恢复基因的定位 摘要 油菜( b r a s s c a n a p u sd 是一种具有显著杂种优势的作物，利用细胞质雄l 生不 育( c m s ) 三系制种是油菜杂种优势利用的主要途径。近年来，玉米、水稻等作物 的细胞质雄性不育机理及其育性恢复研究取得了长足的进展。甘蓝型油菜细胞质雄 性不育系6 8 1 a 是湖南农业大学油料作物研究所选育的新型雄性不育系，并选育成了 其稳定的保持系6 8 1 b 和恢复系7 1 4 。本研究以甘蓝型油菜c m s 系6 8 1 a 、保持系 6 8 1 b 、恢复系7 1 4 及其杂种后代为材料，对育性恢复进行了遗传分析，对育性陕复 基因进行了分子标记，取得了以下结果： 1 对甘蓝型油菜c m s 系6 8 1 a 、恢复系7 t 4 及其杂种f 1 、f 2 代育性分离观察初 步分析表明，控制该细胞质雄性不育性育性恢复的基因为单一显性基因。 2 以甘蓝型油菜c m s 系6 8 1 a 、恢复系7 1 4 及其组合鹤l a 7 1 4f 2 群体l l o 株为材料，利用群分法( b s a 法) 进行细胞质雄性不育恢复基因定位。通过5 0 0 个 1 0 一m e t 随机引物的p c r 扩增分析，发现1 6 的引物在雄性可育、雄性不育两池问表 现出多态性，并找到了个与甘蓝型油菜c m s 恢复系7 1 4 中的恢复基因紧密连锁的 分子标记s 1 0 3 9 锄，该标记与恢复系7 1 4 的恢复基因的交换值为5 4 5 ，遗传距离 为5 4 7 c m 。 关键词：甘蓝型油菜；c m s ：恢复基因；r a p d 分析 m a o # n g o far e s t o r e rg e n ef o rt h e r a p e s e e d ( b r a s s i c a n a p t i sl 1c y t o p l a s l i c m l a l e s t e r i l el i n e6 8 1 a a a s l a r a c t jr a p e s e e d ( b r a s s i c ar g 矽u sl ) d e m o n s t r a t e sr e m a r k a b l eh e t e r o s i s h y b r i d s e e dp r o d u c t i o nw i t ht h eh e l po f c y t o p l a s m i cm a l es t 咖i t yi so n eo f t h em o s ti m p o r t a n t w a y st o u t i l i z a t i o no fh e t e r o s i si nr a p e s e e d i nr e c e n ty e a r s ，b a s i cr e s e a r c h e so nt h e m e c h a n i s mo f c y t o p l a s m i cm a l es t e r i l i t ya n d i t sf e r t i l i t yr e s t o r a t i o nh a v em v a n c e d g r e a t l y i ns u c hc r o p sa sm a i z ea n dr i c e an e wr a p e s e e dd o u b l e l o wc m sl i n e6 8 1 a ，i t s m a i n t a i n e r6 8 1 ba n di t sr e s t o r e r7 1 4w e r ed e v e l o p e db yt h ei n s t i t u t eo f o i lc m p s ，h u n a n a g r i c u l t u r a lu n i v e r s i t y u s i n gc m s l i n e6 8 1 aa n di t sm a i n t a i n e r6 8 1 b i t sr e s t o r e rl i n e7 1 4 a n d6 8 1 a 7 1 4f i ，f 2a st h em a t e r i a l s ，w ec a r r i e do u tt h eg e n e t i cs t u d i e so ff e r t i l i t y r e s t o r a t i o na n dm o l e c u l a r m a p p i n g o f t h er e s t o r e rg e n e t h e f o l l o w i n gc o n c l u s i o n sc o u l db e d r a w n ： 1 o b s e r v a t i o no nm a l ef e r t i l i t yo f t h ec m sl i n e6 8 1 at h er e s t o r e r7 1 4a n d6 8 l a x 7 1 4 f ta n df 2p