（动物遗传育种与繁殖专业论文）山羊早期胚胎发育的基因表达.pdf

缩略词 英文缩写英文全名中文全名 z g a z y g o t i cg e n ea c t i v a t i o n合子型基因激活 3 一u t r 3 u 1 1 t r a n s l a t e dr e g i o n s 3 非翻译区 5 r a c e 5 r a p i d 锄p l i f y i c a t i o no fc d n a e n d s5 c d n a 末端快速扩增 i g fi n s u l i n - l i k eg r o w 吐lf a c t o r s 胰岛素样生长因子 i g f - p i n s u l i n 一1 i k eg r o w c l lf a c t o r s p b 胰岛素样生长因子 e g f e p i d e 眦a lg r o w c hf a c t o r表皮生长因子 e g f r e p i d e n n a lg r o w c hf a c t o rr e c 印t o r s表皮生长因子受体 e d l a e t l l y l e n ed i 锄i n et e t r a a c e t i ca c i d乙二胺四乙酸 b i s n ，n 一m e t h y l e n eb i s a c r y l 锄i d e亚甲基双丙烯酰胺 i c mi 1 1 1 1 c rc e l lm a s s 内细胞团 a k pa l k a l i n ep h o s p h a t e s 碱性磷酸酶 e s t s e x p r e s s e ds e q u e n c et a g s表达序列标签 l i f1 e u k a e m i ai n h i b i t o 巧f a c t o r 白血病抑制因子 d dd i 妇f e r e m i a ld i s p l a y 差异显示 g h g r o 、砒h o m o n e生长激素 g h r g r o w t hh o m o n er e c e p t o r s生长激素受体 f n肋r o n e c t i o n纤粘连蛋白 d d - p c rd i f f e r e n t i a ld i s p l a yo f m r n ab yp c rm i 矾a 差别显示法 t e m e d n ，n ，n ，n 一t e t r 锄e t h y le t h y l e n e d i 锄 1 i 1 1 e n ，n ，n ，n 四甲基乙二胺 s d s p a g es o d i 啪d o d e c y ls u l f a t e p o l y a c 巧1 a m i d eg e le l e c t r o h o r e s i s s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 x - g a j5 b r o m o 4 - c m o r 0 3 一i n d o l y l p d g a l a c t o s i d ep 一半乳糖苷酶底物 i p t g i s o p r o p y l p d t h i o g a l a c t o s i d ep 半乳糖苷酶活性诱导物 扬州大学硕士学位论文 扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下独立进行研究工作所取得的研 究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含其他个人或集体已经发表 的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：钱；2 娟 签字日期：二l ，d8 年b 月j b 日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅。 本人授权扬州大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学 技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向 社会公众提供信息服务。 学位论文作者签名：厮 诵 导师签名： 签字日期：) 卵8 年b 月j 日 签字日期：夕移貉 、易黾i7 避 钱红娟山羊早期胚胎发育的基因表达 山羊早期胚胎发育的基因表达 研究生：钱红娟 导师：王杏龙教授 扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州，2 2 5 0 0 9 中文摘要 为了解山羊早期胚胎发育的分子机制，以便于人们可以更为有效地调控动物 胚胎的早期发育过程，本研究通过同期发情和超数排卵方法处理后，获取山羊早 期发育的2 细胞、4 细胞、8 细胞、1 6 细胞、桑椹胚和囊胚胚胎。用1 1 1 】5 必a 差异 显示技术，共筛选到3 0 条早期发育胚胎的差异表达片段。经过测序及对比分析， 表明有9 条带与已知功能基因或调控基因相似，1 条带为未知功能基因，其余2 0 条带无相似基因。 