（农药学专业论文）极端嗜盐菌xmq19菌株发酵生产聚羟基烷酸酯（pha）的提取工艺研究.pdf

华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 摘要 本文对极端嗜盐菌( h a l o b a c t e r i u ms p ) x m q l 9 菌株生产p h a 的下游提取工艺 及试验提取物p h a 的主要理化性质进行了研究，主要包括：发酵液的预处理工艺、 p h a 的溶剂萃取、p h a 的水相直接提取、提取物的热熔性质和热分解性质的测定等 试验。主要试验结果如下： 1 经紫外扫描试验表明本菌种中的p h a 经硫酸消化后产物的最大紫外吸收波长 为2 3 4 n m ，标准曲线表明在该波长下样品的浓度与紫外吸光值大小具有良好的线性 关系。 2 利用絮凝剂提高细胞回收效率：将发酵液稀释1 2 倍体积后，向其中加入0 2 的絮凝剂z n s 0 4 ，然后调整发酵液p h 值至8 0 ，用离心机4 0 0 0 r m i n 离心3 0 r a i n ， 湿细胞收率可达到9 6 2 5 。 3 采用正交试验对氯仿萃取法提取发酵产物中p h a 的工艺条件进行了优化。氯 仿最佳萃取条件为：氯仿用量为2 5 m l g 干细胞，在4 5 0 下萃取9 0 m i n ，然后浓缩萃 取液约至1 1 0 体积，回收氯仿，收集产物。p h a 提取率可达8 9 3 4 、纯度9 8 5 6 、 分子量可达7 8 1 0 5 。 4 建立了简易、经济、环保的水相中直接提取p h a 的分离纯化工艺。即初步纯 化时调节p h 值为3 0 ，在6 0 c 下，向3 7 5 9 c ( 湿细胞水) 的细胞悬浮液液中加入 o 1 ( w v ) 的去垢剂，然后搅拌，再4 0 0 0 r m i n 离心2 0 m i n 收集沉淀；进一步纯化 时，加水使沉淀再悬，体积达到5 0 9 l ( 初湿细胞量水) ，再调节p h 值为5 o ，在4 0 下，加入0 1 5 s d s 和2 0 n a c l 0 ，然后搅拌，最后4 0 0 0 r m i n 离心2 0 m i n 收集 产物。p h a 的提取率可达7 5 6 4 ，纯度9 4 6 6 ，分子量可达7 3 1 0 5 。 5 氯仿萃取和水相提取的试验产物p h a 的d s c 和t g a 试验结果表明：两种工 艺得到的p h a 的熔点均在1 3 5 左右，分解温度均在2 9 0 左右。产物的熔点与其 分解温度相差很大，材料便于加工成型。 关键词：极端嗜盐菌x m q l 9 菌株p h a 溶剂萃取水相提取理化性质 本课题由武汉天惠生物工程有限公司资助 极端嗜盐菌x m q l 9 菌株发酵生产聚羟基烷酸酯( p h a ) 的提取工艺研究 a bs t r a c t t b st e x ts t u d i e dt h ep h ae x t r a c t c r a f tf r o m ( h a l o b a c t e r i u ms p ) x m q19a n dt h e m a i np h y s i c a la n dc h e m i c a lc h a r a c t e r so fp h a i tc o n t a i n s ：p r e t r e a t m e n te x p e r i m e n to f f e r m e n t a t i o n 、e x t r a c t i o ne x p e r i m e n to fp h ab yo r g a n i c i m p r e g n a n t 、d i r e c t l ye x t r a c t i o n e x p e r i m e n to fp h af r o mw a t e rs o l u t i o n 、d s ca n dt g a t e s to fp h ap r o d u c t i o n a s f o l l o w sa r et h em a i ne x p e r i m e n tr e s u l t s ： 1 p h a - p r o d u c t sb i g g e s ta b s o r bw a v e l e n g t hi s2 3 4 n m t h es t a n d a r dc u r v eo fu v a b s o r bs h o w st h a tn i c el i n e a rr e l a t i o n s h i pe x i s tb e t w e e ns a m p l ec o n c e n t r a t i o na n dp h a s u va b s o r bv a l u e 2 f l o c c u l a t i o na n dd i l u t i o nc a ni m p r o v et h ec e l lr e c o v e r yt o9 6 2 5 ：d i l u t et h e f e r m e n t a t i o ns o l u t