（动物遗传育种与繁殖专业论文）猪场污水中脱氮微生物的分离与鉴定的研究.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密 譬 如需保密，解密时间 矽p 年乡月y e lo 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同- 1 - _ 作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名： 1 ) 鹚、兰 时间： 加p 7 年6 月纠日 学位论文作者签名：f j 鹁兰 导师签名：艰孽够 签名日期：砷订年占月1 日签名日期：w 卯年否月纠日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 国家自然科学基金( 3 0 4 7 1 2 7 1 ) 资助 湖北省科技攻关重点项目( 2 0 0 7 ) 资助 1 ：! ：； ：； 4 j 1 1 3 微生物在环境治理中的应用8 1 1 4 传统生物脱氮的原理9 1 1 5 传统脱氮工艺的局限性” 1 2 文献综述1 2 1 2 1 脱氮微生物的研究进展，2 1 2 2 微生物脱氮的主要影响因素，3 1 3 研究目的和意义1 5 2 材料和方法。1 6 2 1 材料16 2 1 1 主要试剂及药品，6 2 1 2 主要仪器j 7 2 2 方法l7 2 2 1 水样的采集，7 2 2 2 水样的富集培养，7 2 2 3 脱氮微生物的初筛，7 2 2 4 微生物的纯化，8 2 2 5 脱氮微生物的复筛j 9 2 3 不同含氮化合物检测方法的建立1 9 2 3 1 氨氮的定量测定纳氏试剂光度法j ，9 2 3 2 亚硝酸盐的定量测定- n ( 1 一萘基) 一乙二胺光度法( a ) 2 0 2 3 3 硝酸盐的定量测定酚二磺酸光度法( a ) 2 2 2 4 分离微生物脱氮效果的比较2 4 2 5 菌株b 2 最佳脱氮条件的筛选2 4 2 5 1 温度对b 2 氨氮降解率的影响刀 2 5 2p h 对菌株b 2 氨氮降解率的影响刀 2 5 3 最佳碳源的筛选刀 2 5 4 不同的c n ( 质量比) 对脱氮效果的影响2 4 2 6 菌株b 2 实际污水的脱氮效果评价2 4 2 6 1 污水水样“ 2 6 2 猪场污水水质刀 2 6 3 菌株b 2 实际脱氮能力的检测乃 2 7 菌株b 2 的鉴定2 5 2 7 1 形态学鉴定乃 2 7 2 生理生化鉴定乃 2 7 316 sr r n a 的同源性比较乃 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 2 8 数据分析2 6 3 结果与讨论2 7 3 1 结论2 7 3 1 1 脱氮微生物的初筛结果2 7 3 1 2 氨氮的定量测定一刀 3 1 - 3 亚硝酸盐的定量测定2 9 3 1 4 硝酸盐的定量测定3 d 3 1 5 分离微生物脱氮效果的比较3 d 3 1 6 菌株b 2 最佳脱氮条件的筛选3 ， 3 1 7 菌株b 2 实际污水的脱氮效果评价3 3 3 1 8 菌株b 2 的鉴定结果鲥 3 2 讨论3 5 3 2 1 微生物的分离与纯化3 5 3 2 2 菌株b 2 脱氮条件及特点3 5 3 2 3 关于菌株b 2 实际脱氮效果的评价3 6 3 3 小结3 6 3 3 1 本研究获得的结果靳 3 3 2 下步值得研究的工作3 6 参考文献3 8 附录l 菌株b 21 6 s r r n a 测序结果。4 3 致谢4 4 猪场污水中脱氮微生物的分离与鉴定的研究 摘要 水是宝贵的自然环境资源，是人类生存和发展的源泉。氮素是水体中污染的 一类重要污染物。不仅可用引起水体富营养化，还可直接影响动物及人体的健康。 猪场污水是集约化养猪场饲养过程中由生猪所排放出的液体代谢产物和冲洗固 体粪便等生活残渣所产生的高浓度有机污水。随着畜牧业的发展，猪场污水也是 也是氮素的一个主要来源。水污染越来越严重，如何有效处理和处置畜牧养殖业 的污水，使其达到排放标准，达到回收利用，减少环境污染的等问题正摆在我们 面前。脱氮是污水处理过程中一个重要的环节。生物脱氮是目前污水脱氮处理中 最常见的方法。 为了得到脱氮能力较强的微生物，本试验通过极限稀释法以及平板划线法， 共筛选到了3 4 株微生物，通过对这3 4 株微生物的复筛试验，得到一株脱氮效果 最好的菌株b 2 ，在高浓度的人工废水中，4 8 h 内氨氮去除了为7 9 9 4 。经鉴定 为不动杆菌属。 对菌株b 2 进行了相关性质的研究，确定了最佳脱氮条件：最佳温度是3 5 、最佳c n 为1 9 3 ，最佳为p h = 8 1 ，对小分子碳源有较强的依赖性。 对b 2 进行了实际污水脱氮效果的评价，由于实际污水成分复杂，去除率为 7 5 7 7 。在真正污水处理过程中，菌株要经过驯化的过程。 