1 。在2 细胞期胚胎表达的特异性片段y 6 2 条带和e 6 6 条带，其序列分别与人磷 酸酶基因和人动力蛋白基因具有同源性。磷酸酶可以反映胚胎发育过程中钙的 代谢情况，为着床前胚胎提供某种信号，对细胞的分裂活动具有重要的调控作 用；动力蛋白参与多种生命活动，推动早期胚胎发育，对早期胚胎发育过程中 的基因转录调控和表达调控起到重要作用。 2 在4 细胞期胚胎表达的特异性片段y 7 2 条带，其序列与人表皮生长因子具有 同源性。表皮生长因子是胚胎发育过程中最为重要的调节因子之一，通过胞内 一系列信号分子的介导作用，调控细胞增殖相关蛋白的转录，影响细胞的增殖 和分化。 3 在8 1 6 细胞期胚胎表达的特异性片段e 8 条带和s 8 l 条带，其序列分别与氨 基乙酸脱氢酶基因和连接蛋白基因具有同源性。此阶段为母型调控向合子型调 控过渡时期，胚胎基因组处于一个较为活跃的时期，氨基乙酸脱氢酶维持和促 进细胞内生物氧化的进行，并最终推动a t p 合成以提供胚胎发育能量的需要； 连接蛋白在胚胎发育早期，对胚胎的致密化和囊胚的形成甚为重要，在早期胚 胎附植前的形态发生过程中也起着重要作用。 扬州大学硕士学位论文 4 在桑椹胚和囊胚阶段表达的特异性片段s 9 7 条带和y 9 7 条带，其序列分别与 小鼠白血病抑制因子基因和生长激素基因具有同源性。桑椹胚囊胚期胚胎进入 快速生长分化时期。白血病抑制因子调节早期胚胎的生长分化和启动胚泡植 入，维持胚胎的多功能状态。生长激素促进胚胎卵裂和囊胚发育，影响胚胎的 着床。 5 在4 细胞和8 1 6 细胞胚胎中特异性表达的s 7 8 b 条带，其序列与牛醛氧化酶 ( 脱氢酶) 具有同源性。通过调控a t p 的合成，提供合子基因组激活以及d n a 去甲基化和再甲基化时的能量需要。 6 在早期胚胎发育的各个时期均有表达的l e p t i n 蛋白，参与卵母细胞的发育和成 熟调节及早期胚胎发育的全过程，影响胚胎发育的质量和胚胎着床。 关键词：山羊；胚胎发育；基因表达：m 对忱差异显示 钱红娟山羊早期胚胎发育的基因表达 3 g e n e e x p r e s s i o no fe a r l yd e v e l o p m e n t a le m b 巧o si n 2 0 a t - ， m s c a l l d i d a t e ：h o n 西u a nq i a n a ( h ，i s o r ：p r o x i n g l o n g g ( a 1 1 i m a ls c i e n c ea n dt e c l l i l o l o g ) rc o l l e g e ，y a i l g z h o uu 1 1 i v e r s 时，2 2 5 0 0 9 ) a b s t r a c t i no r d e rt ou n d e r s t a i l dm em 0 1 e c u l a rm e c h a n i s ma b o u tg e n ee x p r e s s i o no fe a r l y d e v e l o p m e n t a le m b r y o smg o a t ，a n dp e o p l ec a l l m o r ee f f e c t i v e l yc o n t r o la n i m a l e m b r y o sd u r i n ge a r l yd e v e l o p m e n t 2c e l l ，4c e i l ，8 1 6c e l l ，m o r u l a ea 1 1 db l a s t o c y s t s t a g eg o a te m b u o sw e r eo b t a i n e du s i n ge s t n l ss y n c l 啪n i z a t i o na n ds u p e r o l a t i o n m r n ad i 髓r e n t i a ld i s p l a yw a su s e di nm i ss t u d ya n d3 0d i 行e r e ms t a g es p e c i f i cb a n d s i nt o t a l 、v e r es c r e e n e d t h es e q u e n c i n ga 1 1 da l i g m e n tr e s u l t si n d i c a t e dt h a t9d i 疏r e n t i a l e x p r e s s i o nb a i l d s 、e r eh o m 0 1 0 9 0 u s 谢t hf u n c t i o ng e n e so rr e g u l a t o r yg e n e s 、) v _ h i c h a k e a d yk n o w n 舶mt l l eg e n e b a n kw h e r e a so 恤r2 1d i 虢r e n t i a le x p r e s s i o nb a i l d sw e r e u i l l ( 1 1 