i o nt o1 2t i m e sv o l u m ea n da d j u s tt h ep ht o8 0 ，t h e nj o i n e do 2 z n s 0 4i n t oi t ，l a s tc e n t r i f u g a t et h ef e r m e n t a t i o nu n d e r4 0 0 0 r m i nf o r3 0 m i n 3 o p t i m i z et h ee x t r a c t i o nc r a f tb yc h l o r o f o r mt h r o u g ho r t h o g o n a le x p e r i m e n t t h e b e s te x t r a c tc o n d i t i o n sb yc h l o r o f o r ma r e4 5 c 、2 5 m ls o l v e n tf o rlgc e l l 、9 0 m i n t h e r e c o v e r yo fp h ac a na c h i e v e8 9 3 4 a tt h ep u r i t yo f9 8 5 6 a n dt h em o l e c u l a rw e i g h t h a s7 8 x 1 0 5 4 e s t a b l i s h e das i m p l e 、e c o n o m i c a la n de n v i r o n m e n t a le x t r a c t i o nc r a f tf r o mw a t e r s o l u t i o no fp h a i tc a nk e e pt h er e c o v e r yo fp h aa b o v e7 5 6 4 a tt h ep u r i t yo f9 4 6 6 a n dt h em o l e c u l a rw e i g h th a s7 3x10 5 t h ep r i m a r ys t e po ft h i sc r a f ti sa d j u s tt h ep ho f t h ec e l ls o l u t i o n ( 3 7 5 9c e l l l ) t o3 0f i r s t l y , t h e nj o i n e d0 1 ( w v ) d e t e r g e n ti n t oi t ，a n d k e e pt h et e m p e r a t u r ea t6 0 c ，l a s tc e n t r i f u g a t et h ec e l ls o l u t i o nu n d e r4 0 0 0 r m i nf o r 2 0 m i na n di n g a t h e rt h ed e p o s i t i o na f t e rs t i r r i n g t h el u t h e rs t e pi st ow a s ht h ed e p o s i t i o n b yw a t e rt of i x e dv o l u m e ( 5 0 0 9c e l l l ) ，t h e na d j u s tt h ep ho ft h es o l u t i o nt o5 0 ，j o i n e d 0 15 s d sa n d2 o n a c l 0i n t oi t ，k e e pt h et e m p e r a t u r ea t4 0 c ，l a s tc e n t r i f u g a t et h e c e l ls o l u t i o nu n d e r4 0 0 0 r m i nf o r2 0 m i na n di n g a t h e rt h ep h aa f t e rs t i r r i n g 5 t h er e s u l to fd s ca n dt g a e x p e r i m e n t ss h o w sn i c ec h a r a c t e ro fm a c h i n i n g t h e m e l t i n gp o i n to fp h ae x t r a c t e dt h r o u g hd i f f e r e n tc r a f t sa r eb o t ha b o u t135 ，a n dt h e d e c o m p o u n d i n gp o i n ta r ea b o u t2 9 0 a l s o k e y w o r d s ：h a l o b a c t e r i u m x m q l 9s t r a i n p h a s o l v e n t - e x t r a c t i o n d i r e c t l y e x t r a c t i o nf r o ms o l u t i o n c h a r a c t e r s i i 