基因工程的重组连接专家讲座

基因工程重组连接

——DNA连接酶基因工程的重组连接专家讲座第1页DNA连接酶概念：DNA连接酶存在于各种生物体内，其催化基本反应形式是将DNA双链上相邻3’羟基和5’磷酸基团共价形成3’-5’磷酸二酯键，使断开DNA切口连接起来，所以它在DNA复制、修复以及体内体外重组过程中起主要作用。分类：E.coliDNAligase:需要烟酰胺腺嘌呤（NAD+)作辅助因子，NAD++酶酶-AMP，同时释放出烟酰胺单核苷酸（MMN)活化酶复合物在DNA切口处修复磷酸二酯键，并释放AMP。T4DNAligase：由T4噬菌体基因编码，分子量约为60KDa。其活性以ATP为辅助因子，它与酶形成复合物，并释放磷酸焦磷酸基团。基因工程的重组连接专家讲座第2页基因工程的重组连接专家讲座第3页DNA连接酶当前基因工程所使用DNA连接酶多是起源于T4噬菌体T4DNA连接酶，因为它与大肠杆菌DNA连接酶相比，含有以下特点：修复双链DNA上单链缺口（二者均相同)，这是两种DNA连接酶基本特征；连接DNA-RNA杂交双链上DNA或RNA缺口，其中后者反应速度较慢；连接完全断开2个平头双链DNA分子，反应速度通常是粘头连接1/10-1/100，所以这种反应属于分子间连接，反应速度依赖于2个DNA分子与酶之间随机碰撞，所以速度较慢。不过若适当提升酶量以及底物浓度，或在反应体系中加入适量一价阳离子（如150-200mMNaCl)和低浓度PEG能够显著改进平头DNA分子连接。基因工程的重组连接专家讲座第4页DNA连接酶基因工程的重组连接专家讲座第5页DNA连接酶DNA连接反应影响原因1.酶活单位：1国际单位（U)T4-DNAligase定义为：在最正确缓冲系统及15℃，1h内完全连接1μgλ-DNAHindⅢ片断所需酶量。2.T4-DNAligase缓冲条件：50~100mmol/LTris-HCl(pH7.5)10mmol/LMgCl25mmol/LDTT

1mmol/LATP普通连接反应总体系控制在10-15ul内。一样T4DNA连接酶储备于50%甘油中，而过高甘油浓度对酶活也有抑制。所以酶总用量也不要超出总体系1/10。基因工程的重组连接专家讲座第6页DNA连接酶影响T4DNA连接酶连接反应原因：温度：大多数限制性内切酶产生粘性片段Tm为15℃，另首先T4DNA连接酶本身最适当反应温度为37℃，5℃以下活性大大下降。所以在实际操作中，我们多采取过夜15℃-16℃连接;离子浓度：过高或过低离子浓度会影响反应速度;DNA片段：DNA末端性质假如为粘性末端能够看作分子内连接反应;但假如为平头DNA分子之间连接，则是分子间连接，速度大大下降;DNA浓度、DNA片段大小