0 、ng e n e s 1y 6 2a i 【de 6 6w e r es p e c i f i cb a l l d se x p r e s s e di n2 - c e l ls t a g ea l ：i dt h e yw e r er e s p e c t i v e l y h o m 0 1 0 9 0 u s 谢mh 眦1 a np h o s p h a t a sg e n ea n ds a p i e n sd y n e i ng e n e p h o s p h a r e n e c t e dt h es i t u a t i o no ft h ec a l c i u mm e t a b o l i s mi nm ep r o c e s so fe m b 巧o n i c d e v e l o p m e n t ，w 1 1 i c hc o u l db ec h a r a c t e r i z e da st l l es i g l l a lo fp r e i m p l a m a t i o na n dh a d i m p o 衄1 te f f e c t o nc e l ld i v i s i o n d ) ，i l e i nt 0 0 kp a ni l l m a n yl i f e a c t i v i t i e sa l l d p r o m o t e dt h ed e v e l o p m e n to fe a r l ye m b r y o s d y n e i nh a da m u c hi m p o 此m tr o l ei n r e g u l a t i n gg e n et r a n s c r i p t i o na n de x p r e s s i o no fe m b 巧o s 2y 7 2w a st h es p e c i f i cb a j l de x p r e s s e di i l4 - c e us t a g ea l l d “w a sh o m 0 1 0 9 0 u sw i t h h u m a ne p i d e n n a lg r o w t hf a c t o rr e c e p t o rg e n e e p i d e m a lg r o w t l lf a c t o rr e c e p t o rg e n e w a so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tr e g u l a t o r s nr e g u l 砷e dt h ep r o t e i nt r a n s c r i p t i o na _ b o u t c e l lp r 0 1 i f e r a t i o n 缸o u 曲as e r i e so fs i g n a l si nc e l l s 4 扬州大学硕士学位论文 3e 8a i l ds 81w e r es p e c i f i cb a n d se x p r e s s e di n8 16 - c e us t a g ea n dt h e yw e r e r e s p e c t i v e l yh o m o l o g o u sw i t l lg l y c i n ed e h y d r o g e n a s eg e n ea 1 1 df i b r o n e c t i o ng e n e t a n s i t i o n 丘o mm a t e m a lt oe m b r y o n i cc o n t r o lo c c u r r e di n8 16 一c e us t a g ea n d z y g o t i cg e n o m i cs t a y e di na s t a t eo fr n o r ea c t i v ei nt h i ss t a g e g i y c i n ed e h y d r o g e 撒坞e m a i n t a i n e da n dp r o m o t e dt h ep r o c e s so fb i o o x i d a t i o n 、v i m i nt h ec e l l s ，w h i c hw a s e s s e n t i a lf o ra t ps y n t h e s i st 0 p r o v i d ee n e r g y f o r e m b 巧o n i cd e v e l o p m e n t f i b r o n e c t i o np l a y e da ni m p o n a mr 0 1 ei nc o m i n gi n t ob e i n gb l a s t u l aa i l dm o 印h o l o g y f o n n a t i o no f p r e i i l l _ p l a i i t a t i o ne m b 