（劳动卫生与环境卫生学专业论文）层理鞭枝藻藻胆蛋白的分子设计和体外重组.pdf

华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 点 的 蛋白 ， a p e c 脱 辅 基蛋白 ( 比 ) *u + 色 素 结 合 位 点的 蛋白 ， p p e c 脱 辅基 蛋班 外重组;( 2 ) 具有双 ) 和 队火 脱 辅 基 蛋 白 ( c p c b ) 4 色 素的 体 外 重 组。 笼 - c f 脱辅基蛋 白 ( p ) 和阳泊 r ( 1 ) 具 有 单 色 素 结 合 位 点 的 蛋白( p e c a 和c p c a ) 的 体 外 重 组 c c - p e c 和 a - c p c 为 单 色素 结 合蛋白 ， 相 应的 脱 辅 基 蛋白p e c a 和c p c a具 有单 色 素 结 合 位点 ( c y s - 8 4 ) o a - p e c 具 有与 植 物光 敏 色 素 ( p h y to c h r o m e ) 相 似的 商效 可 逆光 致 变 色性质。 与植物光敏色素相比， a - p e c分子量小， 结构简单， 在研究可逆光致变色的动 态过程和设计光控分子器件等方面具有优势。 为研究a - p e c的结构与功能的关系， 本实 验室已 构 建了p e c a w h 的 缺 失体. 通过它 们与p c b 的 体 外重 组实 验， 发 现 对 于 具有 单 结 构域的 a - p e c , c端是维持其结构和功能 所必需的; n端缺失体 p e c a - n 1 9和 p e c a wh- n 3 1 在p e c e / p e c f 作用 下的 催化重 组产物的 光 化学性 质与未 缺失的 a - p e c 相同。 本文中通过进一步缩短p e c a的n端， 构建n端缺失体p e c a - n 4 5 和p e c a - n 6 5 ， 通过它 们与p c b的体外重组， 研究n端对a - p e c结构和功能的影响. 实验结果表明， n端缺 失了4 5 a a 的p e c a - n 4 5 在p e c e / p e c f 催化下与p c b偶联生成的p v b - a - p e c - n 4 5 ， 其可 逆光化学活 性略小于a - p e c ; n端缺失了“a s 的p e c a - n 6 5 不能与色素发生直接或催化 偶联反应， 生成具有可逆光化学活性的色素蛋白。 根据a - p e c的晶体结构以 及重组产物 的光化学活性，a - p e c - n 4 5 可能是具有可逆光致变色性质的最小藻胆蛋白。 对层理鞭枝藻藻红蓝蛋白 裂合异构酶 p e e e / p e c f体外催化反应专一性的初步研究 表明， 在几种色素底物中，p e c e / p e c f 对p c b和p e b的亲和性最强，即p c b和p e b是 酶的专一性底物.但是 p e c e / p e c f对底物脱辅基蛋白的专一性还未见报道。本文中以 c p c a , p e c a , p e c a wh及p e c a w iz s 这四 种 脱 辅 基 藻 胆 蛋白 为 底 物， p e c e / p e c f 对 底 物 蛋 白 的专一性。 结果表明， p e c e / p e c f 可催化来自 层理鞭枝藻不同亚种的p e c a ，以 及通过 分 子 设 计 得 到 的p e c a w u 8 f 与p c b 的 体 外 重 组， 生 成 具 有 可 逆 光 致 变 色 性 质 的 色 素 蛋 白 : 虽然c p c a与p e c a高 度同 源， c p c a与p c b的体外重组。 但由于二者在结构上的细微差异，p e c e / p e c f不能催化 研 究 表明 ， 在体 外， c p c e / c p c f 催化p c b 连 接到c p c a的 合 适 位点， 即 形成正确的连接产物，即具有天然活性的a - c p c :同时亦高效地催化此 c y s - 8 4 上， 在逆反应中， 从a - c p c上得到的色素， p - c p c 中 结 合的p c b 也可 转移到c d c 反应的逆反应， 被转 运到 相 似的c p c a 或 异 源的c p c a 上. 此 外， 士 黔竺 二 竖 厂_憋奥以 从 层 理 鞭 “ 中 提 取 的 。 蓝 蛋 白 (a p )单 聚 体 和 藻 蓝 蛋 白 。 亚 贯 亨 r_ lw m 巳 代 里 臀反 严 中 p c b 的 供 体 ， 以 嘛为 色 素 的 受 体 ， 研 究 c p ce /c p cf 翌 r e c a tpj 4* 9 h jjk jt 夏 组 反 应 的 影 响 。 通 过 重 组 实 验 发 现 ， c p c e /c p c f 可 以 将 天 然 a -c p c 罗 些 性 占 竺 _p c b 解 离 下 来 ， 但 不 能 将 p c b 转 移 到 p e c a 上 ， 只 有 在 p e ce /p e c f 的 帮 m r l ， 2 tr r * f 色索以p v b的形式转移到p e c a上， 生成具有可逆光致变色特性的a - p e c 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 助下， 才能将色素以p v b的形式转移到p e c a上， 生成具有可逆光致变色特性的a - p e c , 反应中无副产物即p e c a与p c b的直接偶联产物生成: 前一反应中色素的转移效率接近 1 0 0 %， 远大于后者。 实验结果表明，以 天然a - c p c为p c b的供体时，反应的专一性和 反应效率均高于本实验室已建立的以外源性p c b为色素来源的p e c a体外催化重组反应 体系.同时，该实验结果也意味着，蓝藻体内 a - p e c中共价结合的p v b除可以通过胆 绿素合成外， 还可能在c p c e / c p c f 和p e c e / p e c f 的共同 作用下， 由 蓝藻中含量最大的藻 胆蛋白 一藻蓝蛋白中共价结合的p c b转变而来。 