关键词：猪场污水；生物脱氮；异养硝化；好氧硝化 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 a b s t r a c t w 缸e ri st h ev a l u a b l en a t u r a lr e s o u r c e s ，a n di ti st h es o u r c e so fh u m a ne x i s t e n c e a n dd e v e l o p m e n t n i t r o g e ni so n eo fm a j o rp o l l u t a n t so fw a t e rp o l l u t i o n ，a n dc a n c a u s ew a t e re u t r o p h i c a t i o na n dc a nd i r e c t l yi n f l u e n c et h eh e a l t ho fa n i m a la n dh u m a n p i g f a r ms e w a g ei st h eh i g hd e n s i t yo r g a n i cs e w a g et h a ti st h er e s u l to fl i q u i d s u p e r s e s s i o nd i s c h a r g e do u tb yl i v ep i ga n ds o l i de x c r e m e n ta n du r i n ei ni n t e n s i f yp i g f a r mr a i s e dc o u r s e w i t l lt h ed e v e l o p m e n to fa n i m a lh u s b a n d r y ，t h es e w a g eo fp i g f a r mi sap l a i nm a i ns o u r c eo fn i t r o g e nt o o t h ew a t e rp o l l u t i o ni sm o r ea n dm o r e s e r i o u s ，h o wt od e a lw i t l la n dh a n d l et h es e w a g e so ft h ea n i m a lh u s b a n d r yf e e d i n g e f f e c t i v e l y ，h o wt om a k ei tr e a c ht ot h ed i s c h a r g es t a n d a r da n dr e c y c l ea n dr e d u c et h e e n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o n ，t h o s eq u e s t i o n sa r eb e i n gp u ti n f r o n to fu s t h e d e n i t r i f i c a t i o ni sa ni m p o r t a n tl i n ki nt h ec o u r s eo fs e w a g ed i s p o s a l t h eb i o l o g i c a l d e n i t r i f i c a t i o ni st h em o s tc o m m o nm e t h o di nt h es e w a g ed e n i t r i f i c a t i o na tp r e s e n t i no r d e rt or e c e i v et h em i c r o o r g a n i s mo ft h ed e n i t r i f i c a t i o nw i t hs t r o n g e ra b i l i t y ， 3 4s t r a i n so fm i c r o o r g a n i s mw h i c hc o u l dh e t e r o t r o p h i cn i t r i f yw e r ei s o l a t e d t h r o u g h t ot h es e c o n ds i ri n3 4s t r a i n s ，w ef o u n ds t r a i nb 2c o u l dr e m o v en i t r o g e nm o s t r a p i d l yi nt h o s e3 4s t r a i n s i nt h ea r t i f i c i a lw a s t ew a t e ro ft h eh i g hd e n s i t y , i ti