巧o s 4s 9 7a n dy 9 7 、e r es p e c i f i cb a i l d se x p r e s s e di nm o m l a ea 1 1 db l a s t o c y s ts t a g e ，w h i c h 、v e r er e s p e c t i v e l yh o m o l o g o u s 谢ml e u k e m i ai n l l i b i t o 巧f a c t o r ( l i f ) g e n ea n d 铲o 、n h h o 肌o n e ( g h ) g e n e m o m l a ea n db l a s t o c y s tc a m ei n t oap e r i o do fr a p i d 铲。讯ha i l d d i 自睹r e m i a t i o n l i fr e g u l a t e dt h e 黟o w t ha n dd i f f e r e n t i a t i o no fe a r l ye m b u o sa i l d l a u n c h e dt h ei 1 p l a n t a t i o no fg e m i n a lv e s i c l e ，a l s ol i fm a i n t a i n e de m b r y o si na s t a t eo fm u l t i 一如n c t i o n g hp r o m o t e d c l e a v a g e o fe m b 巧o sa n d b l a s t o c y s t d e v e l o p m e n t ，w h i c ha 饪e c t e di n l p l a 【l t a t i o n 5s 7 8 b 、张s 吐l es p e c m cb a n de x p r e s s e db o mi n4 一c e ua n d8 16 - c e us t a g e 、h i c hw a s h o m 0 1 0 9 0 u s 、i t l lb o v i n ea l d e h y d ed e h y d r o g e n a s eg e n e i tc o n t r o l l e dt h es y n t h e s i so f a t pw h i c hp r o v i d e de n e 培yf o rz y g o t i cg e n ea c t i v a t i o n 纽dd n ad e m e t h y l a t i o na n d r e d e m e t h y l a t i o n 6s 9 6 7 8 9w 2 l se x p r e s s e di n2 一c e l l ，4 - c e l l ，8 16 一c e l la n dm o r u l a ea n db l a s t o c y s ts t a g e i t h a de 行e c to no o c y t e sm a t u r a t i o na n dm ew h 0 1 ep r o c e s so fe a d yd e v e l o p m e n t a l e n i b 巧o s ，w h i c ha 矗e c t e dt h eq u a l i 够a n di i n p l 删i o no fe m b r y o s k e yw o r d s ：g o a t ；e n l b r y od e v e l o p m e n t ；g e n ee x p r e s s i o n ；m r n ad i 能r e n t i a ld i s p l a y 钱红娟 山羊早期胚胎发育的基因表达 1 文献综述 哺乳动物早期胚胎发育机制 发育是生物的共同属性，它是生物体在其生活史开始后复杂程度提高的有序 变化过程。发育的一个主要特点是每一个物种重复产生一种特定的图式。基因控 制着发育的图式，发育是基因按照特定的时间空间程序表达的结果，是生物体基 因型与内外环境相互作用，并逐步转化为表达型的过程。现在所说的发育已包括 研究胚胎和以后的发育过程。无脊椎动物和脊椎动物的发育遗传已不再是截然分 开的不同领域，因为线虫、果蝇、和人类等的发育途径是基本相同的。控制生物 发育的这些基因在进化上是保守的，在结构和功能上具有很高的同源性，这也将 十分有利于促进发育遗传学的研究【l l 。 1 2 基因的差异表达及其调控机制 在各种类型的生物中，d n a 序列所蕴涵的遗传信息通过转录与翻译转变为具 有生物活性的蛋白质的过程称为基因表达。基因表达的现代概念是1 9 6 1 年提出的， 在当时发现了信使r n a ( m r n a ) ，破解了遗传密码，阐述了蛋白质合成的基因调 节【2 - 3 1 。7 0 年代中期出现了全球性的基因表达研究的热点。9 0 年代基因表达的研究 又进入了一个新的时代差异基因表达研究。在生物体生长、发育和适应环境 的过程中，细胞必须适时的对基因表达作出调整、开放一些基因、关闭些基因， 在质与量上对基因的表达做出精确的调节与控制。 