通过研究表面活性剂在重组反应中的作用， 发现t r i t o n x - 1 0 0 可以抑制p e c a与p c b 的催化重组反应中直接偶联产物 ( 副产物) 的生成， 同时在p e c a与p c b的直接重组反 应中， 丁 ri t o n x - 1 0 0 可以改变色素的构象， 使重组产物的光谱性质发生相应的改变. 在 c p c a与 p c b的直接重组反应中， t r i t o n x - 1 0 0可以 保护 p c b不被氧化为中胆绿素 ( m e s o b i l i v e r d i n ，简称m b v ) ， 并在反应过程中改变p c b的构象，生成的色素蛋白 具 有与天然。 - c p c光谱性质相似。因此可以尝试在t r i t o n x - 1 0 0 作用下，通过脱辅基蛋白 的体外直接重组获得具有天然活性的蛋白。 ( 2 ) 具有双色素结合位点的蛋白 ( p e c b 和c p c b )的体外重组 p - p e c和p - c p c为 双色素结 合蛋白 ， 相 应的 脱辅基蛋白p e c b和c p c b具有双色素 结 合 位点( c y s - 8 4 和c y s - 1 5 5 ) 。 本 文 采用了 三种 方 法 研究p e c b 和c p c b 的 体 外 重 组。 1将层 理 鞭 枝藻 超 声 破 碎， 得 到的 藻 细 胞 提取 液 直接 用于p e c b 和c p c b 的 重 组 反 应. 实 验结果表明， 蓝藻体内 可能 存在有利于p e c b 和c p c b与p c b偶 联的物 质， 但由 于提取液中叶绿素和藻胆蛋白的干扰，产物的光谱分析不能提供有价值的实验数据。 2 以 天然藻蓝蛋白 为p c b 的 供体， 利用c p c e / c p c f 的 转移酶 功能 构 建的c p c b 和 p e c b的 重组反 应体系中，由 于c p c e / c p c f 对p c b的 亲和力很强， 而c p c b和p e c b 夺 取色素的能力相对较弱，生成的产物很少，难以检测。 3 以 外源性p c b为色素来源， 研究c p c b 和p e c b在各种实验条件下的重组反应。 在c p c b 与p c b的 体 外 重 组 实 验中 ， 研 究了 连 接多 肤c p c c ， 裂 合酶c p c e / c p c f , 裂 合 异 构 酶p e c e / p e c f 和 其 它因 子 如t ri to n x - 1 0 0 , p 一 疏基乙 醇， m g z + 以 及 溶 液的p h 等 对该反应的作用。 实验结果表明， c p c b与p c b体外重组生成的 色素蛋白 中 共价偶联的 色素均为p c b ，即重组反应是以p c b为反应前体，在反应过程中色素的种类未发生变 化 ; c p c b 中c y s - 1 5 5 可以自 催 化与p c b 偶 联， 而c y s - 8 4 通过 体 外 直 接重 组只 能 偶 联 非 天 然构 象的p c b . p e c e / p e c f 虽 然 对c p c b 与p c b的 重 组反 应有作 用， 但不能明 显改 善 该重组反应。对藻蓝蛋白 操纵子中与p - c p c生 物合成可能有关联的蛋白 质的研究表明， c p c c 和c p c e / c p c f 对c p c b的 体外重组反应有作用， 其作用小于p e c e / p e c f 。 为了 证实 c p c b 中c y s - 1 5 5 与p c b 的 反 应为自 催 化 反 应， 通过 定 点 突 变， 得 到 突 变 体c p c b c 8 4 s o 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 具 有 单 色 素 结 合 位 点( c y s - 1 5 5 ) 的 突 变 体c p c b c 8 4 s 与p c b 的 体 外 重 组 产 物 的 光 谱 性 质 与 理 论 预 测 值 吻 合。 根 据 产 物 的 吸 收 光 谱 和 荧 光 光 谱 分 析， 由 于c p c b c 8 4 s 和c p c b 的 结 构 有 细 微 差异， 使得c p c b c 9 4 s 与p c b 重 组生 成的 产 物中 共 价结 合的p c b 具 有 正 确的 能 级， 而构象未达到天然状态，因此产物的光谱易受外界环境影响。降低反应温度，同时 适当 延 长 反 应 时 间， 可以 改 善c p c b c 8 4 s 与p c b 的 重 组 反 应。 通 过c p c b cg 4 s 的 体 外 重 组 实 验证实， 在体外，c p c b中c y s - 1 5 5 与p c b的偶联反应是自 催化的，由 此推测在蓝藻 体内 p - c p c的生物合成过程中， c y s - 1 5 5 与p c b的偶联为自 催化反应。 在p e c b与p c b的体外重组实验中， 研究了连接多肤p e c c 、 裂合异构酶p e c e / p e c f , 裂 合 酶c p c e / c p c f 和 其 它 因 子 如t ri t o n x - 1 0 0 , p - 疏 基乙 醇、 m 矿 + 以 及 溶 液的p h 等 对 该反应的作用。实验结果表明， p e c b与p c b体外重组生成的色素蛋白中偶联的色素均 为p c b ，即p e c b与p c b的重组反应是以p c b为反应前体， 在反应过程中 色素的种类 未 发 生 变化; p e c b中c y s - 1 5 5 可以自 催 化与p c b 偶联， c y s - 8 4 通过 体 外 直 接 重组 只能 偶联 非天然构象的p c b ; 对于藻红 蓝蛋白 操纵子中 与p - p e c生物合成可能 有关 联的 蛋白 质的研究表明， p e c c可能是通过抑制p e c b与p c b的非天然偶联来影响p e c b的重组反 应，它不能明显改善该重组反应，p e c e / p e c f对 p e c b 的重组反应也无明显作用; c p c e / c p c f 对p e c b的重组反应有影响， 但也不能明 显改善该重组反应。 