o p u l a t i o n ss h o w e dt h a tf e r t i l i t yr e s t o r a t i o no ft h ec m sl i n e6 8 1 ai s c o n t r o l l e db ya s i n g l ed o m i n a n tg e n e 2 t h ec m sl i n e6 8 1 a t h er e s t o r e r7 1 4a n df 2 p o p u l a t i o n so f 6 8 l a x 7 1 4 c o n s i s t i n go f 11 0p l a n t sw e r eu s e df o rm o l e c u l a rm a p p i n go ft h er e s t o r e rg e n eb yb u l ks e g r e g a n t a n a l y s i s ( b s a ) 5 0 01 0 - m e r r a n d o m p r i m e r s w e r ec h o s e nf o rp o l y m e m s ec h a i nr e a c t i o n ( p c 鼢a m p l i f i c a t i o n i ti sf o u n dt h a tt h ep o l y m o r p h i m ab e t w e e nt h et w ob u l k sm a l e f e r t i l ea n dm a l es t e r i l ec o u l db ed e t e c t e db y1 6 o f t h e p r i m e r s , a n d t h er a p dm a r k e r s 1 0 3 2 0 w a s t i g h t l y l i n k e d t o t h e i l t o l e t g e n e o f t h er e s t o r e r 7 1 4 w i t h t h ec r o s s o v e r o f 5 4 5 a n d g e n e t i c d i s t a n c eo f 5 4 7 c m k e yw o r d s l ：m p e s e e d ( b r a s s i c an a p , u sl ) ；c y t o p l a s m i cm a l es t e r i l i t y ；r e s t o r e rg e n e ； r a p d a n a l y s i s 独创性声明 本人声明所里交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖南农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：起：系易不 时间：7 卯；年6 月拥 关于论文使用授权的说明 本人完全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意湖南农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：起寻。毛永时间：聊；年月矽日 j 导师签名：时间：叨，年占月7 日 缩略词表 缩写英文全文中文翻译 a f l p a m p l i f i e df i a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m 扩增片段长度多态性 a m pa m p i c i l l i n 安苄青霉素 b d b a s e p a i r 碱基对 b s ab u l k e d s e g r e g a n ta n a l y s i s 群分法 c m c e n t i m r g a n s 厘摩 c m s c y t o p l a s m i cm a l es t e r i l i t y 细胞质雄性不育 d n a d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d脱氧核糖核酸 e t b re t h i d u r nb r o m i d e溴化乙锭 f wf r e s hw e i g h t鲜重 1 p t g i s o p r o p y l t h i o - 3 一d - g a l a c t o s i d e 异丙基硫代一b d - 半乳糖苷 k a c p o t a s s i u m a c e t a t e乙酸钾 l bl u r i a - b e r t a n im e d i t t r nl b 培养基 m t d n am i t o c h o n d r i a ld n a线粒体d n a n a a cs o d i u ma c e t a t e乙酸钠 n i l s n e a r - i s o g e n i cl i n e s 近等基因系 n