s 7 9 9 4 t h a ta m m o n i an i t r o g e ni sr e m o v e di n4 8 h s t r a i nb 2w a si d e n t i f i e da s a c i n e t o b a c t e rg e n u s c a r r y i n go nt h er e s e a r c ho fr e l e v a n tp r o p e r t i e st ob 2 ，w eh a dc o n f i r m e dt h eb e s t d e n i t r i f i c a t i o nc o n d i t i o n t h em o s to p t i m a ln i t r o g e nr e m o v a lc o n d i t i o ni s35 ，c n = 19 3l ，p h = 8 10 ，t h e r ei sas t r o n g e rd e p e n d e n c et ot h ec a r b o ns o u r c eo fs m a l l m o l e c u l ef o rb 2 i n o c u l a t i n gb 2w i t ht h es e w a g eo fp i gf a r m ，n i t r o g e nr e m o v a la b i l i t yo fb 2w a s m e a s u r e di nt h er e a ls e w a g e b e c a u s eo ft h er e a ls e w a g ec o m p l i c a t e dc o m p o s i t i o n ，i t i s7 9 9 4 t h a ta m m o n i an i t r o g e ni sr e m o v e d s oi nr e a ls e w a g ed i s p o s a l ，t h ec o u r s e 廿1 a tt h eb a c t e r i a ls t r a i ns h o u l db et a m e d k e yw o r d ：s e w a g eo fp i gf a r m ；b i o l o g i c a ld e n i t r o g e n a t i o n ；h e t e r o t r o p h i c n i t r i f i c a t i o n ：a e r o b i cd e n i t r i f i c a t i o n 2 猪场污水中脱氮微生物的分离与鉴定的研究 1 前言 1 1 研究问题的由来 水是宝贵的自然环境资源，是人类生存和发展的源泉。水的自然循环不断补 充和再生人类所需的水资源，水的社会循环消耗地球陆域的水资源。当两个循环 不协调，再生和消耗不平衡，供需产生矛盾，就出现水资源紧缺。近年来，伴随 这工业化、人民生活水平的提高，用水需求的不断增长，世界上许多国家出现了 供水危机。据有关资料显示，我国农业每年缺水量为农业用水量的3 0 6 ；工业 每年缺水量为工业用水量的4 4 。北方大城市缺水更为严重，据统计，全国6 6 9 个大城市中有4 0 0 多个缺水。其中又有1 1 0 个为严重缺水，城市缺水量估计在 6 0 亿吨年( 徐根良，1 9 9 7 ) 。另外，我国干旱、半干旱地区面积比重较大，约占 国土总面积的4 7 ，西北各省区竟高达8 0 ，这些地区雨量稀少，水资源十分 贫乏，早已成为影响这些地区经济发展的制约因素。我国水资源供需状况不容乐 观。水污染严重、水土流失与可持续发展的矛盾突出。目前，我国虽然在污水处 理方面发展较快，但年处理污水能力只达到8 0 亿立方米，约占总排放量的2 0 左右。而其余8 0 污水不仅得不到利用，而且还被排放到江河中对更多的水域产 生污染。全国污水排放总量逐年上升，河湖污染有加重之势，水环境总体状况还 没有根本好转。在众多的环境污染源中，畜牧养殖业所产生的大量粪尿、废弃物 和有机废水等所造成的污染是不可忽视的一部分。这些问题需要引起我们的高度 重视并逐步加以解决。氮素是水体污染中的一类重要污染物，它主要以有机氮和 无机氮两种形式存在，前者主要有蛋白质、多肽、氨基酸、尿素等，主要来源于 生活污水、农业废弃物( 植物桔梗、牲畜粪便等) ( 井艳文，李军，潘安君，1 9 9 8 ) 和某些工业废水( 羊毛加工、制革、印染、食品加工) 等。这些有机氮经过微生 物的氨化作用转化为无机氮。水中无机氮指氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮。它们 一部分是由有机氮经微生物分解后转化形成的，还有一部分来自于施用氮肥的农 田排水和地表径流，以及某些工业废水( 冶金工业的炼焦车间、化肥厂) 。 