为了 证实p e c b 中c y s - 1 5 5 与p c b的 反应为自 催化反 应， 通过定点突 变. 得到突 变体p e , b c 8 4 a 。 具 有单 色 素 结 合 位 点( c y s - 1 5 5 ) 的 突 变 体p e c b c 8 4 a 与p c b 的自 催 化 连 接 生 成 的 产 物 光 谱 性 质 与 理论 预测值吻 合。 根据产物的 吸 收 光谱和荧光光谱分析，由 于p e c b c 9 4 a 和p e c b的 结 构有 细微差异， 使得p e c b c 8 4 与p c b 重组生 成的 产物中 共价结合的p c b 具有正确的能 级， 而 构 象未 达到天 然 状 态， 因 此 产物 的 光 谱易 受 外界 环 境影响. 通 过p e c b c 8 4 a 的 体 外 重组实验证实， 在体外， p e c b的c y s - 1 5 5 与p c b的偶联是自 催化的，因此推测蓝藻体 内 在 r -p e c 的 生 物 合 成 过 程 中 ， c y s-15 5 与 p c “ 的 偶 联 为 “ 催 化 反 应 。厂 关健词:蓝藻 层理鞭枝藻 藻红蓝蛋白 藻蓝蛋白 裂合异构酶 裂合酶 体外重组定点突变 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 mo l e c u l a r e n g i n e e r i n g a n d i n v i t r o r e c o n s t i t u t i o n o f p h y c o b i l i p r o t e i n s f r o m ma s t ig o c l a d u s l a mi n o s u s c a n d i d a t e f o r d o c t o r a l d e g r e e o f m e d ic i n e : j i n g p i n g z h u s u p e r v i s o r s : p r o f e s s o r v i k a i z h o u , p r o f e s s o r k a i h o n g z h a o ab s t r a c t p h y c o b i l i s o m e s s e r v e a s t h e s e s u p r a m o l e c u l a r p r o t e i nc o m p l e x e s , a r e p ri m a r i l y c o m p o s e d o f p h y c o b i l i p r o t e i n s , a b ri l l i a n t l y c o l o r e d f a m i ly o f p r o t e i n s b e a r i n g c o v a l e n t l y a t t a c h e d , o p e n - c h a i n t e t r a p y r r o l e s k n o wn a s p e p t i d e s , p h y c o b i l i n s . i n a d d i t io n , p h y c o b i l i s o m e s a l s o c o n t a i n s m a l l e r a m o u n t s o f l i n k e r w h i c h a r e r e q u i r e d f o r p r o p e r a n d f u n c t i o n a l o r g a n i z a t i o n o f p h y c o b i l i s o m e s . p h y c o b i l i n c h r o m o p h o re s p o s i t io n s b y c y s t e i n y l t h i o e t h e r l i n k a g e s t o a r e g e n e r a l ly b o u n d t o a p o p r o t e i n a t c o n s e r v e d g e n e r a t e p h y c o b i l ip r o t e i n s . f o u r m a i n t y p e s o f p h y c o b i l i n s a r e f o u n d i n a n d re d a l g a e : p h y c o e r y t h r o b i l i n ( p e b ) , p h y c o c y a n o b i l i n ( p c b ) , p h y c o u r o b i l i n ( p u b ) a n d p h y c o v io l o b i l in ( p v b ) . b as e d o n t h e i r a b s o r p t i o n s p e c t r a l p r o p e rt i e s , p h y c o b i l i p r o t e i n s h a v e b e e n a s s i g n e d t o f o u r c l a s s e s : ( p c ) , ( p e ) , ( a p c ) a n d p h y c o e r y t h ro c y a n i n ( p e c ) , i