m sn u c l e a rm a l e s t e r i l i t y 细胞核雄性不育 o d o p t i c a ld e n s i t y 光密度 p c r p o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n聚合酶链式反应 o t l q u a n t i t a t i v et r a i tl o c i 数量性状座位 r a p dr a n d o m a m p l i f i e dp o l y m o r p h i c d n a随机扩增多态性d n a r f l pr e s t r i c t i o nf r a g m e n t l e n g t hp o l y m o r p h i s m限制性片段长度多态性 r n a s er i b o s o m en u c l e a ra c i dm e r a s e核糖核酸酶 r p m r o u n d p e r m i n u t e转每分钟 s c a r s e q u e n c ec h a r a c t e t i z e da m p l i f i e dr e g i o n特征性片段扩增区域 s d ss o d i u m d o d g y ! s u l f a t e 十二烷基硫酸钠 s s r s i m p l es e q u e n c er e p e a t s 简单重复序列 x - g a l5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o l y l p - d - g a l a c t o s i d e5 - 溴4 氯3 - 吗i 哚- p d 半乳糖苷 月u舌 油菜是我国重要的油料作物。据联合国粮农组织2 0 0 0 年统计，我国油菜栽 培面积约7 8 1 0 6h m 2 ，单产达l ，3 8 5 k g h m 2 ，总产达1 0 8 1 0 6 吨，居世界油菜 生产国首位。1 9 8 5 2 0 0 0 年我国通过审定的双低品种共9 0 个，其中常规品种6 1 个，杂交种2 9 个，与双高常规品种比较，优良的双低常规品种产量己超过5 左 右，优良的双低杂交种产量已超过1 5 2 0 i l “。 2 0 世纪5 0 年代初期，我国种植的油菜以白菜型和芥菜型品种为主，虽然这些 品种具有早熟、耐寒等特点，但籽粒小、抗病性差、产量低。我国于2 0 世纪4 0 年代从日本引进了甘蓝型油菜品种( 胜利油菜) ，尽管当时胜利油菜比白菜型和 芥菜型油菜品种增产3 0 5 0 ，但由于需肥水量大、生育期长、栽培技术体系不 成熟，因此甘蓝型油菜一直未能大面积推广。甘蓝型油菜具有品质优，产量高等 特点，是油菜中最重要的栽培种。自新中国成立后，我国确定了以发展甘蓝型油 菜为主的生产方向，至今已连续进行了三次品种更换。据专家预计今后3 5 年内 我国将基本普及双低品种，甘蓝型黄籽双低品种种植面积将迅速扩大，细胞质雄 性不育杂种和细胞核雄性不育杂种仍然是两个主要利用途径：3 年左右杂交种种 植面积将超过总面积的5 0 ；育种方面，在降低硫甙的同时，提高含油量和抗病 性将作为重点。 雄性不育在高等植物中是一种非常普遍的现象，根据其遗传本质可分为细胞 质雄性不育( c m s ) 和细胞核雄性不育( n m s 或g m s ) 两种。n m s 不育性主 要由核基因控制，属于孟德尔式遗传，c m s 其雄性不育性则是通过母系遗传而 得到保存。c m s 在高等植物中比较常见，已在1 5 0 多种植物中观察到【5 】。植物 细胞质中的遗传物质存在于线粒体和叶绿体中。玉米、大麦、油菜等作物线粒体 基因组普遍存在重排现象，也正是因为这种重排引起线粒体基因组的组织结构发 生改变，从而产生新的嵌合基因或改变其下游紧邻基因的表达模式和功能从而影 响育性表现。c m s 广泛应用在杂种优势利用上，同时也是研究花粉发育、细胞 质遗传与核质互作的重要材料。油菜、水稻、玉米等作物都各已培育出了数十种 细胞质雄性不育系，但有不少存在育性不稳定、结实率低等缺点。此外，还有一 些具有多个优良性状的不育系由于找不到恢复系，而不能应用于商业化生产 【6 7 1 。 与其它大田作物相比，油菜在杂种优势利用上具有以下特点：杂种优势强， 增产效果显著。杂种制种技术易于掌握，制种产量高而稳定。繁殖系数高， 种子成本低。油菜利用杂种优势的途径有多种，其中c m s 系统是目i j 国际上公认 的应用最多和最具有实用价值的育种系统，世界各国研究利用的油菜细胞质雄性 不育类型主要有：波罩马胞质不育型( p 0 1c m s ) 、n a p 胞质不育型( n a pc m s ) 、萝 h 胞质不育型( o g uc m s ) 、陕2 a 胞质不育型( 陕2 ac m s ) 等【4j 。