氮是水环境中的一个重要的污染因子，随着石化、食品和制药等工业的发展 以及人民生活水平的提高，城市污水、工业污水和垃圾渗滤液中的氮含量急剧上 升( 华光辉，张波，2 0 0 0 ) ，氮在污水中主要存在有分子态氮、有机态氮、氨态 氮、亚硝酸氮和硝态氮以及硫氰化物和氰化物，而在未处理的原废水中，有机态 氮和氨态氮是氮的主要存在方式；经二级生化处理后出水中氨态氮和硝态氮是氮 的主要存在形式。在一定形式下各种氮可以互相转化。在新鲜的生活污水中，有 机氮约占6 0 、氨氮约占4 0 ( 李福才，李彤，1 9 9 6 ) 。在陈腐的生活污水中， 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 因受生物的分解，有机氮含量降低，氨氮含量升高。根据报道，美国城市污水的 含氮量约为2 0 - - - 8 5 m g l 。许多工业废水，如制革废水、食品加工废水、炼焦废 水、合成氨废水都含有大量的氮素污染物。畜禽养殖业废水也含有大量的氮素污 染物。据统计，1 9 9 9 年我国排放的养殖业废水超过2 0 0 亿t 氮污染物高达1 5 7 9 t 。 值得关注的是，在解决垃圾问题后，垃圾渗滤液又成了新的问题。据统计，2 0 0 0 年我国生活垃圾的产量为1 2 亿t 左右，垃圾填埋渗滤液每升的含氮量高达数百 甚至数千毫克( 李以翠，赵孟彬，周道雷，席磊，2 0 0 6 ) 。因此，废水的脱氮处 理已成为环境工作者研究的热点之一。 1 1 1 畜牧业生产对环境造成的污染 2 1 世纪，人类面临着环境污染日趋加剧，生态环境日益恶化的严峻性形势。 在众多的环境污染源中，畜牧养殖业所造成的污染是不可忽视的一部分。随着畜 牧业产业化的发展和生产经营规模的扩大，畜牧业在给市场提供了大量质优价廉 的畜产品，保证人类物质生活提高和社会经济发展的同时，也产生了大量粪尿、 废弃物和有机废水等，给环境造成了严重的污染。畜牧业生产对环境造成的污染 有： ( 1 ) 恶臭气体污染畜禽粪尿中含有大量的未被消化吸收的有机物。这些有 机物大体可分为碳水化合物和含氮化合物。碳水化合物在有氧条件下分解释放热 量，大部分分解成c 0 2 和水。在无氧条件下，氧化反应不完全，可分解成甲烷、 有机酸和醇类。含氮化合物主要是蛋白质，在有氧条件下，蛋白质分解的最终产 物是硝酸盐类；而在无氧条件下，可分解成氨，乙烯醇，二甲基硫醚，硫化氢， 甲胺，三甲胺等恶臭气体。在这些粪便所产生的气体中，浓度较高，对人畜健康 影响最大的有害气体主要有n h 3 、h 2 s 、c 0 2 、c h 4 等( 林燕，孔海南，何义亮， 严立，李春杰，2 0 0 6 ) 。其中n h 3 就是水中氮素的主要来源。n h 3 是一种无色， 具有刺激性臭味的气体，易溶于水。在畜舍中，氨气常被溶解或吸附在潮湿的地 面、墙壁及家畜的粘膜上，刺激家畜的外粘膜，引起粘膜充血、喉头水肿。氨气 进入呼吸道，可引起咳嗽、气管炎和支气管炎、肺水肿出血、呼吸困难、窒息等 症状。高浓度的氨，可直接刺激体组织，引起碱性化学性灼伤，使组织溶解、坏 死，还能引起中枢神经系统麻痹、中毒性肝病、心肌损伤等症。家畜处在低浓度 氨的长期作用下，体质变弱，对某些疾病的易感性增强，采食量，日增重，生产 力都下降( 朱尚雄，1 9 9 0 ) 。有试验报道，饲养在5 0 m g m 3 n h 3 的空气中，幼猪 增重率下降1 2 ，1 0 0 m g m 3 或1 5 0 m g m 3 时，下降3 0 。2 0m g n i 3 n h 3 的空气中， 可引起鸡的角膜结膜炎，新城疫发病率大大增加。在5 0m g m 3 时，能使呼吸频 率下降，产蛋量减少。有的国家规定，畜舍中氨的最高允许浓度为1 9 5m g m 3 。 鸡对氨特别敏感，因此，鸡舍中氨的最高浓度为1 5m g m 3 ( 严柏罗，张建平，) 。 4 猪场污水中脱氮微生物的分离与鉴定的研究 ( 2 ) 氮磷( n 、p ) 的污染，研究资料表明，由于畜禽对蛋白质饲料的利用率 不高，5 0 0 o , - - 7 0 的饲料氮以粪氮和尿氮的方式排出体外。未经处理的粪便，一 部分氮挥发到大气中增加了大气的氮含量，严重时构成酸雨，危害农作物；其余 大部分则被氧化成硝酸盐渗入地下或随地表水流入江河，从而造成广泛的污染。 另外，谷物饲料中的植酸磷，在畜禽体内利用率不高，大部分随粪便排出体外， 造成土壤和地下水的磷污染。排入江河，造成江河的水体富营养化，进一步造成 危害。 ( 3 ) 重金属元素的污染，近年来，随着饲料工业的发展，一些新型饲料添 加剂中含有铜、砷、汞、硒等重金属元素。他们给环境带来的危害不可忽视。以 砷为例，近年来在宣传媒介中对有机砷制剂，如对氨基苯砷酸和硝羟基苯砷酸的 介绍有片面强调其促生长及医疗效果的一面，而忽视其致毒及可能导致环境污染 的一面。据预测，一个万头猪场按美国f d a 允许使用的砷制剂剂量推算，若连 续使用含砷饲料，5 8 a 后将可能向猪场周边排入1 t 砷。