n w h i c h t h e l a tt e r i s h e t e r o c y s t - f o r m i n g c y a n o b a c t e r i a . p h y c o b i l i p r o t e i n fr o m h e t e r o - m o n o m e r s c o n s i s t i n g o f t w o d i ff e r e n t s u b u n i t s , 1 y f o u n d i n c e rt a i n f i l a m e n t o u s , c y a n o b a c t e r i a a a n dp ，w h i c h a n d r e d a l g a ear e e q u i m o l a r s t o i c h i o m e t r y ( a p ) . t h e s u b u n i t s g e n e r a l l y c o n t a i n 1 -4 p r o s t h e t i c t y p e a n d n u m b e r o f c o v a l e n t l y a t t a c h e d p h y c o b i l i n s c a u s e t h e d i ff e r e n t o f p h y c o b i l i p r o t e i n s . a r e p r e s e n t i n g r o u p s . a n d t h e a b s o r p t i o n p r o p e rt i e s p h y c o b i l i p r o t e i n s a r e i m p o r t a n t c o m p o n e n t s c y a n o b a c t e ri a . s t u d i e s o n t h e b i o s y n t h e s i s o f m m e u n d e r s t a n d i n g o f t h e e v o l u t i o n o f p h o t o s y n t h e o f t i g h t - h a r v e s t i n g p r o t e i n c o m p l e x p h y c o b i l ip r o t e i n s w o u l d p r o m o t e s i s a n d i t s m e c h a n i s m . u n t i l n o w , s o m e w o r k s 华 中 科 技大 学 博 士 学 位 论 文 a b o u t t h e f u n c t i o n o f p h y c o c y a n i n l y a s e c p c e / c p c f a n d p h y c o e r y t h r o c y a n i n i s o m e r a s e - l y a s e p e c e / p e c f h a v e b e e n r e p o rt e d . t h e y c a t a l y z e d t h e b i o s y n t h e s i s o f a s u b u n i t s o f p h y c o c y a n i n ( a - c p c ) a n d p h y c o e r y th r o c y a n i n ( a - p e c ) , r e s p e c t i v e l y . t h i s w a s c o n fi r m e d b y i n v i v o a n d i n v i t r o e x p e r i m e n t s . l itt l e h a s b e e n k n o w n a b o u t t h e b i o s y n t h e s i s o fps u b u n i t s o f p h y c o c y a n i n ( (3 - c p c ) a n d p h y c o e r y t h r o c y a n i n ( p - p e c ) . i n t h i s d i s s e r t a t i o n , m a s t ig o c l a d u s l a m in o s u s w a s u s e d i n t h e s t u d i e s o n 动v i t r o r e c o n s t i t u t i o n o f t h e s e p h y c o b i l i p r o t e i n s . mo l e c u l a r b i o l o g y t e c h n i q u e w a s u s e d t o c o n s t r u c t c l o n i n g p l a s m i d s a n d e x p r e s s i o n p l a s m i d s c o n t a in i n g s u c h g e n e s : p e c a w 12 s f ， p e c a -n 4 5 , p e c a -n 6 5 , c p c a , p e c b , p e c b ca , c p c b , c p c b c s 4 s ， p e c c a n d c p c c , th e n c o r re s p o n d in g p r o t e in s , w h i c h w o u ld b e n e e d e d in r e c o n s t i t u t io n e x p e r im e n t s , w e r e e