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 如需保密，解密时间年 月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研姓始吾询1 飞 懒渊年厂月矿日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印，缩印或扫描等复制手段保存汇编学位 论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，并授权中国科学技术信息研究所和北京万方数据股份有限公司将本人 学位论文收录到( 中国学位论文全文数据库，并进行信息服务( 包括但不限于汇编、 复制、发行，信息网络传播等) ，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密，商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文) 在解密后适用于本授权书 学位论文作者签名：7 弘吲青导师签名：中和乒 签名日期：砂娲冒年! 月2j ，日 签名日期：刀口扩年岁月j 罗日t | j 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 1 前言 塑料的发明堪称为2 0 世纪人类的一大杰作，其影响曾被喻为发生了一次“白色 革命”。由于这种材料具有很多优点，被广泛应用于各行各业之中。然而以石油等为 生产原料，经化工合成的塑料在其大量生产和使用的过程中给人类的资源与环境造 成了严重污染，以至于形成了二十世纪以来最大的公害之一“白色污染”。随着人类 环保意识的日益增强，保护环境呼声日烈，面对日益严重的“白色污染”问题，世界 各国纷纷成立有关组织，研究对策，以寻找治理“白色污染”的切实可行的办法。最 理想的治理办法就是以一种新型的完全可降解的塑料代替现有的塑料。其实生物降 解塑料的商业化开发已经经历了3 0 多年，正进入市场化应用的前夜，特别是近年来 国际市场油价暴涨，再加上石油储量的有限性和人类消费的无限性，使人们原本就己 浓厚的利用可再生资源生产生物降解塑料的兴趣更趋强烈。但是，目前生物降解塑料 的实际应用量在所消费的塑料中所占比例还差强人意，2 0 0 3 年全世界生物降解塑料 的消费量估计约为1 0 0 千吨年。今后，如何利用技术手段，打破生物降解塑料大量应 用的经济性壁垒是发展生物降解塑料的关键，需要全世界产学研各方共同努力。 聚羟基烷酸酯( p o l y h y d r o x y a l k a n o a t e s ，p h a s ) 是一类由生物合成的结构简单 的高分子聚合物，俗称“生物塑料”，其结构通式为： r1 3 书0 小( m ) 也 p h a s 不仅具有石化塑料的特性，可以代替现有塑料材料，而且还具有良好的生物 相容性、降解产物无毒性及表面可修饰性等性质，这便极大地拓展了它的应用范围： 使其在医疗与医学组织工程方面有了广阔的应用前景。它不仅可以制作手术缝合线、 创口覆膜及各种医疗器械等，还可以作为克隆器官的支架材料。 1 1 产生p h a s 的微生物 和哺乳动物细胞中的糖原以及植物细胞内的淀粉一样，微生物细胞也会在其生 长的特定时期在胞内合成具有相应功能的聚羟基烷酸酯( p h a s ) ，作为体内的一种碳 源储备。 自从1 9 2 6 年首次在巨大芽孢杆菌中发现聚羟基丁酸( p o l y h y d r o x y b u t i r a t ep h b ) 以来，到目前为止，发现细菌有超过9 0 多个属的3 0 0 多种可以积累p h a 。包括革兰氏 阳性菌、革兰氏阴性菌、好气茵、厌气菌、化能菌、固氮菌和光合细菌等。其中主 极端嗜盐菌x m q l 9 菌株发酵生产聚羟基烷酸酯( p h a ) 的提取工艺研究 要的属有芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) 、产碱杆菌属( a l c a l i g e n e s ) 、假单胞菌属 ( p s e u d o m o n a s ) 、甲基营养菌属( m e t h y l o t r e p h s ) 、固氮菌属( a z o t o b a c t e r ) 、红 螺菌属( r h o d o s p i r i c l u m ) 和肠道杆菌的某些细菌属。目前用于研究和生产的菌种主 要有真养产碱杆菌e u t r o p h u s ) 、食油假单胞菌( p s e u d o m o n ao l e o v o r a n ) 、肥大产碱 杆菌似。l a t u s ) 、自养黄杆菌( x a n t h o b a c t e ra u t o t r o p h i c u s ) 、巨大芽孢杆菌 ( b m e g a t e r i u m ) 、棕色固氮菌( a z o t o b a c t e rv i n e l a n d i i ) 、拜氏固氮菌似b e o e r i n c k i i ) 、极 端嗜盐菌( h a l o f e r a x m ed i t e r r a n e i ) 、球形红杆菌( r h o d o b a c t e rs p h a e r o i d e s ) 以及豚鼠气 单胞菌凹e r o m a n a sc a v i a e ) 、红色红球菌( g h o d o c o c c u sr u b e r ) 等等，其中真养产碱杆菌 似e u t r o p h u s ) 是研究最多的p h b 生产菌种。