目前生产中应用的 c m s 材料主要是通过寻找天然的细胞质雄性不育材料，即那些细胞质m t d n a 自发 突变而形成的c m s 类型，如p o lc m s 、o g uc m s ；也可利用有性杂交，包括种、属 问的远缘杂交、回交，进行核代换获得新的c m s 类型，如o g uc m s 、n a pc m s ；广 泛应用的原生质体融合技术，是通过进行细胞质核置换或细胞器及m t d n a 重组而 获得新的c m s 类型，或改良现有的c m s 类型，如改良的o g uc m s 。随着生物技术 手段的进步，通过基因工程的方法也可创造新的c m s 系【8 j 。 导致油菜细胞质雄性败育的原因已从细胞学和生理生化上进行了阐明，其研 究成果也已应用于杂种油菜的生产1 9 】。分子水平上的研究表明，线粒体可能是绝 大多数c m s 的遗传载体，即细胞质雄性不育与线粒体基因突变有关。通过比较油 菜f 常胞质与n a pc m s 胞质酶切m t d n a 片段时发现，雄性不育植株具有一条特异 的2 5 k bn c oi 带和7 o k bn r ui 带，序列分析表明，这些特异片段区域存在一 个新的开放阅读框o r f l 3 8 ，o r f l 3 8 是o g uc m s 所特有的，它在o g uc m s 中起重 要作用，其恢复基因不改变o r f l 3 8 的转录模式，而是专一降低花及叶中该蛋白 的含量。研究表明【l 叫a t p 6 基因的附近区域与p o lc m s 有关。p o lc m s 的a t p 6 基 因上游发生分子重排，产生一个编码2 2 4 个氨基酸的o r f 2 2 4 ，表现为p o c m s 胞质不育的杂种后代都含有o r f 2 2 4 a t p 6 基因座位，这一基因座位与p o lc m s 性 状是高度连锁的【l ”。n a pc m s 在其线粒体基因组中存在一特异的编码2 2 2 个氨基 酸的阅读框，与o r f l 3 9 基因共转录。o r f 2 2 2 基因仅存在于n a pc m s 中，在正常 胞质的甘蓝型油菜中没有发现此基因。o r f 2 2 2 与o r f 2 2 4 的核苷酸序列有8 5 同 源性，二者编码的蛋白质有7 9 的相似性【l 孙。油菜中，各种不同的c m s 类型与雄 性不育有关的线粒体基因均有其特殊的转录和特异的多肽，因此也可以作为一个 c m s 分类的依据。 油菜c m s 系育性表现很容易受到外界环境条件的影响，尤其是温度，如低温 诱导产生微粉。通常的解决办法是根据种植地区的气候，确定不育系安全的始花 期，从而调整播期。也可以通过育种途径加以解决，如筛选缺乏温度敏感基因的 保持系，因为c m s 对温度敏感与否决定于细胞核。 c m s 是一种错综复杂的生物学现象，其不育机制存在两种假说。一是认为c m s 有关基因与f 常线粒体基因共转录，通过影响后者的表达，而使线粒体正常功能 受到损伤，引起花粉败育，即“能量亏空”假说；二是认为c m s 有关基因转译成 毒性蛋白，直接或间接破坏线粒体的正常功能而引起花粉败育，即“毒蛋白”假 说。这两种假说都缺乏有说服力的证据。普遍认为恢复基因的转译产物可以作用 于c m s 有关基因，抑制其表达，使线粒体功能恢复正常。 油菜c m s 分子机理的研究为改良或创造新的c m s 材料奠定了理论基础，传统 的有性杂交不会改变m t d n a 的结构而产生新的不育胞质，利用原生质体融合技术 不仅可使两融合亲本的核基因重组，也可使m t d n a 重组，从而为创造新的胞质不 育材料提供可能。以种子为收获对象的杂种作物能应用于生产的关键之一就是 f 。具有高的结实率，而这一特性往往是由恢复系具有的恢复基因决定的。因此， 要实现高产与优质，除要解决当前不育胞质存在的问题外，还必须要实现对恢复 系的培育和改良。 p o l c m s 和n a p c m s 是甘蓝型油菜的主要c m s 类型。遗传研究表明它们是 由两个不同位点的r 龟和r f n 显性恢复基因控制其育性恢复。r 审基因作用是使 m t d n a 的2 2 k b 和1 9 k b 转录本被5 到3 外切核酸酶降解成1 4 k b 和1 3 k b 的产物，且这种降解过程只限于雄蕊和花瓣【l ”。“掣”】通过研究发现，r f n 、r 昂 基因是等位的。油菜r f 位点上有3 个不同的等位基因r f p 、r f n 和r f ，其中r f p 恢复p 0 1 c m s 育性，调控p 0 1 c m so r f 2 2 4 a t p 6 转录本的加工；r f n 恢复n a p c m s 育性，调控n a d 4 、i ，c c l 1 和o r f 2 2 4 n a d 5 o r f l 3 9 转录本的修饰：r f 不能恢复任何 c m s 育性，也不能调控线粒体转录本的加工。不同c m s 类型有关线粒体基因的 高度同源和一个恢复基因的不同等位基因能恢复几种c m s 类型的育性是油菜的 特有特征。总之，育性的表现是细胞质不育基因与细胞核内恢复基因以及外界环 境因素共同作用的结果。 自傅廷栋1 9 7 2 年在欧洲甘蓝型春油菜品种中发现波里马细胞质雄性不育以 来，各国学者对恢复基因的筛选和遗传作了大量的工作。大量研究表明，甘蓝型 油菜波里马细胞质雄性不育的恢复基因为1 2 对主效基因【l2 ”。6 j 。