x p re s s e d a n d p u r if i e d w it h n i t + - c h e la t i n g a ff i n i t y c h r o m a t o g r a p h y , r e s p e c t i v e l y . a t t h e s a m e t i m e , t h e s e q u e n c e s o f c p c e a n d c p c f fr o m m a s t ig o c l a d u s l a m i n o s u s p c c 7 6 0 3 w e r e c l o n e d a n d s e q u e n c e d . a n d t h e h o m o l o g y c o m p a r i s o n o f a m i n o a c i d s e q u e n c e s o f c p c e a n d c p c f fr o m s e v e r a l s p e c i e s o f c y a n o b a c t e r i a wa s d o n e . i n t h i s w o r k , t h e s t u d i e s o n i n v i t r o r e c o n s t i t u t i o n in c l u d e t w o p a rt s : ( 1 ) i n v i t r o r e c o n s t i t u t i o n o f a p o p r o t e in s ( p e c a a n d c p c a ) w h i c h h a v e o n e b i l i n a t t a c h m e n t s i t e , ( 2 ) i n v i tr o r e c o n s t i t u t i o n o f a p o p r o t e i n s ( p e c b a n d c p c b ) w h i c h h a v e t w o b i l i n a t t a c h m e n t s i t e s in v i t r o re c o n s t i t u t i o n o f p e c a ( a n d c p c a ) w i t h b i li n a - p e c a n d a - c p c a r e p h y c o b i l ip r o t e i n s c o n t a i n i n g o n e b i l i n ; t h e i r a p o p r o t e in s ( p e c a a n d c p c a ) h a v e o n e b i li n a t t a c h m e n t s i t e a t c y s - 8 4 . l i k e p h y t o c h r o m e , a - p e c h a s h i g h l y re v e r s i b l y p h o t o c h r o m i c a c t i v i t y . w i t h l o w m o l e c u l a r w e i g h t a n d s im p l e s t r u c t u r e , a - p e c h a s p r e d o m i n a n c e i n s t u d i e s o n d y n a m i c s t a t e s o f re v e r s i b l e p h o t o c h r o m i s m a n d p h o t o s w i t c h d e s i g n . t o s t u d y t h e re l a t i o n s h ip b e t w e e n t h e s t r u c t u r e o f a - p e c a n d i t s f u n c t i o n , m u t a n t s o f p e c a v w e r e c o n s t r u c t e d in o u r l a b o r a t o ry . t h r o u g h i n v it ro re c o n s tit u t i o n o f m u t a n ts o f p e c a w it h p c b , i t w as f o u n d t h a t c - t e r m i n a l i s n e c e s s a ry f o r i t s f u n c t i o n a n d s t r u c t u r e . a n d t h e s p e c t r a l c h a r a c t e r i z a t io n o f c a t a ly z e d re c o n s tit u t e d p r o d u c ts o f p e c a - n 1 9 a n d p e c a - n 3 1 w as s i m i l a r t o a - p e c . i n t h i s w o r k , m u t a n t s p e c a - n 4 5 a n d p e c a - n 6 5 w e re c o n s t r u c t e d . t h r o u g h i n v i t r o re c o n s t i t u t i o n o f p e c a - n 4 5 a n d p e c a n6 5 , i t w as f o u n d t h a t a - p e c - n 4 5 w as p r o b a b l y t h e s m a l l e s t p h y c o