分子内连接：片段与载体摩尔数比=2：1—3：1

分子间连接：51.1/(DNA浓度：g/L)(分子量：dalton)值假如小于1则轻易发生分子间连接反应普通性规律是：DNA浓度越稀越轻易发生分子内连接反应。基因工程的重组连接专家讲座第7页DNA连接酶普通连接反应设计:总体系10ul10×buffer1ulVector(3k;500ng/ul)1ulDNAfragment(500bp;50ng/ul)3-5ulLigase0.5-1ulH2O加水至10ul基因工程的重组连接专家讲座第8页DNA连接酶重组率及其影响原因：重组率：是指连接反应结束后，含有外源DNA片段重组分子与所投入载体分子数之比；重组率与连接效率关系：普通情况下，连接效率越高，重组率越大（针对定向克隆而言)；假如外源DNA片段与载体DNA分子均是经过一个限制性内切酶处理，那么重组率和连接效率就成为了两个彼此独立事件了。所以在此过程中，连接产物就成为两种，即重组分子和载体自我环化或空载。此时连接效率就高于重组效率。所以有些办法能够提升连接效率不过并不意味着能够提升重组效率，如增加酶用量，延长反应时间等；怎样提升重组率：提升外源DNA片段和载体DNA分子之比（2-10：1)，这么就能够增加外源DNA片段和载体分子之间碰撞机会；降低载体分子之间以及载体DNA两个末端之间接触，从而降低载体自我环化；基因工程的重组连接专家讲座第9页DNA连接酶在连接前用碱性磷酸单酯酶处理载体DNA，去除其5’端磷酸基团，这么即使DNA载体分子两个粘性末端发生退火，也不能形成本身共价环化结构；在连接反应之前，用末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)在载体分子3’羟基末端聚合一段同种碱基寡核苷酸，预防载体分子之间以及两个末端自连，而在外源DNA片段3’端加上与之互补寡核苷酸，二者退火后再连接。基因工程的重组连接专家讲座第10页无反应基因工程的重组连接专家讲座第11页DNA连接酶DNA分子重组方法：相同粘性末端连接：假如外源DNA分子与DNA载体均使用相同限制性内切酶切割，则不论是单酶酶切还是双酶酶切，两种分子均含有相同粘性末端，所以混合后它们能够顺利连接成为一个重组分子。相同双酶酶切：定向克隆单酶酶切：重组分子有两种情况，即正方向插入和反方向插入。但不论怎样，用原有限制性酶切酶能够将外源片段DNA和载体DNA切开（怎样判定片段为正向或者反向插入)；用两种同尾酶分别切割DNA片段和载体DNA（如DNA建库中，Sau3AI酶切外源DNA，而-phage载体用BamHI处理)，其实产生了4个相同粘性末端，所以分子之间能够直接连接，但连接后大多数情况下是用原有两种同尾酶无法将片段和载体切开，这种酶切口称为“焊死”作用。当然少数情况下产生连接重组分子能够被一个酶切开（如能够被Sau3A切开)。基因工程的重组连接专家讲座第12页基因工程的重组连接专家讲座第13页DNA连接酶基因工程的重组连接专家讲座第14页DNA连接酶平头末端连接：T4DNA连接酶既能够连接粘性末端，也能DNA平头末端连接。前者属于分子内反应，后者属于分子间反应，所以从分子动力学角度来讲，后者反应复杂得多，也慢得多，普通只有前者速度1/10-1/100。

所以，怎样提升平头连接速度，包含：增加连接酶用量，但这种操作在实际上极难实现，因为体系中酶量增加无疑会影响甘油含量，对反应反而不利；增加平头末端浓度，从而提升分子之间相互碰撞机会；加入一定量NaCl(或LiCl)以及PEG（终浓度1%)；适当提升反应温度。因为平头末端连接不存在分子末端退火问题，所以提升温度，不但能够增强连接酶活性，还有利于提升分子之间碰撞机会。反应温度在平头连接中多采取20℃-25℃；体系中高浓度ATP为平头末端连接不利原因。ATP浓度1mmol/L会发生A在连接位点随即插入；ATP浓度2.5mmol/L，会直接抑制平头末端连接反应。所以对大多数反应来说ATP浓度0.5mmol/L是比较适当；对于平头末端连接效率：HacIIIAlaIHacIISmaI基因工程的重组连接专家讲座第15页DNA连接酶不一样粘性末端连接：不一样粘性末端在标准上无法直接连接，不过能够将它们转化位平头末端后再进行连接待连接两种DNA分子含有5’突出末端：两种分子均用Klenow酶补平，或用S1核苷酸酶切平，然后变成平端连接。普通用Klenow酶补平多见。而S1核苷酸酶不好掌握，轻易造成双链DNA降解反应;待连接两种DNA分子均含有3’突出末端：T4DNA聚合酶能够将这两种DNA3’突出末端切除，形成平头后再连接，所产生重组分子降低了碱基对;一个DNA分子含有突出3’末端，另一个含有5’突出末端：普通采取T4DNA聚合酶切除3’突出末端;5’突出末端用Klenow酶补平，再进行连接;两种DNA分子分别含有不一样2个粘性末端：每一个DNA分子均用T4DNA聚合酶切平3’突出端;用Klenow酶补平5’突出端基因工程的重组连接专家讲座第16页基因工程的重组连接专家讲座第17页基因工程的重组连接专家讲座第18页DNA连接酶人工粘性末端连接：上述不一样粘性末端连接大多数破坏了原有限制性内切酶识别序列，造成重组外源DNA片段不能回收，同时平末端连接效率低下。为克服这些缺点，能够用TdT处理经过酶切DNA片段，使之在3’加上同聚物尾，再进行连接。5’突出末端：DNAKlenow酶补平以TdT加上多聚C人工粘性末端;