基因的表达是按时间和空间顺序有序地进行的，这种表达方式即为基因的差 异表达( d i 虢r e n t i a le x p r e s s i o n ) 【4 捌。基因的差异表达有两个含义：表达基因的种 类改变和基因表达量的变化【6 1 。生物体各种各样的特性，归根到底是由其基因表达 的差异引起的。一个生命体在经历受精卵、胚胎发育、个体成长和死亡等生命阶 段都会伴随结构和功能的改变；组成一个生物体的所有细胞的基因组组成是相同 的，但不同的组织器官形态各异，发挥着各自独特的功能和作用。所有这些都是 6 扬州大学硕士学位论文 由基因表达的差异造成的【7 】。 由于数据的充足、新技术的进步【引，大规模的d n a 的序列测定，目前已有更 多的d n a 序列存在g e n e b a n k 中。因此，生物医学的研究进入了一个新的转折点， 过去我们所从事的基因研究都是少数几个基因，而现在和将来都是成千上万个基 因的同时研究【9 - l0 1 。差异基因表达技术的出现大大地开阔了生物学家观察基因表达 的视野【l l 】。 基因表达就是基因转录及翻译的过程。在一定调节机制控制下，大多数基因 经历基因激活、转录及翻译等过程，产生具有特异生物学功能的蛋白质分子，但 并非所有基因表达过程都产生蛋白质，t r n a 、r i 矾a 编码基因转录合成r n a 的过 程也属于基因表达。基因表达的时间、空间特异性由特异基因的启动子( 序列) 和增强子与调节蛋白相互作用决定。有些基因较少受环境因素影响，而是在个体 各个生长阶段的大多数或几乎全部组织中持续表达，或变化很小，这类基因表达 视为基本的或组成性基因表达。雨另有一些基因表达极易受环境变化影响。在特 定环境信号刺激下，相应基因被激活，基因表达产物增加，这种基因就是诱导表 达基因。相反，如果基因对环境信号应答时被抑制，基因表达产物水平降低，这 种基因则为阻遏表达。 基因表达调控是在多级水平上进行的，基因的结构活化、转录起始、转录后加 工及转运、m r n a 降解、翻译及翻译后加工及蛋白质降解等均为基因表达调控的 控制点。生物体所表现的各种性状，无论是单基因控制的或是多基因体系的调控， 其本质上都是由于基因的差异和基因表达的改变所致。基因表达的变化是调控细 胞生命活动过程的核心机制，而转录是基因表达的第一水平，在m r n a 水平上研 究性状的表达差异，可为揭示生命现象本质提供更可靠的证据。m r n a 的生物学 功能是传递d n a 的遗传信息，指导蛋白质的生物合成。真核生物m i 斟a 的5 - 末 端有一段含3 0 2 0 0 个核苷酸残基组成的多聚腺苷酸( p o l y a ) ，此结构与删 斟a 由胞核转位胞质及维持m r n a 的结构稳定有关，5 末端有一个7 甲基鸟嘌呤核苷 三磷酸( m 7 g p p p ) 的“帽 式结构，此结构在蛋白质的生物合成过程中可促进核 蛋白体与m r n a 的结合，加速翻译起始速度，并增强m r n a 的稳定性。在卵子发 钱红娟山羊早期胚胎发育的基因表达 7 生和成熟的过程中，核内基因的遗传信息控制着卵质内蛋白质的合成，通过“掩 盖 的m r n a 把核内信息转移到细胞质中，这种“掩盖 的m 鼬蛆又反过来控制 以后的发育时期中核内遗传信息的表达，受精卵内这种核与质的矛盾，相互作用 和相互制约，推动着发育过程的进行。高等生物的基因表达不仅具有组织特异性 和发育阶段特异性，而且也受到环境因素的影响，不同基因随时间、空间而有选 择地表达，这种基因的差别表达决定了生命的所有过程，如生长发育、分化、细 胞周期调控、衰老、死亡等生命过程以及各种独特性状的表现。因此，研究不同 类型细胞中基因表达的差异并克隆那些特异性表达的基因，对于深入研究基因表 达的调控，了解生命过程的本质具有十分重要的意义。 早期胚胎发育过程中，有着许多影响因素的参与，这些因素或促进或抑制早 期胚胎的生长分化。在着床前胚胎中，检测到很多与胚胎生长发育有关的基因的 表达调控，这些基因为信号转导所必需或编码生长因子或生长因子受体蛋白，或 促使发育异常的胚胎发生凋亡，它们均对胚胎早期发育起着十分重要的作用 1 2 1 。 近年来，在早期胚胎中检测到一些基因的表达调控，如原癌基因、性别决定基因、 生长发育、分化及凋亡调节基因等，它们对早期胚胎发育具有重要作用。 1 3 动物早期胚胎的发育及母源基因的调控 成熟的精子和卵子经过受精作用( f e r t i l i z a t i o n ) 融合而形成受精卵，在这一阶 段中有精子的成熟与获能、精卵识别、顶体反应以及精卵质膜融合等重要事件。 受精卵是新个体的起点，之后进入卵裂期，卵裂与普通的细胞分裂不同，卵裂细 胞不生长而是连续分裂，细胞间期很短，几乎无生长期。经过卵裂，合子( 1 细 胞期) 分裂为2 细胞、4 细胞、8 细胞和1 6 细胞，经过数次分裂后，实心的细胞 团类似桑椹，这时的胚胎叫桑椹胚( m o m l a ) 。