b i l i p r o t e i n w it h h i g h l y r e v e r s i b l y p h o t o c h r o m i c a c t i v i ty . t h e s p e c i fi c i ty o f p e c e / p e c f o n s u b s t r a t e b i l in s w as s t u d i e d . t h e re s u l t s s h o w e d t h a t p e c e / p e c f h a d h ig h a ff i n i ty t o p c b a n d p e b . i n t h i s w o r k , t h e s p e c i fi c i ty o f p e c e / p e c f o n f o u r s u b s t r a te a p o p r o t e i n s , c p c a , p e c a , p e c a , a n d p e c a w 12 8 f w as s t u d i e d . p e c e / p e c f vr 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 c o u l d c a t a l y z e i n v i t r o r e c o n s t i t u t i o n o f p c b w i t h a p o p r o t e i n s o f a - p e c fr o m t w o d i ff e r e n t s u b s p e c i e s o f m a s t i g o c l a d u s l a m in o s u s , a s w e l l p e c a w r z s f ， t h e s it e - d i re c t e d m u t a t e d a p o p r o t e i n o f a - p e c . p e c e / p e c f c o u l d n o t c a t a l y z e t h e l i g a t i o n o f p c b w i t h c p c a , a l t h o u g h c p c a a n d p e c a a r e h o m o l o g o u s p r o t e i n s . i n v i t r o , c p c e / c p c f c a t a l y z e d t h e a d d i t io n o f p c b t o c p c a , a n d a l s o c a t a l y z e d t h e t r a n s f e r o f p c b fr o m a - c p c o f o n e o r g a n i s m t o a p o - a - c p c ( c p c a ) o f a n o t h e r . t h e re w a s a s m al l e r b u t s i g n i f i c a n t a m o u n t o f a d d i t i o n w i t h p - c p c a s d o n o r o f p c b ; t h i s a d d i t i o n w a s n o t c p c e / c p c f - d e p e n d e n t . i n t h i s w o r k , i t w a s f o u n d t h a t w i t h t h e h e l p o f p e c e / p e c f , c p c e / c p c f c o u l d t r a n s f e r p c b fr o m n a t i v e a - c p c a n d n a t i v e r - c p c t o p e c a , a n d p r o d u c e a - p e c , s o r e v e r s i b l y p h o t o c h r o m i c a c t i v i ty o f a - p e c w as d e t e c t e d . i n t h e s e t w o r e a c t i o n s , n o b y p r o d u c t s ( t h e s p o n t a n e o u s a d d u c t o f p c b w i t h p e c a ) w e re p r o d u c e d . t h e t r a n s f e r e ff i c i e n c y w as n e a r 1 0 0 % , i n w h i c h p c b w as t r a n s f e r r e d fr o m c c- c p c t o p e c a , b e in g l a r g e r t h a n t h e p r o c e s s o f p c b t r a n s f e r fr o mp - c p c t o p e c a . wh e n n a t iv e a - c p c w as u s e d as d o n o r o f p c b , t h e e f f i c i e n c y a n d s p e c i f i c i ty o f t h e e n z y m a t i c r e c o n s t i t u t i o n w as b e tt e r t h a n t h a t o f p e c a w i t h e x t r a n e o u s p c b , w h i c h