1 6 a 后土壤中砷含量可 翻一番。土壤中砷含量每升高l m g k g ，则甘薯块根中砷含量即上升0 2 8 m g k g ， 不超过1 0 a ，该地所产甘薯中砷含量会全部超过国家食品卫生标准，这片耕地只 能废弃或改种其它作物。 ( 4 ) 抗生素的污染，抗菌素随饲料进入动物消化道后，短时间内进入动物 血液循环，最终大多数的抗菌素经肾脏的过滤，随尿液排出体外，极少量没排出 的抗菌素就残留在动物体内。大多数饲料用抗菌素都有残留，只是残留量大小不 同。这些残留在动物体内的抗菌素失去抗菌作用，最终随着畜禽产品成为人类食 品，对人体可能有毒副作用。一些残留的抗菌素随食品的加热也不会完全分解， 其降解产物甚至有更强的毒害作用。有些则随着家畜粪便作为肥料供植物吸收 后，其果实会毒死某些动物。 ( 5 ) 有害病菌的污染，有关资料表明，在l g 猪场的粪污水中，含有8 3 万 个大肠肝菌，6 9 万个肠球菌，还含有寄生虫卵，活性较强的沙门氏菌等( 孙振钧， 2 0 0 0 ) 。这些有害病菌，如果得不到妥善处理，将污染环境，这不仅会直接威胁 畜禽自身的生存，还会严重危害人体健康。 ( 6 ) 药物残留的污染，现代畜牧业在生产中都大量使用各种消毒药剂和各 类药物治疗畜禽疾病，部分残留物通过畜禽粪便排泄进入土壤污染环境，甚至在 生物链中蓄积，危害畜禽生产及人类健康( 翟国华，1 9 9 8 ) 。 ( 7 ) 死畜的污染在畜牧业生产中，特别是在规模化养殖场，如果死畜处理不 当，将会给环境带来严重的污染，导致蚊虫滋生，臭气四溢。这不但会污染环境， 而且引来狗、猫、老鼠和苍蝇等，给畜禽业的防疫构成威胁。 ( 8 ) 畜禽屠宰的废弃物的污染，县乡一级畜禽屠宰的废物、废水直接排入 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 下水道、水渠、河流。其中的悬浮物和含氮有机物分解使水质变黑、变臭，致使 蚊、蝇滋生，危害人们健康。同时水中b o d 、c o d 严重超标，使水体富营养化， 危害水生生物。 ( 9 ) 粉尘、垫料、饲料残渣及鳞片物等的污染，畜禽饲喂中垫料，饲料残 渣及粪便等会滋长各种微生物，粉尘是微生物的载体，并吸咐大量臭气( 张文龙， 王建彬，周景明，2 0 0 1 ) 。同时微生物不断分解粉尘，有机质而产生臭气，引诱 苍蝇、蚊虫等，使空气恶浊。禽类养殖中，特别是换羽季节，鳞片、绒羽等四处 飞散，污染环境。 1 1 2 污水中氮素对水质的危害 随着工农业的发展，世界各国污水总量及其有机物和氮磷营养物的排放总量 不段增加，大量氮素进入水体，引起水体质量恶化，造成了多方面的危害： ( 1 ) 引起水体的“富营养化，使水体变得腥臭难闻，透明度下降，使水恶 化，鱼类和其他水生物大量死亡，富营养化在海水形成“赤潮 ( 郑兴灿，李亚 新，1 9 9 8 ) 。 ( 2 ) 消耗水体中溶氧量，使水体正常的溶解氧平衡受干挠，并进一步促使 水质恶化。还原态氨排入水体会因硝化作用而耗去水体中大量的氧气( 1 m o l n h 3 氧化成l m o ln 0 3 。，需消耗2 m 0 1 0 2 ) 。 ( 3 ) 影响水源水质，增加水处理负担，在水厂加氯消毒时，水体中少量氨 会使氯量成倍增加。此外，还会使脱色、除臭、除味的化学剂投量增加，增加环 境的负担。 ( 4 ) 水体的感观性状恶化，氮化合物是植物性营养物，在湖泊、水库一类 的缓流水体中，会便水中藻类异常增加，水呈绿褐色，有损水体外观，旅游价值 降低。 ( 5 ) 对人和生物的毒害作用，硝酸盐对人和生物体有明显的毒性作用，摄 入人体后，在胃肠道细菌的作用下，可还原成亚硝酸盐，而亚硝酸盐可与血红蛋 白结合形成高铁红血蛋白，造成缺氧。尤其3 个月以内的婴儿对硝酸盐特别敏感， 易患高铁血红蛋白症。当血中1 0 左右的血红蛋白转变为高铁血红蛋白时，婴 儿既会出现紫绀等缺氧症状。一些研究发现硝酸盐可引起动物心肝等方面的问 题。j ( 6 ) 致癌和致畸作用，亚硝酸盐还可以与仲胺等形成亚硝胺，此类反应可 以经过化学或者生物学途径进行，既可以在环境中外源性合成，也可以在体内进 行内源性合成( 鲍立宁，2 0 0 5 ) 。动物实验表明，亚硝胺有致癌和致畸作用。国 内外的流行病学研究也都表明，胃癌和食道癌的发病率与饮用水中硝酸盐的浓度 成正相关。 6 猪场污水中脱氮微生物的分离与鉴定的研究 虽然目前我国在水处理防治方面做了很多工作，但是氮素仍是造成水体污染 的主要原因之一。据2 0 0 3 年中国环境状况公报报道：主要湖泊氮、磷污染 严重，导致富营养化问题突出。滇池草海为重度富营养状态，太湖和巢湖为轻度 富营养状态。全国大部分城市和地区地下水水质，三氮( 硝酸盐、亚硝酸盐、氨 氮) 污染均较突出。2 0 0 2 年，全海域共发现赤潮7 9 次，累计面积超过1 0 0 0 0 平 方公里。