目前，世界 上用于育种的恢复源主要是“意大利油菜”。我国许多育种单位利用该系统选育 出一系列甘蓝型“三系”优质油菜杂交种，如秦油2 号、华杂3 号、豫油4 号、 陕油8 号【 】等。这些品种虽比常规品种表现出较强的杂种优势，但其增产幅度还 不够理想，因此要大幅度提高c m s 杂种的产量和抗病、抗虫能力，最主要的是扩 大恢复源，提高恢复系在产量和抗性方面的配合力，拓宽恢复系与不育系之间的 遗传距离，多亲本复合杂交是恢复系改良的有效方法【l ”。 在作物育种中通常将与育种目标性状紧密连锁的遗传标记用来对目标性状 进行跟踪选择。传统的遗传标记主要包括形态标记和细胞学标记，随着遗传学、 生物化学和分子遗传学的发展，出现了同工酶标记和d n a 标记等分子标记。d n a 分子标记与形态标记、细胞学标记、同工酶标记等相比，有着显著的优越性：对 表型无影响；大多数分子标记是共显性的：对隐性农艺性状的选择十分便利：基 因组核苷酸序列的变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的：在发育的不同 阶段、不同组织的d n a 都可用于标记分析，这有助于克服早期选择的盲目性，可 以跟踪目标基因转移的情况。d n a 标记还不受植株生长发育环境条件的限制和影 响。 r a p d 分析是一种基于p c r 的分子标记技术。与r f l p 、a f l p 、r f l p 等其它分 子标记技术相比，r a p d 分析程序较简单、周期短、自动化程度高、所需d n a 量 少，质量也要求不高，因而被广泛用于基因的快速定位、遗传图谱构建、亲缘关 系鉴定以及抗性筛选等领域0 9 - 2 0 】。r a p d 分析的重复性倍受争议，但众多研究者 证明在同一型号的p c r 仪上采用相同条件都能得到很好的重复。r a p d 标记可有 效地定位玉米、水稻等作物雄性不育相关基因和c m s 恢复基因【2 1 2 ”。油菜应用 该技术已经定位了许多重要的基因【1 92 m 5 1 。对育性恢复基因的定位最初是应用 经典遗传学的手段将其定位于某一染色体上，不同的植物定位的方法不同。水稻 基因定位常采用标记基因分析法、初级三体分析法和相互易位分析法；小麦一般 采用单体分析法；玉米育性恢复基因定位主要相互易位系法。这些方法的缺点是 很难排除非整倍体本身对育性表型的影响。很少能把某一恢复基因确切地定位到 某一特定的染色体上。近几年来，随着分子水平r f l p 、a f l p 、r a p d 、s s r 等 技术的应用，恢复基因可以用分子生物学的方法定位于d n a 的某个较小的片段 上。分子标记技术使基因定位在速度、广度和精度三个方面均有显著的提高。下 表是近几年来油菜、水稻、玉米等作物c m s 育性恢复基因定位的研究概况【9 】： 几种主要作物c m s 育性恢复基因分子标记结果 标记标记与r f 阃 作物c m s恢复标记 r f 两侧标记所在的遗传距离参考文献 种类类型基因类型 连锁群( e m ) r a p do p c 0 2 1 1 5 0 r f od y l 5d e l o u n n e 等，1 9 9 4 油 o g u r f l po p d 0 2 1 0 0 0 r f or a p do p k l 2 7 5 0 12h a n s e n 等1 9 9 7 r a p d4 n d 7 b r f d1 81 0 8 ，5 4j e a n 等。1 9 9 7 r f l p5 e 1 2 b p o l 蕖 a h l 9 , s r f br a p d5 9 。1 36土俊霞等i ”，2 0 0 0 a l l 6 8 3 0 水 r f ls s r0 s s r f3 7 a k a g i 等，1 9 9 6 r a p df l 6 0 l r f l1 0 c4 0l c h i k a w a 等，1 9 9 7 b t r f l pg 2 1 5 5 r f l pc 1 6 1 4 4 r n1 0粱国华等，2 0 0 1 s s rg 2 9 l3 33 稻 h ls s rr m 2 5 8t o7 8黄青阳等，1 9 9 9 4 水 r f l p d 、 ，a r f - d ( t ) 1 066 谢建坤等”i ，2 0 0 1 s s l p r g 6 9 a r g 4 1 333 20 b r f l p拿、f 等，1 9 9 6 稻c 2 2 r g 4 4 9 d480 0 r a p dr g 5 3 2 r f 3ll4 ，19 z h a n g 等1 9 9 7 r f l pr g l 4 0 爪g 4 5 8 r g 5 3 2 ，r 17 3 160 ，1 84 r f l py a o 等，1 9 9 7 w a g 4 0 3 ，c 2 3 4l o3 3 ，1 9 1 a f l pe a g c m c a a4 7何光1 # 等”i ，2 0 0 0 s s r0 s r 3 3l o l3 6景润春等，2 0 0 0 1 0 8 r f 5r f l p o p b 0 7 “o ls h