随着基因工程技术在p h a 研究开发中的应 用，转基因大肠杆菌( e c o l i ) 将成为p h a 生产的重要工程菌种。如：r e u t r o p h a 等( 2 0 0 0 ) 将p h b c a b 基因转入大肠杆菌或其他可迅速有效利用廉价碳源的菌种中生产p h a s ， 并使其产量得到很大提高。r a m a c h a n d e r 等( 2 0 0 2 ) 克隆了金霉素链霉菌岱a u r e o f a c i e n s n r r l2 2 0 9 ) 中的一个s a u 3 aid n a 片段，并将这一片段在e c o l i 中表达，研究该重组 菌株生产p h a s 的情况。研究发现：该重组菌株聚积的p h b ，当以l 丙三醇作唯一 碳源时，其产率可高达6 0 - 6 6 ，是该菌野生菌种p h b 产量的2 5 倍2 8 倍。c h e n 等( 2 0 0 2 ) 将类产碱假单胞菌( p s e u d o m o n a d sp s e u d o a l c a l i g e n e sy s l ) 的两种p h a s 合 成酶基因p 厅口c l p p 和p 砌c 2 p p 克隆，并在已除去脂肪酸降解基区 f a d b 的e c o l i 中表达。 此外，为了进一步降低成本，目前一些科学家正在企图将p h a s 的合成基因从原核生 物转移到高等植物上去。当前，p h a s 的转基因研究已在拟南芥、大豆、马铃薯、大 白菜、玉米上取得一定进展，并在相关作物的叶片、种子中得到表达。倘若在作物 中的积累量能达到3 0 以上，就能应用栽培法大量、廉价地生产p h a s 。 1 2p h a 的分类、理化性质及生理作用 1 2 1p h a ，的分类 p h a ( p o l y h y d r o x y a l k a n o a t e ) 是由10 0 - 3 0 0 0 0 个相同或不同的羟基烷酸单体聚合 而成的一种聚合物，可视为脂肪族羟基酸的聚合物， r0 书h _ ( c 珏) 如 其中m = l ，2 或3 ，通常m = l ，即羟基处于b 位；n 指单体的数目；r 代表侧 链，大多数情况下为不同链长的烷基，范围从甲基至壬基，也有是支链的、不饱和 的或带取代基的烷基。根据单体中的碳原子数，可将p h a 分为两类：短链 2 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 ( s h o r t c y m i n - l e n g t hp h a , s c l ) p h a ，单体中含有3 5 个碳原子；中链 ( m e d i u m - c h a i n 1 e n g t hp h 八m c l ) p h a ，单体中含有6 1 4 个碳原子。p h a 家族中的代 表物p h _ b ，p h b v 即为短链长度p h a s 。另外，根据p h a 单体成分是否唯一，也可 将p h a 分为均聚物和共聚物。在所有已发现的p h a 中，除p h b ，p h v 为均聚物外， 其余皆为共聚物。依共聚物的单体组成可将p h a 分为三类：短链羟基脂肪酸共聚 物，以p h b v 为代表；中链羟基脂肪酸共聚物、以3 h o 为主的各种中链羟基脂 肪酸共聚物为代表；短链与中链羟基脂肪酸共聚物，以羟基丁酸与中链羟基脂肪 酸的单体组成的共聚物p ( h b c o h a m c l ) 为代表。 1 2 2p h a 的理化性质 纯净的p h a 通常为白色，它们的分子量随产生菌、培养条件以及提取方法不同 而异，但一般在5 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0d a 之间。倘若因培养条件与提取方法致使p h a 的 分子量低于2 0 0 0 0 ，其热塑性能便受到很大影响。p h a 作为一类聚合物，它们的物 理学性质既有通性，也因单体的多样性和碳链的长短而有所差异。见表1 。 表1 多聚羟基烷酸与聚丙烯的性能比较 t a b l e1c o m p a r i s o no fp o l y h y d r o x y a l k a n o a t ea n dp o l y p r o p y l e n e 由表可以看出，p h a 的熔点和玻璃化温度与通用塑料是较为接近的，但随着脂 肪酸链的增长，其熔点与玻璃化温度均随之降低。p h b 的结晶度较高，表现出较大 的硬度与脆性；而p ( 3 h b 3 h v ) n 于掺入3 h v ，结晶度与聚丙烯相近，柔韧性也较 好。p h a 的机械力学性质，包括杨氏模数、抗拉强度、缺口冲击强度都与聚丙烯接 近。