随着分裂的继续，出现了充满液体 的腔，即进入了囊胚期( b l a s t u l a ) ，此时，胚胎是球形细胞团，细胞之间形成充满 液体的腔隙，这些腔隙联合形成一个大的腔，位于胚胎的一端，此期胚胎又称为 胚泡期( b 1 a s t o c y s t ) ，胚泡内有明显的两群细胞，内细胞团( i l m e r c e l lm a s s ) 和滋 养层细胞( t r o p h o b l a s tc e l l ) ，以后发育时，内细胞团发育成胚胎的主体，而滋养 8 扬州大学硕士学位论文 层细胞发育成胎盘。经“孵化 作用，胚泡的透明带脱落，胚胎从透明带的裂缝 中出来，而滋养层细胞使胚泡和子宫壁相接触并侵入子宫组织，胚胎才能种植到 子宫内壁，种植以前的胚胎就称为植入前胚胎。 在大多数种类的动物中，受精后早期胚胎细胞分裂的速度以及各种卵裂球所 处的位置都是由贮存在卵内的母源性m r n a 和蛋白质控制的。通过有丝分裂分配 到卵裂球中的合子基因组，在早期卵裂中并不起作用。受精介导卵母细胞中母源 m r n a 的募集，受精后，蛋白质合成猛增1 0 0 倍，储存的m r n a 被转译。m e m i l i 等( 1 9 9 9 ) 【1 3 】用3 h 标记尿嘧啶研究发现，牛胚胎1 细胞和2 细胞期分别有2 种和 4 种蛋白质的合成不能完全被m r n a 抑制因子c 【鹅膏菌素( 0 【锄a n i t i n ) 所抑制， 表明这6 种蛋白质至少部分由母源型m i 矾a 翻译而成；同时发现，2 细胞期对 c c 锄趾i t i n 敏感的蛋白质少于1 细胞期，这也许是因为1 细胞期翻译一些蛋白质的 母源型信息在2 细胞胚胎不转录。 1 4 母型调控向合子型调控过渡 哺乳动物的早期胚胎的发育始于雌雄配子的融合，此时的配子在转录上处于 缄默状态。配子一直依靠贮存于卵母细胞中的母源性遗传因子，使生命能够在基 因组激活之前得以维持和继续。随着胚胎进一步发育，母型i t l 斟a 逐步消耗，必 须需要合子型基因的适时表达，完全取代之而进行调控，称为合子型调控( z y g o t i c r e g u l a t i o n ) 。母源调控向合子型调控的过渡( m a t e m a lz y g o t i ct r a n s i t i o n ，m z t ) 发生 在受精后头几天的卵裂期间，此时贮存转录本已经逐渐耗竭，取而代之的是新转 录本的合成，即合子基因组的激活( z ) r g o t eg e n o m ea c t i v a t i o n ，z g a ) 产物【1 4 】。胚 胎基因转录的激活，是胚胎发育从母型调控向胚型调控过渡的启动，是胚胎发育 过程中的关键事件。合子基因表达的8 0 9 0 转录本与母型m i 斟a 相同， 1 0 。2 0 转录本为不同于母型的新m 对叮a ，于受精后的胚胎发育调控过渡中逐步 表达和积累，因此合子基因转录本包含着等同母型转录本的m r n a 和合子基因组 新表达而在卵母细胞中不存在的m i a 。这些物质支持并指导了早期胚胎发育过 程。z g a 的起始时期因物种而异，一般可分为2 个阶段：起始低水平的转录和随 钱红娟 山羊早期胚胎发育的基因表达 9 后爆发式表达【l5 1 。在小鼠，z g a 发生在1 细胞期的s g 2 期，在此时期可检测到 父本来源的外源转入基因的表达【1 6 1 。在牛胚，e g a 出现在8 1 6 细胞期，且分裂 球核仁的超微结构与蛋白质合成的模式发生了变化。最近有报道，用3 h 尿嘧啶核 苷长时间处理2 到4 细胞胚胎，发现在早期发育中也有转录活性，用a 锄a i l i t i n 抑制转录，仍然能够继续发育到8 细胞阶段，表明牛胚胎基因组的活化是逐步的【1 7 】。 在兔胚，用多聚鸟苷酸探针进行原位杂交试验，最早在2 细胞后期能测到m r n a 。 用放射自显影术也发现，兔胚胎基因组在4 细胞期前开始转录，在8 细胞之后开 始强烈转录，并且开始转录r r n a ，用不同的显示方法和定量i u p c r ，发现母本 转录逐渐消失直至1 6 细胞完全消失，合子转录则出现在8 细胞之后【l 引，因此，由 母本转录到合子控制的转换发生在8 。1 6 细胞【1 9 】。 1 5 影响早期胚胎发育的因子 自配子配合形成单细胞胚胎后，个体发育就开始启动，早期胚胎中的细胞就 呈现出不同的形状，并分成多个层面，这些层面最终将发育形成不同的有机组织 和器官。调控因子通过自分泌和旁分泌的形式作用于胚胎和母体，从而对受精卵 的分裂和进一步发育发挥重要的作用，这些具有独特功能的调控因子的相互作用 可改变发育命运。利用r n a 干扰技术，研究线虫亲代表达的基因和被传递到卵细 胞中的基因，这些基因被用于受精后最早期的发育阶段，发现大约有另外的1 5 0 种新基因是胚胎发育所需的2 0 1 。t 觚a k a 等2 1 1 利用消减杂交的方法发现了一种与 c s h 1 和b 4 类似的卵母细胞特异性连接组蛋白h l o o ，h 1 0 0 不但能够在卵母细胞- 胚胎发育转换过程中发挥功能，而且还可能在基因组重编程过程中起到关键性作 用。 e g f 是一种多肽类生长因子，最初由小鼠颌下腺中分离出来，是由5 3 个氨基 酸组成的单链多肽。e g f 通过与胞膜上的受体结合，诱发胞内酪氨酸激酶区自身 磷酸化，通过胞内一系列信号分子的介导作用，调控细胞增殖相关蛋白的转录， 从而影响细胞的增殖与分化。、聃l e y 等人【2 2 】证实，e g f 受体在1 细胞期小鼠胚胎即 已存在。