h as p r e v i o u s l y b e e n e s t a b l i s h e d i n o u r l a b o r a t o ry . f r o m t h e t r a n s f e r o f (x - c p c t o p e c a , t h e p o s s i b i l i ty m i g h t b e d e d u c e d t h a t in c y a n o b a c t e r i a , p v b b o u n d t o a - p e c n o t o n ly c a m e fr o m p c b w h i c h w as b i o s y n t h e s i z e d fr o m b i l i v e r d in r e d u c t i o n , b u t a l s o fr o m t r a n s f e r o f p c b b o u n d t o p h y c o c y a n i n , w i t h t h e h e l p o f c p c e / c p c f a n d p e c e / p e c f . f r o m t h e s t u d y o f t h e s u r f a c t a n t e ff e c t o n i n v i t r o r e c o n s t i t u t i o n , i t w as f o u n d t h a t t r i t o n x - 1 0 0 c o u l d i n h i b i t s p o n t a n e o u s a d d i t i o n i n t h e e n z y m a t i c r e c o n s t i t u t i o n o f p e c a . i n s p o n t a n e o u s a d d i t i o n o f p c b t o p e c a , t r i t o n x - 1 0 0 c o u l d c h a n g e t h e c o n f o r m a t i o n o f p c b , a n d t h e s p e c t r u m o f t h e r e c o n s t i t u t e d p r o d u c t w as a l s o c h a n g e d . i n s p o n t a n e o u s a d d i t i o n o f p c b t o c p c a , t r i t o n x - 1 0 0 c o u l d p r o t e c t p c b fr o m o x i d a t i o n a n d c h a n g e t h e c o n f o r m a t i o n o f p c b , a n d t h e s p e c t r a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e p r o d u c t w as s i m i l a r t o n a t i v e a - c p c . s o w i t h t h e h e l p o f t r i t o n x - 1 0 0 , it w as p o s s i b l e t o g e t c h r o m o p r o t e i n s , w h o s e s p e c t r al p r o p e rt i e s w e r e s i m i l a r t o n a t i v e p r o t e i n s , t h r o u g h t h e s p o n t a n e o u s a d d it i o n o f b i l i n s t o a p o p r o t e i n s . i n v i t r o r e c o n s t i t u t i o n o f p e c b ( a n d c p c b ) w i t h b i l i n (3 - p e c a n d a - c p c a r e p h y c o b i l i p r o t e i n s c o n t a i n i n g t w o p c b ; t h e i r a p o p r o t e i n s ( p e c b a n d c p c b ) h a v e t w o b i l i n a t t a c h m e n t s it e s a t c y s - 8 4 a n d c y s - 1 5 5 . i n t h i s w o r k , t h r e e m e t h o d s w e re u s e d i n i n v i t ro r e c o n s t i t u t i o n e x p e r i m e n t s o f c p c b a n d p e c b . 1 t o f i n d s o m e f a c t o r s i n c y a n o b a c t e r i a t h a t w o u l d b e e ff e c t i v e i n r e c o n s t i t u t i o n vi l 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论文 r e a c t i o n o f p e c b ( a n d c p c b ) w i t h p c b , m a s t ig o c l a d u s l a m i n o s u s w a s s o n i f r c a t e