此外p h a 具有与通用石化塑料同样的光学活性与压电性。这些性能都表明p h a 具有塑料的通性。由于p h b 较脆，而且其熔化温度( 1 8 0 左右) 与分解温度( 2 0 5 0 左右) 接近，在加工成型只能在一个狭窄的温度区间内进行。由于p t - i b 以上的弱 点，人们目前将研究重点由p h b 转向其他p h a 成员，例如聚羟基丁酸一羟基戊酸， 聚羟基丁酸一羟基己酸，聚羟基丁酸一羟基辛酸等异聚体。因其由不同单体聚合而 成，其性质因单体的不同变化而变化，通常情况下，碳链的长度越长，其熔点越低， 3 极端嗜盐菌x m q l 9 菌株发酵生产聚羟基烷酸酯( p h a ) 的提取工艺研究 柔韧性越好，所以不同单体组成的共聚体，不仅其柔韧性有所提高，而且极大地提 高了制品加工的可操作性。 此外，p h a 的其它物理性质也得到研究。如p h b 的浮力密度在1 2 1 3g c m 3 ， 特性粘度( q ) 为o 4 1 。0 5 d g 。p h b 易溶于氯仿、三氯乙酸、二氯乙醇、三氯乙醇、 二甲基甲酞胺等，部分溶于甲苯、辛醇、吡啶等，不溶于甲醇、水、乙醇、丙酮， 对稀酸、稀碱稳定。这些性质的研究为p h a 的提取与加工奠定了基础。 1 2 3p h a 的生理作用 1 2 3 1 内源储藏物 生理学研究表明，p h a 是细胞内一种内源储藏物质，当环境中缺乏营养时；p h a 作为营养和能量的来源，像淀粉和糖原一样。已有大量的实验证明：( 1 ) p h a 是在碳 源和能源过量或氮源、磷源缺乏时形成的。好氧菌在限制氧( 静止培养) 和c n 高时 形成p h a ，在碳源和能源缺乏时形成p h a 的量较氮源缺乏时少得多。( 2 ) 在外加 氮源、能源缺乏时，p h a 可以分解，好氧条件下p h a 分解为c 0 2 和水及少量乙酰 乙酸，厌氧条件下分解产物为乙酰乙酸和少量b 羟基丁酸。( 3 ) p h a 分解产物可 以作为碳源和能源被细胞利用，以防止细胞自溶和死亡。积累p h a 的细菌存活率高 于不积累的细菌 1 2 3 2 维持固氮菌的氧化还原平衡 对于固氮菌，积累的p h a 可作为氧化底物而保护固氮酶。对于豌豆根瘤菌p h b 对氮的固定起重要作用，当固氮菌处于类菌体阶段时，还原力可用于共生固氮，但 也能合成p ( 3 h b ) ，细胞内的固氮系统与p ( 3 h b ) 合成系统相互竞争；而当细菌处于游 离态时，固氮酶不表达，p ( 3 h b ) 的积累可以贮存过剩的n a d ( p ) h ，从而使细菌在不 同的生理阶段都能维持氧化还原平衡状态。通过对固氮菌累积p h a 的研究，可以了 解典型的细胞代谢与多聚体形成之间的相互关系。 1 2 3 3 大肠杆菌中的钙离子通道 最近研究发现p ( 3 h b ) 与多磷酸盐结合，形成一种复合物在大肠杆菌中负责钙离 子的运输。复合的p ( 3 h b ) ( c o m p l e x e dp h b ，简称c p h b ) 是一种分子量低于1 5 ，0 0 0 d a 的低分子量p ( 3 h b ) ，这种物质以低浓度附着于细胞蛋白上，或在细胞膜上与钙离子 和多磷酸盐结合成钙离子通道的形式。在p ( 3 h b ) 多磷酸c 2 + 复合物中各种分子的 摩尔比为1 ：1 ：o 5 ，把分离出的c p h b 引入脂质体或脂双层后，能形成钙离子通道。 这是第一种已知的非蛋白钙离子通道，到目前为止还没有发现与c p h b 生物合成相 关的基因和基因产物，在大肠杆菌的基因序列中也没有发现任何有意义的与编码 p h a 聚合酶基因有同缘性的序列。 4 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 进一步研究证明具有相同特性的钙离子通道可以通过多磷酸钙与寡聚3 羟基丁 酸结合得以重建，而从一种被广泛研究的钙离子通道：人红血球c a 2 + - a t p a s e 的纯化 样品中也发现了p ( 3 h b ) 和多磷酸盐的成分，有一种假设认为这种较简单的p ( 3 h b ) 多磷酸盐复合物是蛋白质钙通道的较原始形式。 1 2 3 4 真核生物中的低分子量p ( 3 h b ) p ( 3 h b ) 不仅是细菌合成的一种不溶性分子，在很多植物和动物组织中也发现有 p ( 3 h b ) 存在，在人血浆中，发现与极低密度脂蛋白和低密度脂蛋白相结合的p ( 3 h b ) 但在高密度脂蛋白中没有发现p ( 3 h b ) ，另外，在血清蛋白中也发现了占相当比例的 p ( 3 h b ) 。脂质分子、特别是白蛋白分子被认为是p ( 3 h b ) 在血液中的运输者，p ( 3 h b ) 在高等真核生物中具有何种生理功能还需进一步的研究。 1 2 3 5p h a 其他生理作用 p h a 不仅作为能源，而且作为碳源来源，后者是同化氨形成氨基酸所必须的。 p n m r 实验还证明p h b 可作为磷的储藏物。p h a 的积累也可以增强细菌对紫外线、 干燥、渗透胁迫等恶劣因子的抵抗力，r e u s c h 和s a d o f f ( 2 0 0 1 ) 还发现p h a 的存在 与细菌的转化作用有关，膜中p h a 的量与转化率成线性关系。 