p a r i a 等人【2 3 1 证实在8 细胞期鼠胚即可检测到e g f 受体的存在，而且从桑 l o 扬州大学硕士学位论文 椹胚期至囊胚期，其表达量呈进行性增加的趋势。在小鼠整个植入前胚胎中均无 e g f 的表达【2 4 】。h u e t 等人的实验结果证实，子宫可产生包括e g f 在内的数种 生长因子。这表示，当己具备e g f 受体的桑椹胚进入子宫时，子宫分泌的e g f 可 通过e g f 受体发挥对早胚发育的调节作用。 i g f s 是胎儿生长过程中重要的调节因子【2 6 1 。i g f s 是具有类似胰岛素原代谢活 性和结构特征的低分子肽类激素，其中i g f i 是一种具有同化作用的生长因子，它 能增加葡萄糖和氨基酸的吸收，抑制蛋白质降解，刺激各种细胞的增殖和分化【2 7 1 。 s e n ，o s s 等【2 8 j 通过转基因动物研究显示，去除i g f i 基因的小鼠发生宫内发育迟缓， 间接证实了i g f i 在胎儿生长发育中的作用。b e n s h l o m o 等【2 9 】研究发现，外源性 i g f i 能增加宫内发育迟缓胎儿的蛋白质与脂肪积累，加快生长速率，表明i g f i 通过促进胎儿蛋白质和脂肪代谢而影响胎儿生长发育，这些均证实i g f i 在胎儿的 生长发育过程中有重要作用。 1 6 砌州a 差异显示技术的研究进展 1 9 9 2 年，哈佛大学医学院的l i a n g 和p a r d e e 【5 1 博士以研究与癌症发生有关的基因 为目的，创立了鉴定克隆哺乳动物正常生理状态与异常状态细胞之间差异表达基 因的方法，即r 1 1 】5 n a 差异显示技术( d i f f e r e n t i a ld i s p l a yr e v e r s e 缸狮s c r i p t i o np c r ， d d r t p c r ) ，这是种研究基因的差异表达的新方法。首次报道后，即以其不 可替代的优势被广泛应用于生物医学领域，在应用的过程中不断得到改进。 1 6 1 训i 矾a 差异显示技术的基本原理 d d r - t p c r 技术是在逆转录反应、p c r 反应和聚丙烯酰胺凝胶电泳这三项技术 的基础上发展起来的。它利用了大多数真核生物成熟i r l i 矾a 的3 端有多聚腺嘌呤序 列，即p o l y ( a ) 尾巴( 除极少部分m r n a ，如组蛋白m i 埘a 外) ，因此用3 。端含 有p o l y ( t ) 的引物锚定于来自两组或多组样品的m r n ap o l y ( a ) 尾上，反转录 成c d n a 。用不同组合的锚定引物，可以将m r n a 反转录形成若干个亚群的c d n a 。 以这些c d n a 为模板，利用锚定引物及5 。端随机引物组成的引物对进行扩增，理论 钱红娟山羊早期胚胎发育的基因表达 上可以获得所有m r n a 的特异扩增片段。将扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳可以 有效筛选、分离到差异表达的c d n a 片段，对获得表达差异的基因片段进行回收、 克隆、鉴定及分析。该方法一经建立就被广泛的应用于癌症、血液病以及激素药 物作用的相关基因、细胞周期、胚胎发生的相关基因等多方面的研究。 1 6 2 删 a 差异显示技术的优点 与以往的研究基因差异表达的方法相比较，m r n a 差异显示技术具有以下优 点。简单易行：m i 埘a 差异显示技术所依靠的p c r 和d n a 测序凝胶电泳技术已十 分成熟，因此在具体操作上比较简便；总i 矾a 的需要量极少，一次试验仅需要 o 0 2 0 2 嵋，这种方法使得对材料来源困难的生物体的差异表达的研究得以实现 【3 0 】；灵敏度高：其他研究差异表达的方法适用于高转录水平的m r n a 的差异比较， 而低转录水平的m i 斟a 的差异比较却显得无能为力。差异显示p c r 技术对于筛选低 转录水平的m i 矾a 的结果得到很大改善，使低转录水平m r n a 进行差异显示p c r 的 可能性大大提高【3 l 】；多能性：一次实验可同时比较多种细胞类型，可比较多个不 同的处理种类和组别，且可以很好地进行细胞间的双向( 表达或高或低) 比较和 分析；快速：从i 矾a 的纯化，差异显示p c r 、差异电泳、差异带分离纯化，差异 鉴定、阳性结果的序列分析，整个可以在2 3 周完成，这是其他方法无法比拟的【3 2 】； 重现性好：9 0 9 5 的条带能重现，随时可检测实验的效果，从而可避免盲目性。 这一方法的确立也创立了一种不同品种、不同生理状态下基因表达差异的检测方 法。自该技术创立以来，已有很多相关论文发表，由此可见该方法的应用价值【3 引。 1 6 3 删a 差异显示技术的缺点 经过实践，人们发现m r n a 差异显示技术存在着一些明显的缺陷。主要 表现为：( 1 ) 所得特异性c d n a 片段克隆假阳性的比例高，有时甚至高达8 5 。 主要原因有三个方面，一是总r n a 虽经d n a s ei 处理，但仍然有微量d n a 的 污染；二是序列胶中显示的一条c d n a 带中可能含有放射性自显影所检测不到 的重叠带。