氮素等环境污染物对水体的污染进一步加剧了水资源的短缺，成为严重 制约我国社会经济持续发展、危害环境生态、影响生活质量和身体健康的突出问 题。因此水体中氨氮的去除，对保护环境，发展经济和保障健康都具有重要的意 义。 猪场污水是集约化养猪场饲养过程中由生猪所排放出的液体代谢产物和冲 洗固体粪便等生活残渣所产生的高浓度有机污水。据统计1 头猪的日排泄粪尿可 达6 k g ，是人排粪尿量的5 倍，年产粪尿约达2 5 t 。如果采用水冲式清粪，1 头 猪日污水排放量约为3 0 蚝。一头成年猪每日粪尿中的b o d 是人粪尿的1 3 倍， 据估测全国养猪业年粪尿总量是全国人粪尿b o d 的1 1 倍。一个万头猪场采用水 冲清粪仅污水量每天就达15 0 2 5 0 t ，可见养殖污染已经超过生活污水的污染成 为我国最大的污染源之一，而且随着我国养殖业的发展，其情况还会更加严重。 因此如何有效治理和研究猪场的环境保护是养猪行业的重要课题。 猪场废水是高浓度的有机废水。一般可以用物理机械、化学、生物、等方法 处理，实践证明，单靠某一技术或者环节往往很难解决废水处理问题，设置多个 环节并用的几种技术形成处理系统方是解决水处理问题的上策。传统的脱氮方法 有物理法，包括：增氧、换水、吸附过滤等；化学法，包括：加过氧化钙、偶合 剂等；生物化学法，包括：好氧生化、厌氧生化及兼氧生化、生物脱磷脱氮等。 由于物化法的成本较高，而且容易造成二次污染，因此推广受到限制。生物脱氮 工艺以其操作简单、投资少、成本低、不易造成环境二次污染，除氮效果也比较 好等方面的优点，被公认为具有发展前途的方法。猪场污水的特点就决定了它对 水环境的影响是怎样的。直接排的污水主要指标c o d 超过排放标准十几倍到几 十倍，污水的主要去向是渗入地下，污染地表水和地下水，间接影响到人的饮水 安全问题，而且对周围环境影响很大。由于富含n 、p ，直接排放到江、河、海 中，引起水的富营养化。一些致病菌也对人的健康构成威胁。水资源的相对匮乏 已成为制约我国经济发展的颈瓶。废水的处理和水资源再生利用是保护水资源， 缓解水资源供需不平衡的有效途径。目前在国内外水处理中被广泛应用。近年来， 国外生物脱氮技术主要集中在发展生物脱氮技术的新工艺和新概念，筛选培育高 效特殊的菌株和菌落等。 7 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 1 1 3 微生物在环境治理中的应用 在环境治理中，利用微生物作用的生化法因其投资少、处理效率高、运行成 本低、二次污染少等优点而得到越来越广泛的应用。首先在大气污染治理中的应 用。微生物用于烟气脱硫，不需要高温、高压、催化剂，设备要求简单。利用自 养生物脱硫，营养要求低，无二次污染，处理费用为湿法脱硫的5 0 。很多学 者利用细菌研究了大量的脱硫技术( 郑土民，唐国强，吴志红，1 9 9 3 ) 。生物过 滤法在5 0 年代中期最先应用于处理空气中低浓度的臭味物质。到8 0 年代，德、 美、荷兰等国相继用次法控制生产过程中的挥发性气体和有毒气体。生物过滤法 还可以去除空气中的异味、挥发性物质( v o c s ) 和有害物质，包括控制( 去除) 城市污水处理设施中的臭味、化工过程中的生产废弃、受污染土壤和地下水中的 挥发性物质、室内空气中低浓度物质等。微生物还可以用来固定c 0 2 ，实现c 0 2 的资源化，同时产生很多附加值高的产品( 周集体，王竞，扬凤林，1 9 9 7 ) 。生 物技术用于有机废气具有费用低、效率高等优点，在德国、荷兰、日本及北美国 家都得到广泛应用( 陈建孟，1 9 9 8 ) ； 其次，在水污染治理中的应用。( 1 ) 在废水中的脱氮除磷，废水中的氮、磷 是造成水体富营养化的根源，利用生物脱氮除磷已进行了广泛的研究( 龚云华， 2 0 0 0 ) 。污水脱氮技术主要有活性污泥法脱氮工艺、生物膜脱氮( 生物滤池、生 物转盘、生物流化床、浸没式、三级生物滤池脱氮系统) 等。( 2 ) 废水中有机物 质的降解，酚类对水中生物有致畸性，使生物具有难闻的酚味，化学处理法由于 二次污染问题受到限制，而利用培养优势菌群的微生物法降解酚类却有显著作 用。如卞华松采用p v a l 7 9 9 冷冻改良法固定优势菌群，对浓度为5 6 5 m g l 的苯 酚去除率为9 4 以上( 卞华松，张仲燕，1 9 9 8 ) ；张春桂研究降解五氯酚( p c p ) 的细菌是醋酸细菌、产碱菌和气单胞菌。此外，可用家禽废物分解的网纹水蚤属 ( c e f i o d a p h n i ad u b i a ) l d 5 0 和弧菌( v i b r i o f i s c h e r i ) e c s o ( g g u p t ae ta l ，19 9 8 ) 、链霉 菌3 0 3 、芽胞杆菌k m r - 1 、麦芽糖假丝酵母1 0 4 等对酚类进行降解。有机物的 生物降解中，值得一提的是白腐菌。