1 3p h a 的分离提取方法 p h a s 提取方法作为p h a s 生产的下游工艺，在整个生产过程中占有十分重要 的地位，直接影响生产成本和产品质量。这方面国内外广泛开展研究，具有十分明 显的生产意义。p h a s 的提取也从最初的氯仿等有机溶剂抽提法发展到用次氯酸钠、 s d s 等无机溶剂以及酶解，工程菌诱导裂解等方法。p h a s 的提取方法可分为以下 四类： 1 3 1 有机溶剂法 溶剂萃取法是利用p h a 可以溶解在某些有机溶剂中而将它从细胞中萃取分离 的方法。用于萃取p h a 的溶剂主要有氯代烃( 如氯仿、1 ，2 一二氯乙烷、二氯甲烷等) 其基本原理是这些有机溶剂一方面改变细胞壁和膜的通透性，另一方面能使p h a s 溶解到溶剂中，而非p h a s 的细胞物质( n p c m ) 不能溶解，从而将p h a s 与其他物 质分离开来。溶剂萃取法操作简单，步骤少，并且有机溶剂对p h a s 分子不产生降 解作用，所获得的p h a s 纯度高，分子量大，目前仍被大量采用。但由于p h a s 仅 溶于为数不多的一些有机溶剂中，且溶解度较低，当p h a s 在溶液中的含量达到5 时，溶液就变得粘稠，从而使得p h a s 萃取液与非p h a s 杂质的分离变得很困难。 5 极端嗜盐菌x m q l 9 菌株发酵生产聚羟基烷酸酯( p h a ) 的提取工艺研究 为了使非p h a s 杂质与p h a s 萃取液易于分离，就必须加大溶剂用量，降低萃取液 、中p h a s 的浓度。这样，大规模的溶剂用量不但会带来溶剂回收问题，而且也会带 来大量的溶剂损失问题。大量的溶剂损失将导致p h a s 的高成本，另外也会污染环 地 嗄。 如v a n l a u t e m ( 1 9 8 2 ) ，t r a u s s n i g ( 1 9 9 0 ) ，s t a g e m a n ( 1 9 8 5 ) 等都分别研究了一些含氯试 剂对a l c a l i g e n e se u t r o p h u s 的提取工艺，见表2 。 表2 几种不同含氯试剂对产碱短杆菌中p h a 萃取效果比较 t a b l e2e f f e c tc o m p a r i s o no fd i f f e r e n tc h l o r i c s o l v e n to np h a e x t r a c t i o ni na l c a l i g e n e se u t r o p h u s 此外，n o d a ( 1 9 9 8 ) 还应用临界溶剂萃取法对a e r o m o n a sc a v i e ，a l c a l i g e n e s e u t r o p h u s ，p s e u d o m o n a sc e p a c i a 等干细胞中的p h a s 进行了提取研究，结果见表3 。 表3 临界溶剂对几种不同菌种中p h a 萃取效果比较 t a b l e3e f f e c tc o m p a r i s o no fc r i t i c a l - s o l v e n to np h ae x t r a c t i o n 6 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 1 3 2 酶法 考虑到有机溶剂的大量使用给操作带来不便，给环境带来污染等问题，h o l m e s 等( 1 9 9 0 ) ，提出了酶法提取p h a 的工艺。其提取原理与有机溶剂法不同，与次氯酸 钠法类似，即让大量的n p c m 溶解而p h a 不溶解，从而达到分离、提纯的目的。 由于n p c m 通常包括核酸、类脂物、磷脂、肽聚糖以及蛋白质等物质，因此实际上 是通过多种酶的多步或协同作用来达到消化n p c m 的目的。单纯使用酶来消化细胞 中的杂质成分，所得p h a 纯度不高，往往要结合其他的方法，例如在用酶法之前先 用表面活性剂处理，或用酶法破胞后再用表面活性剂处理，或者在用酶法提取以后 再用有机溶剂纯化，才能得到较高纯度的p h a 。酶法通常包括细胞的热处理、酶处 理和用阴离子表面活性剂等步骤，操作十分复杂。尽管它实现了在水相体系中提取 p h a ，但由于细胞的杂质成分比较复杂，特别是酶作用的条件比较苛刻，而且所获 得的产品纯度越高，所需要的处理步骤就越多，因而过程的操作也就越复杂，所以 酶法的应用在提取成本、过程放大等方面仍然受到很大限制。 如h o l m e s 等( 19 9 0 ) 对a l c a l i g e n e se u t r o p h u s 进行研究后总结出的p h a 酶法提取 工艺为：菌悬液用1 5 0 蒸汽处理2 0 s ，冷却至7 0 ，p h 7 5 下用0 5 的a l c a l a s e 酶液o 。6 l 和o 5 的核酸酶液0 5l 消化2 h ，离心，升温至7 5 ，p h8 5 下用l 的蛋白酶l 3 3 0 酶液消化2 h ，离心，加入3 的s d s1 0 0 下回流2 h , 喷雾干燥，甲 醇回流洗涤，过滤，干燥。