e n 等，1 9 9 8 8 8 r nr f l pi l m c9 7 ，u m c 9 23 s12 ，95w i s e 和s c h n a b l e ，1 9 9 4 t r f 2r f l po n l c1 5 3 $ l 1 5 l9 l38 58w i s e 和s c h n a b l e ，1 9 9 4 型 下 r f 8a f l pa r f 845w i s e 等1 9 9 9 r f 3r f l p w h p l ，b n l 71 4 2 l43 ，6 4 k a m p s 和c h a s e ，1 9 9 7 s r a p do p e 0 8 1 2 0 0 型 r o2 l27 48 石永刚等，1 9 9 7 米r f l pu m c 4 9 r f 4r f l p n p i 2 2 0 ，c s u 2 9 8 s7 1 ，1 8 8汤继华等，2 0 0 1 c 型 1 2 3汤继华等 3 2 i ，2 0 0 1r f 4s s r b n l 9 2 3 0 7 8 s 注：- 标记j r z 8 1 l 的遗传距离：b 标记与区间左边的遗传距离；g 标记与r g 3 7 4 和r g 3 9 4 的遗传距离 群分法( b s a ) 结合分子标记技术能有效地进行质量性状分析，也使数量性 状q t l 效应的测定成为可能。b s a 法是从近等基因系( n i l s ) 法演化而来，它克 服了许多作物没有或难以创建相应近等基因系的限制。与n i l s 法相比，b s a 法 无须多代回交，时间短，更易获得分离群体，而两者在标记基因的效率上是同等 的，因此具有广泛的应用前景。对于尚无连锁图或连锁图饱和程度较低的植物， 利用b s a 法是快速获得与目的基因连锁的分子标记的有效方法。利用b s a 法已对 多种作物的育性基因、抗性基因等许多重要质量性状进行了标记与定位【3 ”】。 甘蓝型油菜细胞质雄性不育系6 8 1 a 是以双低油菜品种湘油1 3 号中的天然变 异株2 2 4 - 2 为材料，通过自身微粉保持，多代回交选育而成的优良甘蓝型油菜细 胞质雄性不育系【3 “。该不育系不育株率达1 0 0 ，不育度达9 5 以上，且不育性稳定 并已成功实现三系配套。恢保关系测验结果表明，该不育系与p o lc m s 系有着相 同的恢保关系，其育性表现与大多数p o lc m s 系一样，存在微量花粉问题。恢复 系7 1 4 是从芥菜型油菜与甘蓝型油菜种问杂交后代中分离出来的一个新型甘蓝 型油菜恢复系【3 7 】。前人研究表明，恢复系7 1 4 可恢复波罩马和6 8 1 a 细胞质雄性 不育，但是该恢复基因的来源尚不清楚。为了能充分利用这一恢复基因资源，加 快油菜恢复系选育和转育，本实验用r a p d b s a 法以6 8 1 a 7 1 4f 代群体为材料 进行甘蓝型油菜细胞质雄性不育恢复基因分子标记研究，以期能找到与恢复基因 紧密连锁的分子标记。利用这些与恢复基因紧密连锁的分子标记就有可能克隆恢 复系7 1 4 中的恢复基因。通过分子标记辅助选择和转育恢复基因，可以解决强优 组合的问题。 6 油菜细胞质雄性不育系6 8 l a 恢复基因的定位 l 材料与方法 1 1 试验材料 甘蓝型油菜细胞质雄性不育系6 8 1 a ( 5 0 株) 及其恢复系7 1 4 ( 5 0 株) ，6 8 1 a x 7 1 4 f 2 群体( 1 2 8 株) ，芥菜型油菜紫叶芥、四川黄籽和永平黄籽。实验材料于2 0 0 1 年9 月播种，同年1 1 月问苗后定植于湖南农业大学油料作物研究所实验地。 1 2试验方法 1 2 1 雄性育性观察和分类 将f 2 群体( 1 2 8 株) 所有单株进行编号，于花期( 2 0 0 2 年3 月5r 2 0 0 2 年3 月1 6r ) 进行雄性育性调查，每个单株至少观察3 次，每次至少调查5 朵花。育性 分类标准参照杨光圣等的7 级分类标准 3 8 】进行，将属于3 级的植株定为雄性不育 株，4 - 6 级的植株定为雄性可育株。 1 2 2 总d n a 提取 油菜单株总d n a 提取参考刘春林【3 9 1 等s d s 法并稍作修改进行。具体做法是： 取l g 嫩叶，液氮研磨成粉末，加入4 m l 提取液( 按4 9 l g f w1 3 一巯基乙醇新配d n a 提取液) ，充分混匀，冰上静置5 m i n ：剪口吸头吸取上清5 0 0 i _ t l ，每株提取2 管，转 入e p p e n d o r f 管，6 5 水浴3 0 m i n ；加入等体积的氯仿异戊醇( 2 4 ：1 ) ，混匀，冰上 静置5 m i n ，1 2 0 0 0 r p m 离心5 m i n ( m i k r o2 2 r 型台式冷冻离心机) ；转上清，加入 等体积的氯仿异戊醇( 2 4 ：1 ) ，摇匀，1 2 0 0 0 r p m 离心5 m i n ；转上清，加3 mn a a c 至终浓度o 3 m ，摇匀，2 倍体积无水乙醇于一2 0 沉淀d n a3 0 m i n ：1 0 0 0 0 r p m 离一1 1 , 5 m i r a 小心到掉上清，吹千；2 0 0 i t l 灭菌超纯水溶解，加入煮沸过的r n a s e ( 1 0 r n g m 1 ) 2 9 1 ，3 7 酶解l h r 加等体积氯仿异戊醇( 2 4 ：1 ) 纯化，1 0 0 0 0 r p m 离心3 m i n ；7 5 乙醇洗涤2 次，吹干即得d n a 。 