退火再用Klenow填补缺刻载体Klenow酶补平以TdT加上多聚G人工粘性末端;3’突出末端：直接用TdT在3’末端加上两种多聚物人工粘性末端退火Klenow填补缺刻平头末端：直接使用TdT加上多聚物人工粘性末端退火连接Klenow修补缺刻，但与前二者不一样之处是不能用原来平口限制性内切酶切割。基因工程的重组连接专家讲座第19页DNA连接酶基因工程的重组连接专家讲座第20页DNA连接酶基因工程的重组连接专家讲座第21页DNA连接酶基因工程的重组连接专家讲座第22页DNA连接酶酶切位点定点变更：在有分子克隆试验中，需要将DNA上一个限制性内切酶识别序列变成另一个酶识别序列，方便DNA分子重组。有两种方法能够到达该目标：加装人工接头：接头是一段含有一个限制性内切酶识别序列人工合成寡核苷酸，通常为8-10聚体。若DNA分子为平头末端，直接加上人工接头;DNA分子若为酶切后粘端，则依照5’突出端用Klenow酶补平以及3’末端用T4DNA聚合酶切平标准，把粘端变为平端，同时消除原有酶切位点，再加上人工接头;改造识别序列：用一个限制性内切酶识别序列，改造另一个酶识别序列，使前者移到后者位置上。

如将Alu识别序列改造成为EcoRI识别序列。Alu切开DNA片段DNA连接酶连接2个片段Alu转变为EcoRIEcoRI切开另一条DNA片段Klenow酶补平粘性末端

详细分析我们能够发觉，其实只要3’端提供G碱基限制性内切酶识别序列，包含粘端经Klenwo补平或T4DNA聚合酶切平，均能够变成EcoRI识别序列。基因工程的重组连接专家讲座第23页DNA连接酶基因工程的重组连接专家讲座第24页DNA连接酶基因工程的重组连接专家讲座第25页其它工具酶Klenow酶：大肠杆菌DNA聚合酶IN端大片段;大肠杆菌DNA聚合酶I活性：5’-3’DNA聚合酶活性3’-5’核酸外切酶活性5’-3’核酸外切酶活性核酸内切酶活性。而Klenow酶含有前二者活性。Klenow酶用途：修复3’凹陷，使之成为平头;切口平移法标识杂交探针;合成cDNA第2条链。基因工程的重组连接专家讲座第26页其它工具酶基因工程的重组连接专家讲座第27页DNA模板加热、变性与6核苷酸随机引物退火Klenow酶,T4-DNAligasedNTP,32P-dCTP杂交探针基因工程的重组连接专家讲座第28页其它工具酶TdT（末端脱氧核苷酸转移酶)：是一个不依赖于模板DNA聚合酶，其适当底物形式为3’游离羟基双链DNA。TdT活性特点：3’突出末端，TdT在Mg2+存在下能够将脱氧核苷酸dNTP随机加在双链DNA3’末端；3’为凹端或为平头时，需要Co2+激活，仍能够将dNTP加在3’末端，且不按照模板；TdT用途：在人工粘性末端构建中极为有用。基因工程的重组连接专家讲座第29页其它工具酶基因工程的重组连接专家讲座第30页其它工具酶碱性磷酸单酯酶：能够催化DNA.RNA5’末端核苷酸去除P基团，使5’成为-OH。碱性磷酸单酯酶用途：单酶切后载体用碱性磷酸单酯酶处理，能够预防载体自我环化；片段或者接头5’末端除去P，则能够预防DNA片段之间连接。基因工程的重组连接专家讲座第31页其它工具酶基因工程的重组连接专家讲座第32页其它工具酶T4多聚核苷酸激酶（T4PNP）