产物纯度9 3 。l i d d e u 等( 1 9 9 9 ) 也对a l c a l i g e n e se u t r o p h u s 进行研究所得到的酶法工艺为：p h6 5 、1 5 0 下，细胞先受到8 0 s 的热处理，冷却 至7 0 ，p h 8 0 下蛋白酶消化2 h ，离心，8 0 、p h 7 0 下加水悬浮，加入过氧化氢 至1 0 9 l 一，消化2 h ，密闭1 4 0 油浴1 0 m i n ，使细胞内p h a s 微颗粒交联聚合成为 大颗粒的固态物质，从液相中分离固态产物。 1 3 3 水相分离法 通过将含有p h a 的微生物细胞的水性悬浮液在低温下进行物理破碎和酸碱的 添加，有效地破碎菌体细胞，回收p h a 后，用酶和或表面活性剂进行处理。另外 可以将p h a 悬浮于亲水性溶剂和或水中，通过在该悬浮液的沸点以下的温度搅 拌，使之凝聚，加大p h a 的粒度，从而离心分离。主要具体提取方法有如下几种： 1 3 3 1 次氯酸盐法 在b e r g e r 等( 1 9 8 9 ) 以前，人们普通认为采用次氯酸钠消化非p h a 物质会导致 p h a 的严重降解，以致不适合用作热塑性物质。b e r g e r 等试验表明，如果想获得高 纯度和高分子量的p h a ，菌体与次氯酸钠浓度比一定要合适，而且当理想的纯度达 7 极端嗜盐菌x m q l 9 菌株发酵生产聚羟基烷酸酯( p h a ) 的提取工艺研究 到后要将p h a 尽快从次氯酸钠溶液中分离出来，否则p h a 在达到最高纯度后将继 续被降解。他们通过选择最适次氯酸钠消化条件获得p h a 纯度9 5 ，分子量达6 0 万( 这个分子量足够用于热塑料) 。 李礼尧等( 1 9 9 7 ) 研究了p h 、次氯酸钠剂量和作用时间等因素对次氯酸钠提取 p h a 的影响，商品次氯酸钠初始p i l l 3 4 ，含量5 4 ，以h c l 调节p h 。试验结果显 示最适条件为次氯酸钠溶液p h 9 8 菌体干重浓度1 1 ( w v ) ，作用时间1 h 。 1 3 3 2 氯仿一次氯酸盐法 氯仿法对p h a 降解少，所得p h a 分子量大；次氯酸钠法p h a 纯度高，但分子 量小。将氯仿和次氯酸钠回收p h a 法的两者优势结合起来，h a h n 等( 1 9 9 4 ) 利用次 氯酸钠溶液和氯仿混合弥散( d i s p e r s i o n ) 回收p h a ，次氯酸钠在液相中从细胞里分离 出p h a ，释放出的p h a 立即转移到氯仿中，从而避免了p h a 分子被次氯酸钠进一 步破坏。该法由于氯仿的屏蔽作用能显著降低次氯酸钠的降解。最适作用条件为3 0 次氯酸纳浓度，反应时间9 0 r a i n , 氯仿与次氯酸钠溶液比1 ：1 ( v v ) ，p h a 分子量1 0 0 万， 纯度9 7 以上，最大回收率为9 1 。弥散液3 0 8 0 0 0 r m i n 离心1 0 m i n ，分成三相。 上相为次氯酸钠溶液，中相为非p h b 细胞物质和未破碎细胞，下相为含p h a 氯仿。 另外，次氯酸钠的消解还降低了氯仿相的粘度。弥散法对真氧产碱杆菌和重组大肠 杆菌所得p h a 分子量没有区别，对重组大肠杆菌中的p h a 晶体形态没有保护作用， 原因是p h a 溶解于氯仿中。 1 3 3 3 次氯酸盐一表面活性剂法 李礼尧等( 1 9 9 7 ) 在研究了各因素对次氯酸钠提取p h a 影响的基础上，采用s d s 辅助次氯酸钠提取p h a 方法。即在p h1 0 ，菌体干重浓度1 ( w v ) 时s d s 先进行 破胞壁处理，然后再用次氯酸钠消化1 0 m i n ，进一步纯化产品，p h a 终纯度9 5 ， 平均分子量m 为5 2x 1 0 5 d a 。与单纯次氯酸钠法比较，解决了p h a 纯度和分子量 之间的矛盾。阴离子表面活性剂s d s 破胞原理是表面活性剂分子能插人到细胞膜的 双层脂质体中，表面活性剂浓度越大，插入到细胞膜中的分子越多，膜体积也被越 撑越大，达到饱和后，再加人活性剂，就会导致细胞膜破裂，胞内物释放，活性剂 和磷脂形成微团( m i c e l l e s ) ，p h a 颗粒则被包裹在肽聚糖中。此外，s d s 能使蛋白质 变性也有助于细胞破裂( 另一表面活性剂t r i t o n x 1 0 0 则能溶解蛋白) 。r a m a y 等( 1 9 9 0 ) 研究表明用表面活性剂预处理能去除8 5 的总蛋白，随后以次氯酸钠洗涤1m i n 又 能去除1 0 0 , 6 的蛋白质和几乎所有的肽聚糖( 以d a p a 表示) ( d a p a ：d i a s m i n o p i m e l i e a c i d 即二氨基庚二酸) 。p h a 纯度9 7 ，分子量7 3 7 9 万。 董兆麟等( 1 9 9 9 ) 将固氮菌g 3 菌株发酵培养到4 2 4 8 h ，p h a 占细胞干重7 5 以上时，分离发酵液，收集细胞进行低温冷冻处理，使细菌崩裂，将p h a 颗粒从细 胞中释放出来，再用1 0 9 l 的s d s 处理1 5 m i n ，进行有效的降解细胞残留物中的脂 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 类和蛋白质，再用3 0 浓度的次氯酸钠作用3 m i n ，进一步降解细胞壁肽聚糖残片和 非p h a 细胞释放物，最后经多次洗涤，可得到纯度为9 8 以上的加工性能良好的 聚羟基烷酸。 