业已证明，从序列胶中回收的单一c d n a 带中含有至少3 种不同的 扬州大学硕士学位论文 序列。由于再次扩增尤其当为获得足够克隆所需的d n a 量而连续两次p c r 扩 增时，这些非专一性c d n a 的比例将极大提高。三是有些特异c d n a 片段太短， 因而在n o r t h e mb l o t 检测时往往得不到杂交信号而误认为是假阳性，特别是小 于2 0 0b p 的片段；( 2 ) 扩增的c d n a 片断的长度较短，一般在1 1 0 5 0 0 b p 之间， 并非c d n a 全长序列，还需要应用其它方法获得全长序列，如5 i r a c e 技术。 ( 3 ) 用这一技术得到的特异c d n a 片段往往是3 u t r 序列。因此，这对利用 g e n e b a n k 中的已知序列来比较特异d n a 片段不利。( 4 ) c d n a 的扩增产物的 量不仅取决于m r n a 的丰度，也取决于引物与模板之间的特定匹配情况。这 样，即使是高丰度的m r n a ，由于随机引物与之匹配不合适，其扩增产物的量 将少于用丰度虽低但与引物匹配良好的模板扩出的量，因此，往往导致对基因 表达差异的错误认识。 1 6 4 删刚a 差异显示技术的改进和发展 基于上述差异显示技术种种不足，研究者们对试验方法进行了探索和改 进。总体来看，对该技术改进的工作主要集中在以下几个方面：一是引物设计， 锚定引物形式经过三代的演变。l i a n 矿4 】等设计了第一代引物的3 端为1 2 种锚 定引物t 1 2 m n ( m 代表a 、g 或c ，n 代表四种核苷酸中的任何一种) ，5 端为 2 0 种1 0m e r 引物，共有2 4 0 种组合。两年后又设计了第2 代引物改两个碱基 为一个碱基固定的3 端引物，即t 1 2 a 、t 1 2 g 和t 1 2 c ，且在引物的5 端各引 入了一个，共6 0 种组合。单碱基引物的应用，降低了所需逆转录反应的次数， 并可减少应用双碱基引物进行逆转录时一部分信息的丢失，在引物末端加入， 便于后续克隆。l i a n g 【3 5 】推出的第三代引物又将c d n a 分组的数量减少到只有3 个，他们证明使用3 个单碱基锚定0 1 i g o ( d t ) 1 8 引物可以解决与使用双核苷酸丰 余引物相关的大部分问题。经这样的简化，能减少反转录的反应次数和假阳性 的发生。从k h u s h b e e r 等【3 6 1 、m o u 等3 7 1 和c h a p m a n 等【3 8 】的研究结果来看，在 锚定引物中，有1 个或2 个g ，其扩增效率比c 和a 高。王刚石等【3 9 】通过选 取与逆录引物序列相同的带荧光物质标记的双碱基锚定引物t m r 1 7 ( d t l 2 ) 钱红娟山羊早期胚胎发育的基因表达 a p ，极大减小了每一锚定引物产生的第一条c d n a 链的数量，更可降低d d 产物的复杂性，使差异显示条带在序列胶上易于分辩，从而使传统方法中常见 的“重叠带 现象减少。二是选择最适的反转录退火温度。采用较低的反转录 温度有利于引物和模板的配对，但是不利于模板二级结构的解开，造成合成的 c d n a 第一链偏短。研究者在试验中进行改进，先在4 2 反转录3 0m i n ，再在 4 8 反转录3 0m i n ，采用这种方法有利于解开模板的二级结构，合成长度较长 的c d n a 。三是降低d n t p 浓度。在反应中，如果d n t p 浓度过高，会降低扩 增的特异性。将d n t p 的终浓度降低到2p m o l l 在保证产物产量和特异性的前 提下，能最大限度提高序列胶的分辨率。四是对起始( 模板) m r n a 的质量和 浓度的控制。提取m r n a 时用无r n a 酶的d n a 酶消化，以去除d n a 的污染， 同时尽量提高m r n a 起始浓度，以避免稀有m r n a 的丢失而导致错误结果。 对引物进行特异的选择和改进，包括下游锚定引物和上游随机引物。内容主要 涉及到锚定能力、引物长度和数量、中间和末端g c 含量、引物5 端的酶切 位点的添加等。五是差异基因片段鉴定方法的改进。传统的方法是将再扩增的 c d n a 片段( 差异片段) 作为探针，做n o r t h e m b l o t 检测m r n a 表达差异。该 方法对于少量的差异片段的确证尚可，但如果差异片段较多时，该方法工作量 太大。六是降低假阳性。d d r t _ p c r 技术假阳性率高是其致命弱点，研究者一 直在不断进行着优化和改进。试验中可从以下几个方面入手降低假阳性率：避 免基因组d n a 的污染；严格回收稳定出现的差异条带，再将回收的二次扩增 产物与首次p c r 产物进行比较，以进一步证实扩增的特异性；严格把握试验 材料，所采用试验材料间的遗传背景差异越小，假阳性越低；为了排除假阳性 的干扰，采用反向r n a 斑点杂交来验证非常有效。这些技术的改进和发展极 大的提高了该技术的分辨率和有效性，必然促进差异表达基因的鉴别、分离、 克隆及其分子机理等的研究。 1 6 5m r n a 差异显示技术在动物早期胚胎发育相关基因研究中的应用 m r n a 差异显示技术问世以来，就成为了分子生物学工作者的有力工具，