白腐菌是一类提子真菌，在废水治理中，其 降解污染物的范围十分广泛。对多环芳烃、酚类、氯代酚类、烷基苯类和硝基苯 类化合物有着显著的降解作用。( 3 ) 废水中重金属的去除，由于藻类对重金属离 子具有较强的富集能力，利用其生物吸附作用可从工业污水中去除有毒、放射性 金属和回收稀有、贵重金属( 廖敏，谢正苗，王锐，1 9 9 7 ) 。该法具有高效、经 济、简便、选择性好等优点，尤其适合低浓度及一般方法不易去除的金属。( 4 ) 废水中其他物质的去除，染料废水是难以降解的一大类工业废水，在厌氧微生物 环境中，偶氮染料可通过还原作用完全生物降解( e r a z o f l o r e se ta l ，1 9 9 7 ) 。 将优势菌的不完全厌氧接触氧化工艺用于处理印染工业废水，脱色率达9 0 以 8 猪场污水中脱氮微生物的分离与鉴定的研究 上( 张波，1 9 9 9 ) 。用专性厌氧菌硫酸盐还原菌混合培养物对偶氮染料、三苯甲 烷染料、葸醌染料的废水进行脱色，脱色率在1 小时之内可达6 9 9 - 9 8 8 ( 贾省 芬，杨惠芬，刘双江，1 9 9 8 ) 。微生物处理电镀废水，对各种金属离子的一次净 化率达8 9 9 以上( 吴乾箐，李昕，李福，1 9 9 7 ) 。蔗渣浆，用白腐菌处理含氯 漂剂漂白的废水，脱色率可达9 1 2 ，b o d 5 去除率为9 2 5 ，c o d e r 去除率为 8 8 7 。屠宰废水、橄榄加工厂废水、啤酒废水等用微生物处理均可取得较好的 效果( 曾丽璇，罗国维，1 9 9 9 ) 。最后，微生物在环境中其他污染物的处理，微生 物不仅用于大气、水、土壤中农药和垃圾的处理，还用作检测有毒化学品的指标 生物。此外，还可做成微生物絮凝剂，净化污水。微生物絮凝剂是利用生物技术， 通过微生物发酵、抽提、精制而成的一种具有生物分解性和安全性的新型、高效、 无毒的廉价的水处理剂( k u r a n er e ta l ，1 9 8 6 ) 。它们对大肠杆菌、酵母、泥浆水、 粉煤灰水、活性炭粉水、膨胀污泥、纸浆废水、颜料废水等有较好的絮凝和脱色 效果。 1 1 4 传统生物脱氮的原理 传统生物脱氮途径一般包括硝化和反硝化两个阶段，分别由硝化菌和反硝化 菌完成。硝化反应是由一类化能自养好氧的硝化细菌完成( 张艳，2 0 0 4 ) 。早在 1 8 7 7 年，施来兴等人就通过实验证明了这一生物学过程的存在。1 8 9 0 年维诺格拉 斯基利用含氨态氮的无机硅胶培养基首次对硝化细菌进行了研究，证明了硝化作 用包括两个连续而又分别独立的阶段。它包括两个步骤：第一步称为亚硝化过程， 由亚硝酸菌( 氨氧化菌或亚硝化菌) 将氨态氮转化为亚硝酸盐；第二步称为硝化过 程，由硝酸菌( 亚硝酸盐氧化菌或硝化菌) 将亚硝酸盐进一步氧化为硝酸盐。 反硝化细菌是由一群化能有机异养型微生物在厌氧或缺氧的条件下完成 的，它的主要作用是将硝酸盐或亚硝酸盐还原成气态氮( n o 、n 2 0 、n 2 ) 。反硝化 茵在自然界很普遍，多数是兼氧菌，在无分子态氧存在的环境下，利用硝酸盐作 为电子受体，有机物作为碳源和电子供体提供能量并被转化为c 0 2 ，h 2 0 ( 薛艳， 黄勇，潘杨，2 0 0 6 ) 。硝化和反硝化反应的进行是受到一定制约的，一方面，自 养硝化菌在大量有机物的存在下，对氧气和营养物的竞争不如好氧异氧菌，从而 导致异氧菌占优势；另一方面，反硝化需要提供适当的电子供体，通常为有机物， 由于两菌对环境条件的要求不同，两种反应不能同时进行，器的不同组合，即将 好氧区和缺氧区分开的分只能序列式进行，即硝化反应在好氧条件下，反硝化在 厌氧或缺氧条件下，从而导致了生物脱氮反应级硝化和反硝化工艺，或在两个分 离的反应器中进行，或在时间上造成交替好氧和缺氧环境的同一个反应器中进行 硝化与反硝化。反硝化菌一般为兼性细菌，在有氧条件下以氧气为电子受体，缺 氧条件下以硝酸根为电子受体，所以必须在缺氧环境下进行反硝化反映。般认 9 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 为在好氧条件下，硝酸或亚硝酸还原酶不能表达或氧分子会对这些酶产生抑制。 如当溶解氧分别大于4 0 5 、2 1 5 、0 2 5 m g l 时p s e u d o m o n a sn a u t i c a l 的硝酸盐还 原酶、亚硝酸还原酶、氮氧化物还原酶完全失活。 在传统的硝化反硝化工艺中，氨态氮先被氧化成硝态氮，再被还原成氮气， 就生物脱氮而言，硝化过程中的亚硝态氮到硝态氮的转化与反硝化过程中的硝态 氮到亚硝态氮的转化是一段多走的路，将其省去同样能实现废水脱氮。硝化作用 是一个序列反应，先由亚硝酸盐细菌把氨氧化成亚硝酸盐，再由硝酸细菌把亚硝 酸盐氧化成硝酸盐。迄今为止，还没有发现一种细菌能够单独把氨氧化成硝酸盐。 硝化细菌的这种基质专一性是研究和开发短程硝化工艺的基础。