1 2 3d n a 质量检测及浓度测定 采用b e c k m a nd u 6 4 0 核酸蛋白质分析仪进行检测，每个d n a 样品分别读取 2 6 0 n m 和2 8 0 n m 处o d 值，按公式“样品d n a 浓度= 0 d 2 6 0 x 5 0 肛g m l x 稀释倍 数”计算。0 d 2 6 0 ，o d 2 8 0 比值在1 8 左右的d n a 样品再通过0 8 琼脂糖凝胶电 泳检测其质量( 图1 ) 。 图l 恢复系7 1 4 、c m s 系6 8 1 a 及其f l 、f 2 代单株总d n a f i g 1g e n o “cd n a o f r e s t o r e rl i n e7 1 4 、c m sl i n e6 8 1 aa n dt h e i rf i 、f 2 p l a n t s r ：恢复系7 1 4 ，a ：c m s 系6 8 1 a ，f i ：子一代单株，1 5 7 ：子_ 二代单株 r ：r e s t o r e rl i n e7 1 4 ，a ：c m sl i n e6 8 i a ，f i ：f lp l a n t ，1 5 7 ：f 2 p l a n t s 1 2 4f 2 不育d n a 池( m s b u l k ) 和可育d n a 池( r f - b u l k ) 的构建 根据3 次育性调查结果，从6 8 1 a x7 1 4f 2 分离群体中选取育性表现典型的 l o 个雄性不育单株( 单株编号分别为2 5 、3 1 、6 9 、7 7 、8 2 、9 5 、9 7 、1 1 1 、1 1 6 、 1 1 7 ) 和l o 个雄性可育单株( 单株编号分别为1 7 、2 l 、2 4 、2 7 、3 0 、3 2 、3 3 、 8 3 、8 8 、1 1 5 ) 的d n a ，用灭菌超纯水稀释到2 0 n g 1 p l 后，分别等量混合组成雄 性不育d n a 池( m s b u l k ) 和雄性可育d n a 池( r f - b u l k ) 。 1 2 5p c r 扩增条件优化 参照王俊霞掣1 9 1 ( 2 0 0 0 ) 和刘忠松等 2 0 1 ( 2 0 0 2 ) 的方法并进行优化，优化 后的扩增程序为：9 5 预变性3 m i n ，然后9 4 变性l m i n ，5 0 退火l m i n ，7 2 延伸l m i n ，2 个循环：9 4 变性l m i n ，3 8 退火4 5 s ，7 2 延伸l m i n ，4 0 个循 环，最后7 2 延伸l o m i n ，保存于4 c 。每一反应总体积为2 5 肚l ，由1 0 p c rb u f f e r 2 5 1 i 、m g c i 。( 2 5 r a m ) 2 5 1 1 、t a q 酶( 5 u 1 1 ) ( 购自华美生物公司) 0 2 4 1 1 ， d n t p ( 1 0 m m ) 0 6 2 5 1 i 、引物( 1 0 r a m ) 1 5 1 1 ( 购自上海生物工程公司) ，模板d n a ( 2 0 n g 1 * 1 ) 2 1 1 、灭菌超纯水1 5 6 3 5 9 i 组成。p c r 扩增反应在t - g r a d i e n t t h e r m o b l o c k ( b i o m e t r a 产品) 上进行。 8 1 2 6 多态性随机引物筛选和r a p d 分析 用可育池、不育池d n a 作模板，按上述优化条件和程序进行p c r 扩增分析 ( 图2 ) ，共选用5 0 0 个上海生物工程公司1 0 一m e r 随机引物( 附表2 ) 。将在雄性可 育池、雄性不育池问表现出多态性的引物再同双亲d n a 一起重复分析3 次，将 经证实可育池和恢复系7 1 4 与不育池和c m s 系6 8 l a 间确实存在特异带差异的 引物用于6 8 l a 7 1 4f 2 代1 1 0 个单株分析。 1 2 7 琼脂糖凝胶电泳和片段长度估计 取2 0 9 l p c r 扩增反应产物用1 6 琼脂糖凝胶( 1 0 0 m l 凝胶中含1 0 m g m l e t b r 溶液5 p a ) 进行电泳分析。1 2 0 v 电压进胶2 0 分钟，7 5 v 电泳7 小时后，将 凝胶在g e ld o c1 0 0 0 凝胶成像仪中成像。片段长度根据核酸分子量标准d 0 1 5 - 2 1 0 0 b pl a d d e rm a r k e r ( 北京鼎国生物技术发展中心) 进行估计。 2 结果与分析 2 1 甘蓝型油菜细胞质雄性不育恢复性的遗传分析 6 8 l a x 7 1 4 f 2 代育性分离调查结果( 附表1 ) 表明，雄性可育株为9 7 株，雄性 不育株为3 l 株。