1 3 3 4 碱法 n a o h 法提取p h a 简便易行价廉，但纯度较低而且更适用于p h a 结晶度较高 的重组大肠杆菌。清华大学的尹进等( 1 9 9 8 ) 采用0 1m o l 氨水，在4 0 一5 0 下 作用3 0 m i n ，可去除重组大肠杆菌h m s l 7 4 中占细胞总量约1 0 的非p h a 杂质， p h a 含量由7 3 7 9 提高到8 仁9 1 。采用l m o l n a o h ，p i l l 2 ( 碱性p h 和单价阳离 子的双重影响) 作用4 0 r a i n ，同样可去除菌体中7 0 左右的蛋白质，p h a 含量由初始 的6 7 提高到8 8 以上。 1 3 4 机械破碎法 大规模微生物细胞破碎通常采用高压均质或高速珠研磨，但其需要提供高能量 和足够的冷却能力以防止产物过热和细胞颗粒微化( m i c r o n i s a t i o n ) ，某些化学方法能 改变细菌和酵母的通透性使部分可溶物质释放出来。由于细胞壁是机械破碎的主要 障碍，因此在高压均质前使用化学试剂预处理能降低细胞壁强度从而减少操作压力 或通道数。 h o l m e s ( 1 9 8 4 ) 对a l c a l i g e n e s u se u t r o p h u s 应用该法做了研究：干细胞混合物( 加 p h a s ) 3 5g 充入熔流压膜器，1 9 0 。c 平衡5 m i n ，然后活塞( 0 1 6 k g ) 加压1 0 k g ，2 9p h a 混合物从模具中挤出。 h a m s o n 等( 1 9 9 1 ) 研究表明p h 和湿度是影响细胞破碎的主要因素，分子量 的降解与温度和时间有关，与p h 值无关，因此短时间碱性p h 休克可显著弱化细胞 壁强度而不会损伤多聚物，提高预处理的碱性可增加高压均质前后蛋白质和d n a 的释放。碱性p h1 0 5 休克预处理g 菌a l c a l i q e n e sc u t r o p h u s 然后高压均质，能使 可溶蛋白释放提高3 7 5 。阴离子表面活性剂处理 1 ( w v ) s d s ，7 0 ，2 0 m i n i 后 再经高压均质只需要3 4 5 m p a 的操作压单通道即能释放出全部1 5 4 8 k g 的d n a ， 显著降低了均质的操作压力和通道数。单价阳离子n a + 和k + 能增强细菌的热损失， 发酵液加入n a c l 6 0 保温6 0 m i n 导致2 0 的可溶蛋白释放，随后单通道6 4 8 m p a 高压均质可使9 4 的可溶蛋白和6 6 的d n a 释放，不加n a c i 的对照只能释放6 7 的蛋白和2 8 的d n a 。加人e d t a 和溶菌酶裂解等法预处理使得高压均质能在降 低的能量输入下获得最大的细胞破碎。化学预处理快速易控均质破碎效果更理想。 9 极端嗜盐菌x m q l 9 菌株发酵生产聚羟基烷酸酯( p h a ) 的提取工艺研究 1 3 5 基因工程方法 应用基因工程的原理和方法在细菌体内克隆外源自溶基因，使菌体自溶，释放 p h a s 颗粒。l u b i t z ( 19 9 2 ) 在a l c a l i g e n e se u t r o p h u s 和ec o l i 体内克隆抗菌素p h i x17 4 溶胞基因e ，进行研究。用e c o i l 发酵生产p h a s 工艺过程为：采用正常手段( 2 8 ) 发酵，当1 0 m l 发酵液o d 值达o 2 珈9 时加入m g s 0 4 使终浓度为0 2 m o l l ，2 8 维持3 0 m i n ，升温至4 2 ，维持3 0 m i n 、4 、7 0 0 0 r p m 离心收获细胞，用1 0 m l 蒸馏水悬浮，细胞在1 0 m i n 内自溶，蔗糖密度梯度离心收集产物，收率6 旺8 0 。 1 4p h a s 的检测 p h a 的检测可分为直接测定和间接测定，直接测定普遍采用脂类的苏丹黑b 染 色法和尼罗兰a 进行定性检测，其中尼罗兰a 对p h b 进行染色时，具有荧光，在 3 2 6 n m 处有最大激发波长，在4 6 0 n m 处有最大荧光波长，所以用荧光光度计还可直 接测定细菌中p h b 的含量。间接测定时，是把p h a 经浓硫酸降解成巴豆酸，巴豆 酸在2 3 5 n m 处有最大的紫外吸收峰，而其它含炭化合物在同样条件下的吸收峰与 p h a 有很大差别，测定巴豆酸的紫外吸收，再转换成p h a 的量。此外，还可用h p l c 、 g c 、n m r 、g c m s 、i r 及m s 测定和毛细管等速电泳法。 g c 和h p l c 等方法能适用于各种p h a 且无需提取，可直接对发酵细胞进行在 线检测，省时、方便、灵敏，现已被广泛应用。检测原理基于细胞内的p h a