从进化谱上，看 亚硝酸细菌与硝酸细菌之间的亲缘关系并不密切，在各种生境中，彼此为邻，并 无进化谱上的必然性，完全可以独立生活短程硝化即是通过控制在亚硝酸盐阶 段，然后进行反硝化( 张军，姜伟，2 0 0 4 ) 。所以关键是控制氨态氮的氧化在亚硝 酸盐阶段，阻止亚硝态氮的氧化，从而实现短程硝化。 异养硝化以有机物作为能源，在缺氧的条件下，氧化氨态氮为亚硝态氮， 并同时进行反硝化( 温东辉，唐孝炎，2 0 0 3 ) 。r o b e r t o n 等人认为，微生物并没 有从氧化氨态氮为亚硝态氮的反应中获得能量，只是它的氧化产物亚硝态氮作为 反硝化的电子受体，可能解除了反应过程中氧对电子的竞争( r o b e r t s o nl a ， k u e n e nj c t ，1 9 8 3 ) 。e d r b r i e r l e y 等以1 3 一丙氨酸作为唯一的碳源，从酸性土 壤中筛选出了不同的细菌和真菌可以通过异养途径进行反硝化。a b c u p t a 认为 t h i o s p h a e r ap a n t o t r o p h a ( 现在的p a r a c o c c u sp a n t o t r o p h a ) 是一种能氧化硫化 物的细菌，具有同时异养硝化和好氧反硝化的能力。此外还有，恶臭假单胞菌 ( p s e u d o m o n a sp u t i d a ) 、脱氮副球菌( p a r a c o c c u sd e n i t r i f i a n s ) 、粪产碱杆菌( a l c a l i g e n e sf a e c a l i s ) 。 许多研究表明，氨氧化细菌可以进行反硝化作用。n wr a g e 等报道： n i t r o s o m o n a ss p p 经过3 年的驯化可以还原n 0 2 。1 9 9 7 年，报道了自养微生物在 好氧情况下的反硝化，称之为好氧反氨化或好氧脱氮；硝化细菌除了能够进行正 常的硝化作用外，还能进行反硝化作用，例如；在n e u r o p a e a 和n e u t r o p h a 的纯 培养中，它们都能利用羟胺、氢气和有机物质( 乙酸盐或丙酮酸盐) 作为电子供体， 把亚硝酸盐还原成氮气( l l o y dj m a ，l i e h rs k a ，c l a s s e nj j a ，r o b a r g ew ，2 0 0 0 ) 。 一些反硝化细菌除了在无氧条件下进行正常的反硝化作用外，还能在有氧条件下 进行反硝化作用，例如p a r a c o c c u sp a n t o t r o p h a 能进行好氧反硝化，直接把氨转化 为氮气。还有一些细菌彼此合作，进行序列反应，把氨转化为氮气，例如 n e u r o p a e a 把氨氧化为亚硝酸盐，接着b r o c a d i a a n a m m o x i d a n s 把氨和亚硝酸盐转 化为氮气。 1 0 猪场污水中脱氮微生物的分离与鉴定的研究 反硝化一般为异养厌氧代谢，需要有机碳源，而自养反硝化菌是以还原性的 无机物( 硫化物、h e ) 作为电子供体，以氧化态氮为电子受体进行的反硝化过程( 吕 锡武，李锋，稻森悠平，2 0 0 0 ) 。a k o e n i g 和l h l i u 对t h i o b a c i l l u sd e n i t r i f i a n s 的自养反硝化过程的研究表明：氧化单质硫为s 0 4 2 。的同时，还原n 0 3 生成n 2 ， 并产生菌体代谢所需的有机物，因此利用自养反硝化可以免除或减少有机碳源的 投加，降低污水的处理成本。 厌氧氨氧化( a n a m m o x ) 是指在厌氧条件下，微生物直接以氨态氮为电子供 体，以亚硝态氮为电子受体，将氨态氮、亚硝态氮转变为氮气的生物氧化过程。 早在1 9 7 7 年，b r o d a 就预言了一种化能自养菌具有以n 0 2 为电子受体，把氨态 氮氧化为氮气的潜在能力，称之为反硝化氨氧化菌。1 9 9 4 年，k u e n e n 等发现了 某些细菌能利用n 0 3 或n 0 2 作为电子受体，将n h 4 + 氧化为n 2 或气态氮化物 ( m o b a r r yb k ，w a g n e rm u r b a i nv ，r i t t m a n nb e ，s t a h ld a ，19 9 6 ) 。19 9 5 年，m u l d e r 在脱氮流化床反应器中，发现了厌氧氨氧化现象，从而证实了的预言。之后， v a n d egr a a f 进一步证实了厌氧氨氧化是一个微生物学反应，反应终产物是氮气。 j e r e n 对a n a m m o x 的进一步研究表明：在缺氧或厌氧的条件下，氨氧化可以 利用n h 4 + 或n h 2 0 h 作为电子供体，将n 0 2 。或n 0 3 。还原，n h 2 0 h 、n