经x 2 测验( p o 9 5 ) 表明雄性可育株与雄性不育株的分离比例 符合3 ：l ，表明6 8 i a 的育性恢复基因由单一显性基因控制。 2 2 扩增多态性引物筛选和标记分析 对6 8 1 a 7 1 4 组合双亲及其f 2 代植株组成的不育池和可育池进行p c r 扩增， 共使用5 0 0 个1 0 m e r 随机引物，统计所有5 0 0 个引物的扩增结果，有4 6 7 个引 物获得了扩增产物，3 3 个引物无扩增产物，有效引物占9 3 4 ，共扩增出3 4 3 0 条带，平均每个引物扩增7 3 4 条带，最多的扩增出1 5 条带( 引物编号为s 1 0 3 8 ， 核苷酸序列为5 一t c g c g g a a c c 一3 ) ；其中经3 次重复扩增在不育池和可育 池之间表现出一致差异的引物s 1 0 3 9 ( 5 一g g c a a a g c t g 一3 ) ，在双亲( 恢 复系和不育系) 间扩增得到验证，即恢复系和可育池d n a 扩增产物比不育系和 不育池d n a 扩增产物多出了1 条估计大小为5 2 0 b d 的带( 图3 ) 。 9 图2 多态性随机引物筛选 f i g 2s c r e e n i n go f p o l y m o r p h i cr a n d o mp r i m e r s l 1 7 引物序号依次为：s 1 2 2 3 s 1 2 2 5 、s 1 2 6 3 s 1 2 6 7 、s 1 3 5 4 s 1 3 5 8 、s 1 4 0 1 s 1 4 0 4 1 1 7p r i m e fo r d e r ：s 1 2 2 3 s 1 2 2 5 、s 1 2 6 3 s 1 2 6 7 、s 1 3 5 4 s 1 3 5 8 、s 1 4 0 1 s 1 4 0 4 r ：恢复系7 1 4 ；f 可育池；s ：不育池；a ：不育系6 8 1 a ；m ：m a r k e r r ：r e s t o g el i n e7 1 4 ，f f e r t i l eb u l k ，s ：s t e r i l eb u l k ，a ：c m sl i n e6 8 i a 图3 特异引物s 1 0 3 9 p c r 扩增 f i g 3 p c ra m p l i f i c a t i o n b y u s i n gs p e c i f i c p r i m e r s l 0 3 9 r ：恢复系7 1 4 f ：可育池s ：不育池a ：c m s 系6 8 1 a r ：r e s t o r el i n e7 1 4 ，f ：f e r t i l eb u l k , s ：s t e r i l eb u l k , a ：c m sl i n e6 8 1 a 1 7 ，2 1 ，2 4 ，2 7 ，2 5 ：可育单株3 1 ，6 9 ，7 7 ，8 2 ，9 5 ：不育单株 1 7 ，2 1 ，2 4 ，2 7 ，2 5 ：m a l ef e r t i l ep l a n t s3 l ，6 9 ，7 7 ，8 2 ，9 5 ：m a l es t e r i l ep l a n t s 1 0 2 3 甘蓝型油菜细胞质雄性不育恢复基因与r a p d 标记的连锁分析 为了确定特异片段s 1 0 3 9 5 2 0 与恢复基因之间的遗传距离，用特异引物s 1 0 3 9 扩增分析6 8 1 a 7 1 4f 2 分离群体的1 1 0 个单株，特异带的分布( 图4 ) 统计结果 为：可育且有特异带共7 6 株，可育而无特异带共4 株( 植株编号为1 1 、1 0 2 、 1 1 8 、1 1 9 ) ，不育且无特异带的共2 8 株，不育但有特异带的共2 株( 单株编号为 2 9 、1 1 7 ) 。重组型个体的比例即重组率为5 4 5 ，经x 2 测验表明该r a p d 标记 s 1 0 3 9 5 2 0 符合孟德尔分离比例。遗传距离依据k o s a n b i 作图函数x = ( 1 4 ) l n ( 1 + 2 r ) ( 1 2 r ) 算出，x 以m ( m o r g a n ，摩尔根) 为单位，f 为重组率。遗传连锁分 析表明r a p d 标记带与7 1 4 恢复系中的雄性育性恢复基因之间的交换值为 54 5 ，遗传距离为5 4 7 e m 。 图4 双亲、两池及f 2 代单株d n a p c r 扩增 f i g 4 p c ra m p l i f i c a t i o no f p a r e n t s ，b u l k sa n df 2p l a n t s r ：恢复系7 1 4 ，f ：可育池，s ：不育池，a ：c m s 系6 8 1 a ，1 - 1 2 7 ：f 2 代单株，r r e s t o r el i n e7 1 4 f ：f e r t i l eb u l k 。s ：s t e r i l eb u l k ，a ：c m sl i n e6 8 i a 。i 1 2 7 ：f 2p l a n t s ， f 可育株，